摘要
研究了P53异常和BCL-2蛋白表达与临床数据和预后的102例切除的非小细胞肺癌(NSCLC)中的临床数据和预后。
对p53基因外显子5-8进行脱氧核糖核酸分析,发现47%的切除NSCLC中p53基因突变(p53- m), 25%的NSCLC中检测到血清p53抗体(p53- abs), 54%的NSCLC中检测到p53蛋白过表达(p53- pe), 48%的NSCLC中检测到bcl-2蛋白过表达(bcl-2- pe)。p53- pe、血清p53- abs与p53基因改变之间的相关性具有统计学意义。p53-M、p53-Abs、bcl-2-PE检测结果与临床病理参数无显著相关性。在p53-PE检测中,腺癌的阳性结果明显少于鳞状细胞癌和大细胞癌。
生存分析显示p53异常和bcl-2的阴性染色,单独分析时,与较差的总生存有关。在多变量分析中,只有p53-M检验的阳性结果仍然是一个独立的、具有统计学意义的不利预后因素。当去除p53突变检测时,p53- pe和p53- abs检测的阳性结果具有统计学意义,是不利的预后因素。
总之,在p53和bcl-2异常中,只有p53基因突变似乎对预后有强烈的独立影响。当脱氧核糖核酸序列信息不可用时,血清中p53蛋白表达和p53抗体的存在可用于获得重要的预后信息。
本研究得到了波兰科学计划(KBN No. 4 P05C 079 15和KBN No. 4PO5B 048 19)的支持。
尽管在过去二十年中癌症治疗取得了重大进展,但肺癌患者的预后改善程度微乎其微。虽然原发肿瘤、区域淋巴结、转移(TNM)分期是最重要的预后因素,但分期组内生存率的变化需要关于影响预后的其他因素的信息,独立于分期1- - - - - -3..
分子生物学的进展为癌症的发病机制提供了线索,并显示了癌基因激活和肿瘤抑制基因失活的参与。最近的证据表明,凋亡的遗传调控在肿瘤发生过程中也至关重要,癌基因和肿瘤抑制基因可以调节凋亡率,或细胞凋亡的易感性4,5.在几种与肺癌有关的基因畸变中,p53基因突变是最常见的6- - - - - -8.p53基因的突变通常导致稳定状态p53水平的增加,这可能通过反式显性机制在癌变中发挥作用,可能涉及突变型和野生型蛋白之间的齐聚。虽然p53突变(p53- m)在肺癌发病机制中的重要性已经清楚,但尚不清楚p53- m的存在或缺失或p53蛋白的过表达是否会对个体患者的生存机会产生不利影响。近年来的研究表明,肺癌患者血清中出现p53抗体,可能与肿瘤细胞中p53突变蛋白的积累有关9.尽管大多数患者血清p53抗体(p53抗体)p53-M或p53蛋白过度表达,反之则不然,只有30%的p53改变患者对p53产生体液反应。通过对bcl-2原癌基因的研究,深入了解了癌变过程中凋亡细胞死亡解除调控的重要性。也有人认为异常表达bcl-2蛋白的表达可能与多种肿瘤的临床行为有关10. 在肺癌中,bcl-2蛋白表达(bcl-2-PE)可能是侵袭性较低的特征,并可能导致良好的预后11,12.
本研究同时评估了p53基因突变、p53蛋白表达、p53-Abs和bcl-2-PE,其结果与手术治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的临床病理特征和预后相关。
材料和方法
患者特征
这项研究包括102名非小细胞肺癌患者,由胸部肿瘤学小组检查,并在Bialystok医学院的胸部外科进行手术。所有患者均行手术切除。
术前分期程序包括体格和血液检查、胸片和x线片、支气管镜检查、胸部计算机断层扫描(CT)和肝脏超声扫描。必要时行骨放射性同位素扫描、骨髓抽吸物检查、腹部及脑CT检查。选定患者行纵隔镜检查。术中均匀行根治性淋巴结清扫。在所有级别分别确定和提交节点。病理材料已特别审查为本研究由同一病理学家。术后结合手术和组织学结果进行病理分期pTNM13.
