摘要
对抗生素的耐药性日益普遍链球菌引起的肺炎作为社区获得性细菌性肺炎的主要病原体,有必要开发新的治疗策略和非侵入性方法来评估其疗效。
在急性肺炎小鼠模型中,评估了被动免疫治疗的疗效,使用人静脉注射免疫球蛋白(IVIG)或单独溶剂,鼻内或静脉给药。使用经典但有创的方法评估肺细菌负荷,使用体积描记术评估呼吸功能(分钟通气、呼吸频率和潮气量),体积描记术是一种简单的无创方法,常用于吸入毒理学,但以前未用于评估呼吸道感染。
感染激发48小时后,IVIG治疗小鼠的肺部细菌负荷明显低于未治疗小鼠。同时,分钟通气量显著低于未治疗小鼠的参考值(36±3)与57±8毫升·分钟−1, p<0.01, 31±2与50±5毫升·分钟−1(p<0.01),但两种给药方式对小鼠均无明显影响。
因此容积描记术似乎是一种简单可靠的检测急性呼吸道感染的方法。
链球菌引起的肺炎仍然是细菌性肺炎的主要原因1.疾病的严重程度取决于菌株的毒力表型和宿主的免疫状态。免疫缺陷宿主,如人类免疫缺陷病毒患者、通气患者、早产儿和老年人,特别容易感染侵袭性肺炎球菌肺炎2- - - - - -4.对一种或几种抗生素耐药的菌株日益流行,这就需要开发新的治疗策略肺炎链球菌5,6.免疫疗法是一种可能的替代或辅助治疗策略肺炎链球菌肺炎7,8.在侵袭性肺炎的小鼠模型中,试图评价人血浆来源的静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的治疗效果,无论是静脉或鼻内给予。IVIG的治疗效果是通过存活实验和感染后4h至72h肺部细菌负荷的动力学来评估的。假设在8-10天内死亡的重症肺炎小鼠中,通过测量呼吸变量,如分钟通气、呼吸频率和潮气量,可以检测到呼吸功能的严重损害。与死鼠组织样本中的细菌计数不同,这种调查方法是非侵入性的,可以在同一动物中重复多次。本研究采用一种基于容积描记术的呼吸模式综合监测系统,连续5天每天评估意识感染小鼠的呼吸功能肺炎链球菌静脉或鼻内注射或不注射IVIG。记录的值与细菌计数和组织学检查结果进行比较。
材料和方法
老鼠
6周龄雌性BALB/c小鼠,感染时体重18-20 g,取自查尔斯河(Saint Aubin-lès-Elbeuf,法国)。动物实验的规程是由该机构的动物护理和使用委员会批准的。
综合呼吸模式监测系统
小鼠被放置在改良的巴特尔管系统中,这样就可以监测8只受到限制的动物的流动呼吸模式。校准的气速记录仪(Fleisch no。每个体积描记器的顶部都附有一个压差传感器(DP-45, Validyne, Northridge, CA, USA)。每个动物的压差传感器的信号被Gould Carrier放大器放大(型号13-4615-35,Gould Electronique, Ballainvilliers,法国)。在Dell Optiplex计算机(Dell computer Corporation, CA, USA)上使用模拟-数字转换器对其进行数字化,该计算机配有一个采样率为250hz的输入/输出AS2卡。采用HEM 2.1软件(Notocord, Croissy sur Seine, France)显示呼吸流量,计算呼吸分通气量、潮气量和呼吸频率。数据文件导入到工作表(Excel 5.0, Microsoft corporation, CA, USA)中,使用宏,自动处理所有变量在指定时间内的平均值±sd。通过手工从轨迹中提取数据,并与计算机输出的每一种模式进行比较,验证了该程序的工作正常。差异小于5%。
细菌
肺炎链球菌4241株3型血清由J.J. Pocidalo(法国巴黎Bichat医院)提供。在−80℃下,在密歇根州底特律Difco实验室的脑心灌注(BHI)肉汤中与30%甘油保存。细菌在37°C的BHI中过夜培养。将100µL的过夜培养物在10 mL BHI中37℃下培养6 h,获得指数生长期的传代。根据需要将该细菌接种物用磷酸盐缓冲盐水(PBS) pH 7.4稀释,以650 nm光密度为基础。菌落形成单位(cfu)的计数方法是将每10个稀释量中有1个的100µL等份放在添加了5%马血的胰蛋白酶大豆琼脂上(Biomérieux, Marcy L’etoile,法国)。
感染挑战与治疗
小鼠通过腹腔注射50%葡萄糖进行麻醉 mg·kg−1戊巴比妥钠,经鼻感染50例 µL含5%的细菌悬浮液 日志10cfu。四组共8只小鼠感染;1组于感染前24 h鼻内注射IVIG, 1组于感染后3 h静脉注射IVIG, 2组分别给予PBS(鼻内、静脉注射)。在感染前一天进行呼吸变量的参考测量。从感染后第1至第5天每天评估呼吸功能。经过10分钟的适应期后,所有测量均在20分钟以上进行。感染后5天,存活的小鼠被处死进行组织学研究。另外四组小鼠在感染攻毒后1小时测定肺细菌负荷,以评估初始负荷以及感染攻毒后48和72小时。