P53状态
p53基因突变
如前所述,从福尔马林固定石蜡包埋的组织中提取脱氧核糖核酸(DNA)14. 通过聚合酶链反应(PCR)扩增p53基因的第5、6、7和8外显子。反应混合物含有十分之一的DNA提取物作为模板,10 mM-Tris(pH值8.3),50 毫米KCl,0.125 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),1.5 mMgCl2在50 μL的体积中,对每个引物检测0.15 ~ 0.2 μM,对Taq聚合酶检测1.25 U。
对于测序,20 用Microcon 50(美国马萨诸塞州贝弗利市Amicon公司)通过大小过滤纯化μL PCR产物。DNA测序采用双脱氧终止法(α)-35s)脱氧腺苷三磷酸(DATP)使用剪切DNA测序试剂盒(新英格兰Biolab,Beverly,Ma,USA)。然后用6%的聚丙烯酰胺/ 8M尿素凝胶溶解序列,进行放射显影3-5天的X线膜暴露。
p53蛋白表达
用免疫组化方法检测五微米厚切片的p53蛋白。为了加强染色,切片在微波炉中预处理(900W,两个周期,1×1 min和1×7 min),然后用小鼠抗人p53单克隆抗体(DO-7;丹麦达科)1:100稀释。采用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶染色技术(Dako LSAB + Kit,过氧化物酶)和3-氨基-9-乙基咔唑对抗原-抗体复合物进行可视化;(原子能委员会;Sigma, St Louis, MO, USA)为显色原。然后用梅耶氏苏木精对切片进行反染色。p53蛋白高表达的肺癌作为阳性对照;对于阳性的外部对照,使用了已知表达p53的食管癌。通过遗漏一抗得到阴性对照。 All slides were reviewed independently by two investigators. p53 expression (nuclear staining) was evaluated by counting 1,000 cells·section−1在5个随机选择的肿瘤高倍视野(400×)中,通过光学显微镜确定阳性细胞的百分比。选择p53免疫染色的阈值为20%。肿瘤细胞阳性率>20%的肿瘤为阳性,p53染色分为两类:阴性(0)和阳性(1)其中0=≤20%和1=>20%。
血清抗p53抗体
在诊断时从患者处获得血清样本,并在−80°C保存至使用。采用固相重组p53蛋白的抗p53自身抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA) (Dianova GmbH, Hamburg, Germany)购自Oncogene Research Products (Cambridge, USA),血清分析按照制造商的建议进行。计算每个血清样本中p53包被孔和对照组蛋白包被孔的平均吸光度。根据厂家推荐的公式计算抗p53指数:(E450(血清样本)-E450(抗p53低对照))/(E450(抗p53高对照)-E450(抗p53低对照))。两个独立测定的>1.2的比值被认为是一个临界临界值15.
Bcl-2蛋白表达
免疫组化检查切片用丙酮固定24 h,石蜡块包埋。5微米厚的切片采用免疫组织化学检测bcl-2蛋白。为了加强染色,切片在微波炉中预处理,然后用小鼠抗人bcl-2单克隆抗体(克隆124;达科)1:100稀释。
采用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶染色技术(Dako LSAB + Kit, Peroxidase)和AEC (Sigma)作为显色原,对抗原-抗体复合物进行可视化。然后用梅耶氏苏木精对切片进行反染色。阳性对照为高bcl-2-PE肺癌;对于阳性的外部对照,已知表达bcl-2的食管癌、喉癌或子宫内膜癌被使用。此外,浸润性淋巴细胞作为肺肿瘤各切片的内部阳性对照。通过遗漏一抗得到阴性对照。所有幻灯片均由两位研究人员独立审查。通过计数1000个细胞·切片来评估Bc1-2表达(胞浆染色或核周染色)−1在5个随机选择的肿瘤高倍视野(400×)中,通过光学显微镜确定阳性细胞的百分比。肿瘤细胞阳性率>20%的肿瘤被列为阳性,bcl-2染色分为两类:阴性(0)和阳性(1),其中0=≤20%和1=>20%。
统计分析
基于列联表的比较采用Pearson卡方检验或Cochran-Armitage趋势检验16.采用logistic回归分析获得p53-M检验阳性结果的概率16.使用可能性比率测试检查包含在模型中的协变量的意义。使用似然比统计和标准化Pearson的残差评估模型的拟合。评估了数据16.