静脉注射免疫球蛋白被动免疫治疗
人IVIG (Tégé1ine®,批号50060432)购自Laboratoire Français du fractions ement et des Biotechnologies (Les Ulis,法国)。IVIG由97%的免疫球蛋白(Ig)-G组成,其中58.8%为IgG1, 34.1%的免疫球蛋白2, 5.4%的免疫球蛋白3., 1.7%的免疫球蛋白4,按照制造商的说明在无菌水中重新组合,并储存在−80°C,50%浓度的IVIG mg·mL−1在给小鼠前立即用PBS稀释。
组织学研究
腹腔注射小鼠300 mg·kg−1一根连接固定剂容器的导管插入气管通过颈部腹部的切口。同时切断腹主动脉放血。胸腔被打开,肺部立即充气原位通过在25 cmH的压力下用4%甲醛卡可酯缓冲液(pH 7.2)处理气管插管2然后取出肺,浸泡在甲醛(4%)中8天。从每个肺中取矢状面切片,并收集气管下三分之一的三个样本。这些样品进一步进行石蜡包埋处理。切片5µm,苏木精、伊红染色。用光学显微镜检查组织切片,用光学显微镜系统拍照。
细菌负荷测定
无菌解剖肺(气管和主支气管被丢弃),使用玻璃管中的特氟隆捣棒在1ml PBS中均质。肺匀浆的细菌负荷由cfu计数测定。
计算与统计分析
数据用平均值±sem表示。结果采用单因素方差分析(ANOVA)和Fisher检验,p-value <0.05为显著性。
结果
四组小鼠感染性攻毒前24小时的分钟通气数据(64±6和58±5 mL·min)无显著差异−1对经鼻和静脉注射IVIG的小鼠分别为57±8和50±5 mL·min−1(分别通过鼻内和静脉注射PBS))。感染后1小时测量的肺细菌负荷在四组小鼠之间没有显著差异。在感染激发后24小时,在任何组中均未观察到微小通气的显著减少。感染后48小时,ivg处理小鼠的肺细菌负荷明显低于未处理小鼠(2.26±0.26)与5.72±0.11日志10cfu, p<0.01, 3.19±0.19与4.8±0.28日志10cfu,经鼻给药和静脉给药后p<0.01;图1⇓).48 h后,分钟通气显著低于对照组(36±3)与57±8毫升·分钟−1, p<0.01, 31±2与50±5毫升·分钟−1, p<0.01,分别在鼻内和静脉给药的PBS中),但在两种IVIG给药途径的小鼠中没有(图1)⇓).在未经治疗的小鼠中观察到的分钟通气量减少主要是由于潮气量减少,呼吸频率无明显变化(图。 2和3⇓⇓).感染后4天,未经处理的小鼠开始死亡,第二天,两组未经处理的小鼠中,每组只有3只存活(38%),而两组经ivigg处理的小鼠中,所有8只存活(100%)。感染激发后5 d,分钟通气量分别为10±2和6±2 mL·min−1在两组未处理的存活小鼠中(分别通过鼻内和静脉注射PBS)。与此同时,经IVIG鼻内处理的小鼠的分钟通气显著低于参考指标(42±2)与64±6毫升·分钟−1,p<0.05),而静脉注射IVIG(52±3)的小鼠没有观察到显著的下降与58±5毫升·分钟−1不重要的)。幸存小鼠的肺部形态学检查显示炎性细胞聚集、间质水肿和肺泡结构改变(图4)⇓).经鼻内注射IVIG的小鼠观察到中度间质水肿。
感染激发后1,48和72小时的肺细菌负荷(直方图,每个条形代表四项测量的平均值)和感染激发前24小时、48和72小时后的分钟通气(曲线,(a)鼻内或b)静脉注射免疫球蛋白(IVIG)(•,
)或磷酸盐缓冲盐水(〇,□)。感染后48小时,两种给药方式下,ivigg处理小鼠和PBS未处理小鼠的肺细菌负荷有显著差异(*:p<0.01)。同时,在未处理的小鼠中观察到相对于初始值的分钟通气显著减少(+: p<0.01),而ivigg组与对照组无显著性差异。
![图2. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/1/94/F2.medium.gif)
未处理小鼠的通气痕迹的例子a)感染前24小时和b)感染后48小时。微小通气的减少似乎是由于潮气量的减少。
![图3. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/1/94/F3.medium.gif)
潮汐卷(
)和呼吸频率(□),以感染攻毒前24小时测量的初始值的百分比表示。每条代表8次测量的平均值±sem。*: p < 0.05与初始值。
苏木精和伊红染色的肺切片光镜图;一)未经处理的小鼠;b)经鼻静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的小鼠和c)经静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的小鼠,感染后5天。在未处理的小鼠中观察到炎症细胞聚集、实质间质水肿和肺泡结构改变(大箭头),而在鼻内注射IVIG的小鼠中观察到轻度间质水肿(小箭头);静脉注射IVIG的小鼠未见损伤。(原放大×40)。
讨论
本研究表明容积描记术是一种简单、灵敏的监测手段肺炎链球菌目的探讨被动免疫治疗对小鼠肺炎过程的影响。
方法经典地用于评估新疗法的疗效,面对肺炎感染对抗生素耐药性的增加9,是基于评估存活率、体重和临床观察呼吸功能障碍,如呼吸困难,在动物模型10,11.可用的非侵入性诊断方法在动物模型上比在人类模型上更有限,在人类模型中可以使用x线片评估或血气测量12.对动物模型更敏感和更具体的方法,如感染组织的细菌计数,是非常有侵入性的,需要牺牲动物10.因此,需要许多动物评估几天内感染的进展情况,以便提供有统计学意义的数据。为了减少所需动物的数量,必须找到替代方法来评估治疗效果。
监测肺炎对呼吸功能的影响是评价治疗的一种潜在手段。因此氧气吸收,通过V′O2,马克斯,已被用作心肺功能损害的定量指标13.该方法是在感染模型中提出的肺炎链球菌并被发现是非侵入性的,可复制的和非常敏感13.V′O2,马克斯发现在感染第2天时,感染率显著下降,大约与动物开始死亡的时间相同。V′O2,马克斯测量以气体交换为基础,是对心肺功能的综合评价。的减少V′O2,马克斯与切除组织的耗氧量和离体肺的顺应性相关。这表明,除了监测耗氧量外,还有其他可能的间接方法来随访感染,耗氧量是基于肺功能的机械变量对心肺功能的总体评估。
新切除的肺的扩张能力也在感染了支原体pulmonis14.感染的肺更难以充气,主要是由于表面力的增加,表明肺表面活性剂的破坏。通气障碍也被认为是病毒性肺炎低氧血症的原因15.鉴于这些以前的研究,在我们的肺炎模型中,这种在8-10天内就会死亡的肺炎,似乎几乎肯定会有实质性的、可检测到的肺功能障碍。由于需要无创检测,容积描记术测量微通气、潮气量和呼吸频率似乎是评估肺炎对呼吸功能影响的一种潜在方法。这种无创方法可重复性好,可反复用于单个动物肺炎的随访。这是一种非常简单的方法,适用于意识清醒的动物,避免了麻醉对呼吸的影响16. 据作者所知,这种吸入毒理学中常用的方法以前从未用于评估感染动物模型的肺功能。目前的研究表明,在感染但未经治疗的小鼠中,在感染过程的早期,分钟通气量减少。在第2天检测到>3%的下降,而在治疗小鼠中,无论是哪种抗体给药途径,在此阶段均未观察到分钟通气量的显著下降。在本模型中,在感染性激发后2天,观察到治疗小鼠的肺部细菌负荷显著减少。因此,通过容积描记术测量分钟通气量似乎与测定肺细菌负荷一样敏感,肺细菌负荷是已知用于测试治疗效果的最敏感方法之一。第2天观察到未治疗小鼠的分钟通气量减少是由于潮气量减少,呼吸频率没有明显变化。因此,很容易在小鼠身上测量的呼吸频率不能被推荐用于监测感染。限制性综合征引起的潮气量减少与在其他呼吸道感染模型中观察到的顺应性降低一致14.在未处理的小鼠中,随着感染的进展,微小通气逐渐减少,但动物直到第4天才开始死亡。这表明生存不是监测感染的可靠方法。
组织学检查是诊断肺炎的金标准12在未经处理的老鼠身上显示出典型的病变,与在人类疾病中发现的病变相似13.在静脉注射IVIG的小鼠中,直到感染后第5天,minute ventilation没有观察到明显的减少(即。也就是他们被献祭的日子)。在第5天,经IVIG鼻内处理的小鼠中检测到显著但不致命的微小通气减少(图1)⇑).这表明鼻内给药不如静脉给药有效。这可能是由于如果经鼻给药,IVIG在肺中的分布不均匀,且其在肺中的持续时间短于血液(肺中46-50小时,血中>7天)(未发表的数据)。轻度肺功能障碍与本组小鼠部分肺间质轻度水肿相一致。然而,虽然在严重感染中微小通气的数量大幅减少,但对于亚临床感染可能需要一种更敏感的方法(即。,与生存相适应的)。类似地,这种方法被用于肺炎发展的模型中,在研究已确定的肺炎治疗效果时,不能假设结果是相同的。
总之,有几种非侵入性诊断方法可用于人类肺炎,它们至少与评估肺功能的机械特性一样敏感17- - - - - -19.然而,在肺炎的动物模型中没有这种方法可用,体积描记法可以常规用于筛查潜在的肺炎过程新治疗方法的疗效。这种疗效可以通过更具体但具有高度侵入性的程序来证实,如肺细菌负荷。
致谢
作者要感谢P. Desforges, S. Morio和J-P。Auffret寻求技术援助。
- 收到了2000年3月8日。
- 接受2000年9月16日。
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