出于分析生存时间的目的,1997年8月31日,被视为随访结束。除了六名患者的生存状态在那一天确认。生存时间由手术日期计算到死亡日期或随访结束时计算。在随访结束时活着的患者被认为是官方观察。六名患者在1997年8月31日之前失去了随访,在其最后一个观察之日被视为审查的观察。
生存曲线采用Kaplan-Meier法估算。在单因素生存时间分析中,采用洛格兰克检验(非分层和分层)和洛格兰克趋势检验17被使用。在多变量分析中,采用Cox比例风险模型。基于模型的比较使用分数测试进行。使用鞅残差以图形方式检查模型的拟合18. 使用时间相关协变量测试和累积危险函数图检查危险函数的比例19.
所有应用的测试都是双面的。使用BMDP PC90(程序4F,1L和2L)和STATA(V.6)软件进行分析。
后果
表1⇓根据肿瘤的性别、组织学类型和TNM分期,介绍了p53异常和bcl-2-PE的分布。对于三个临床因素中的每一个,使用卡方检验在0.01显著性水平上比较每个分子测试的阳性结果比例(针对多重比较进行调整)。只有在p53-PE试验的情况下,发现不同组织学类型的比例之间存在统计显著差异(p=0.002)。腺癌(AdC;28.1%)的阳性结果明显低于鳞状细胞癌(SqCC)或大细胞癌(LCC;分别为66.7%和62.5%)。
为了研究P53-M测试与其他三个测试之间的关联(P53-PE,P53-ABS,BCL-2-PE),使用逻辑回归模型来分析获得P53-的阳性结果的概率M测试。该模型最初包括以下协变量:性别,组织学类型的肿瘤,肿瘤TNM阶段,以及P53-PE,P53-ABS和BCL-2-PE测试的结果。随后,从模型中除去具有0.05水平的系数的重新调节剂。最终模型仅包括P53-PE和P53-ABS测试作为协变量的阳性结果。它表明,彼此独立地,P53-PE和P53-ABS检测的阳性结果显着(P <0.001和P = 0.001)增加了获得P53-M测试的阳性结果的几率。对于P53-PE试验,增加(差距)等于18.50(95%置信区间(CI)(5.71,59.94)),而对于P53-ABS测试,它等于11.87(95%CI(2.90,48.55))。
上述分析表明P53-M试验结果与P53-PE和P53-ABS测试的结果之间的强烈阳性关联。肿瘤的测序凝胶和免疫组织化学染色肿瘤与一致性结果显示在图1中⇓.
![图1. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/4/660/F1.medium.gif)
a) 通过直接测序(a:腺嘌呤;C:胞嘧啶;G:鸟嘌呤;T:胸腺嘧啶)确定的突变p53(外显子5,密码子176,Cys-Phe)基因的核苷酸序列。b)通过免疫组化分析确定鳞状细胞癌IIIa期p53蛋白的过度表达。
生存分析
所有102例患者均纳入总生存期分析。其中两人在手术后一个月内死亡。经过检查,结果并不取决于这两名患者是否被排除或纳入分析。其余100例患者的随访时间为6.9-42.7个月(中位数:28个月)。本组47例患者在观察期间至1997年8月31日死亡,随访6.9-42.5个月(中位数:22.6个月)。53例存活患者中位随访时间为33.4个月。
图2⇓显示与正在考虑的四种分子试验相关的存活曲线。曲线提示,对于p53-M、p53-PE和p53-Abs试验,阳性结果对生存的可能性有不利影响。以bcl-2-PE试验为例,观察到试验结果为阴性的不利影响。
![图2. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/4/660/F2.medium.gif)
生存曲线:a)p53突变(-ve,n=54;+ve,n=48);b) p53蛋白表达(-ve,n=47;+ve,n=55);c) p53抗体(-ve,n=77;+ve,n=25);和d)bcl-2蛋白表达(-ve,n=53;+ve,n=49)试验否定;——:积极乐观的对数秩检验:a、c和d的p<0.001,b的p=0.008。
生存时间的单因素分析采用对数秩检验。肿瘤的性别、组织学类型和TNM分期也包括在内。考虑到多次比较的事实,采用p<0.01显著性水平。TNM分期(趋势p<0.001)、p53-M (p<0.001)、p53-Abs (p<0.001)、bcl-2-PE (p<0.001)检验结果具有统计学意义。p53-PE的结果略有显著性(p=0.008),而性别和组织学类型的结果不显著(p=0.16和0.24)。
由于肿瘤TNM分期的log rank检验具有统计学意义,使用0.01显著水平的分层log rank检验比较p53-M、p53-PE、p53-Abs和bcl-2-PE检验的生存曲线,分层由TNM分期(I、II和IIIA)确定。根据单因素分析的结果,p53-M检验(p<0.001)和p53-Abs检验(p<0.001)的结果具有统计学意义。然而,p53-PE和bcl-2-PE试验的结果几乎不显著(p=0.014和p= 0.02)。因此,对于这两个检验,对TNM阶段效果的调整定性地改变了未分层分析得出的结论。
为了评估考虑中的所有分子检测结果的预后价值,同时调整肿瘤的性别、组织学类型和TNM分期的影响,采用Cox比例风险模型进行多变量分析。表2中给出了与数据拟合的模型⇓.根据之前获得的结果15对于不同组织学类型的肿瘤,采用p53-Abs试验阳性结果的单独效应。
按性别、组织学类型和原发肿瘤、区域淋巴结、转移(TNM)分期划分的p53突变(p53-M)、p53蛋白表达(p53-PE)、抗p53抗体(p53-Abs)和bcl-2蛋白表达(bcl-2-PE)检测阳性结果的比例。
对比例风险模型中至少一个协变量的非零效应假设的评分检验(表2)⇑)在0.05级的意义上具有统计学意义(P <0.001)。还采用了对协变量系数的重要性评估这一级别。结果表2所示⇑结果表明,在校正性别、肿瘤组织学类型和TNM分期的影响后,p53-PE、p53-Abs和bcl-2-PE检测结果的影响在0.05水平上无统计学意义(p分别为0.47、0.25和0.19)。只有p53-M试验的阳性结果仍然是一个独立的、显著的(p=0.03)不利于生存的预后因素。与检测阳性结果相关的相对风险估计为2.74,95% CI为(1.08,6.97)。
在表2所示的模型中,p53-PE和p53-Abs试验的效果不显著⇑可以用这两个测试和之前提到的p53-M测试之间的强烈联系来解释。当将p53-M检验从表2的模型中移除时,进行了检验⇑p53-PE试验和p53-Abs试验的阳性结果变得显著(分别为p=0.004和p=0.03),这是不利的预后因素。
讨论
在这项研究中,我们分析了102例非小细胞肺癌中p53在DNA、蛋白质和针对p53水平和bcl-2-PE的免疫应答方面的异常。
在47%的分析病例中发现p53-M,大部分碱基替换在外显子5(42%)和G残基(48%),这与其他研究者报道的数据没有太大区别20.,21.p53过表达和p53- abs分别在54%和25%的病例中检测到。在p53蛋白过表达、p53- abs和外显子5-8中p53基因改变之间发现了一个强大的、统计上显著的关联。对于p53过表达,这与之前的报道一致22,23.这一发现提供了进一步的证据,表明异常p53基因的存在导致了高度稳定的蛋白质的积累。p53无义突变在免疫组化染色中呈阴性。然而,也有p53阳性但未发现突变的NSCLC肿瘤。这些分子和免疫组织化学结果之间的差异可能是由于外显子5 - 8外p53基因的突变,在p53启动子区域,或过度的p53不仅造成p53-Ms还由其他因素与p53蛋白结合,从而增加其半衰期24.如前所述,p53基因突变与血清中存在的抗p53抗体之间存在统计学上显著的正相关。既往研究也提示p53自身抗体阳性与p53- m或p53在原发肿瘤中的异常积累有关25,26.
p53异常与NSCLC临床病理参数的关系研究较少。在本研究中,从所有可能的p53和bcl-2异常的研究中,只有在p53蛋白过表达的情况下,不同组织学类型的阳性结果所占比例存在统计学差异。AdC的阳性结果明显少于SqCC或LCC。
最近的研究表明,除了传统的致癌基因外,其他编码防止凋亡细胞死亡的蛋白质的基因也可能在癌变中发挥关键作用27本研究考虑了非小细胞肺癌中bcl-2的表达及其与p53改变的关系。虽然目前对实体瘤中bcl-2过度表达的机制尚不清楚,但一些研究表明,测定bcl-2-PE在肺癌中的临床价值。本研究发现,免疫组化mical bcl-2表达与任何临床病理参数无关。在实体瘤中,bcl-2表达与p53积聚之间的关系存在差异28,29.北川et al。30和Fontaniniet al。12在NSCLC中,过表达bcl-2与p53蛋白的积累呈负相关。然而,弗莱明最近的数据et al。31显示bcl-2与p53免疫染色或p53- m之间缺乏相关性。在目前的研究中,作者也发现bcl-2和p53之间没有统计学上的显著关系。
对于p53和bcl-2的改变究竟如何影响NSCLC患者的预后,仍然存在相当大的争议。大多数研究集中在p53-PE的潜在预后价值上。其中一些论文提示p53免疫组化提示预后不良32,33,而另一些人则恰恰相反34,35. 同样,p53基因突变的潜在作用也是有争议的。碳素et al。33在非小细胞肺癌患者中,p53-Ms与主要侵袭性没有关联,而其他研究人员观察到相反的效果36,37. 福山et al。38提示p53-Ms是一个独立的不利预后标志物,尤其是在早期NSCLC中。Tomizawaet al。39据报道,突变而不是P53的表达将作为早期NSCLC管理中的预后标志物很重要。然而,大多数这些研究分析了对P53-MS的筛选的相对不敏感的间接技术,例如单链构象多态性(SSCP)。
有研究表明,过表达bcl-2可能预示着NSCLC预后较好。Pezzellaet al。11研究发现,bcl-2蛋白与腺癌呈负相关,与患者总体、所有年龄的SqCC患者以及任何类型的非小细胞肺癌≥60岁患者的5年生存率提高呈正相关。里特et al。40在bcl-2染色的病例中发现无病生存增加的趋势,但没有达到统计学意义。Fontanini随后的研究et al。12据报道,bcl-2染色的非小细胞肺癌患者生存率增加。另一方面,安东et al。41据报道,在427例非小细胞肺癌患者中,bcl-2免疫阳性不是独立的预后因素。
在本研究中,我们发现p53异常和bcl-2阴性染色(单独分析)均与总体生存率低相关。然而,在多变量分析中,只有p53-M检测的阳性结果仍然是一个独立的、有统计学意义的、不利的生存预后因素。当p53-M试验从模型中移除时,p53-PE试验和p53-Abs试验的阳性结果成为具有统计学意义的不利预后因素。
本结果提示得出结论,从脱氧核糖核酸,蛋白质和免疫反应水平分析的P53异常和在蛋白质水平分析的BCL-2异常,只有P53基因突变似乎对存活预后具有强烈而独立的影响。然而,当脱氧核糖核酸序列信息不可用时,P53蛋白表达和血清中P53抗体的存在可以提供重要的预后信息。
- 收到了二○○○年二月十四日。
- 接受2000年10月26日。
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