抽象的
β2- 肾上腺素激动剂具有药理学性质,可以提示对表征哮喘的炎症和修复过程的各个方面的抑制作用。
因为成纤维细胞表达β2- 评价不同浓度(0.1-100nm)的氟替卡松(0.1-100nm)丙酸酯(Fp),salmeterol(fp + s)对肺成纤维细胞增殖和粘附分子表达的影响。
用成纤维细胞因子碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激人胎儿肺成纤维细胞,可产生[甲基-3.H]胸苷([3.H]TdR)的吸收,是对照培养的4倍(p=0.0001),且在所有浓度(0.1-100 nM;p < 0.05)。FP (0.1 ~ 100 nM;p > 0.05,所有比较)。此外,FP+S的联合并没有提高单独的S的抑制活性(p>0.05,各比较)。肿瘤坏死因子-α (TNF-α)可诱导细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)的表达上调(p=0.0004),而白细胞介素-4 (IL-4)则不能上调(p>0.05),而两种细胞因子均不能提高肺成纤维细胞透明质酸-细胞粘附分子(H-CAM)的表达(p>0.05)。在所有浓度(0.1-100 nM;比较p < 0.01,每个)。有趣的是,S (10 nM和100 nM)能增强FP对ICAM-1表达的抑制活性(p<0.01),而对H-CAM表达的抑制活性无明显增强(p>0.1)。
这些结果表明,在人胎儿肺成纤维细胞中,丙酸氟替卡松和沙美特罗是有效的调节在体外,可能参与气道重塑的不同肺成纤维细胞生物学功能。
支气管哮喘是与可逆气道阻塞和支气管过度反应到各种刺激的慢性炎症疾病1.尽管这些组分中的每一个被认为是哮喘表型的重要组成部分,但主要的根本异常被认为是慢性气道炎症,这导致可逆阻塞,高反应性和组织重塑2.
哮喘的病理发现不仅包括气道组织中单核细胞,肥大细胞,肥大细胞和嗜酸性粒细胞的渗透,还包括亚基底膜纤维化3..实际上,即使在轻度哮喘中,炎症细胞也招募在气道释放产品中,该产品能够介导气道通畅和反应性的变化2,损害支气管上皮细胞和刺激上皮基底膜下方的肌成纤维细胞增殖和胶原蛋白4..因此,可以观察到两个不同的过程:1)再生广告integrum,留下之前伤害的残留痕迹;或者2)通过连接组织更换,通过沉积增加的胶原蛋白(特别是III和V),多糖(如透明质酸)和通过活化的间质成纤维细胞的纤维素切除蛋白2那5.那6..
除了通过气道炎症和实质细胞释放的各种细胞因子和介质调节,成纤维细胞也可以与炎性细胞直接相互作用,如哮喘患者支气管粘膜中嗜酸性粒细胞和肌纤维细胞的常意观察所证明的4.那6.-8..这种紧密的接触可能是由于相互作用细胞表面上的粘附分子表达,可以允许通过直接细胞对细胞相互作用和高细胞因子浓度刺激炎症细胞7..
成纤维细胞表达多种表面分子,包括细胞间粘附分子-1 (ICAM-1, CD54)和透明质酸-细胞粘附分子(H-CAM, CD44),属于跨膜糖蛋白家族7.那8..在炎症或实验性暴露于细胞因子期间,粘附分子表达上调在气道实心细胞和多核白细胞上,似乎深受白细胞迁移和激活效应9..事实上,嗜酸性粒细胞已被证明能粘附成纤维细胞,并通过ICAM-1与白细胞整合素白细胞功能相关抗原-1 (LFA-1, CD11a/CD18)的结合而被激活,后者表达于嗜酸性粒细胞表面8.那10..
作为聚糖透明质酸的受体,以及胶原蛋白和纤连蛋白11., CD44跨膜糖蛋白似乎参与了细胞运动的调节,以及在纤维形成过程中发生的细胞-细胞和细胞-基质相互作用的调节8.那12..
由于哮喘的特征是气道炎症和可逆性支气管阻塞,因此可用抗炎药物(IE。皮质类固醇)和支气管扩张剂,如β2肾上腺素能受体受体激动剂1.皮质类固醇的治疗活性至少部分地从抑制炎症介导合成,通过实质和炎症细胞释放,以及预防一些组织学变化,这些组织学变化在哮喘中表征气道重塑,包括潜水前纤维化1那13..
同样,最近的研究表明β2肾上腺素能受体受体激动剂有体内和在体外药理特性表明对哮喘有关的炎症反应的各个方面的抑制作用14..
有了这个背景,旨在评估一项研究在体外,吸入糖皮质激素(氟替卡松丙酸(FP))和长效β的活性2-肾上腺素受体激动剂(沙美特罗辛酸盐(S))对成纤维细胞增殖和粘附分子表达的影响。
材料与方法
成纤维细胞培养
在进行的所有实验中使用了MG 06114,人胎肺成纤维细胞系。选自GM 06114细胞系,因为在初步实验中,它以与人肺成纤维细胞原发性培养类似的方式对细胞因子刺激反应7.那15..成纤维细胞培养至融合,收集并扩散至96孔板(7000细胞·孔)-1)或进入24孔板(60,000个细胞·井-1)以评估黏附分子的表达。细胞用Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Euroclone Ltd, Paignton, Devon, UK)添加20%胎牛血清(FCS;青霉素/链霉素(5,000 IU·mL-1) (ICN Biomedicals srl, Costa Mesa, CA, USA), 37°C, 5%二氧化碳(CO2).然后取出培养基,将细胞重悬于无血清DMEM中,再孵育48小时。在不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, 0.5-100 ng·mL)的刺激下,去除培养基,用新鲜无血清DMEM替代-1),肿瘤坏死因子-α (TNF-α, 0.5-20 ng·mL-1)(Euroclone Ltd)或白细胞介素-4(IL-4,0.5-20 ng·mL-1) (PeproTech EC Ltd,伦敦,英国)。未受刺激的细胞作为阴性对照。24h培养后,细胞增殖和分子粘附表达的评估如下所述。
细胞增殖测定
将脱氧核糖核酸(DNA)合成评价为氚化胸苷的掺入([甲基 -3.H]胸苷([3.H] TDR))(Amerhsam International,Little Chalfont,Buckinghamshire,英格兰)。在初步实验中,用BFGF,TNF-α或IL-4刺激细胞以0.5-20ng·mL的浓度刺激24小时-1,为了确定哪种刺激最有效地诱导成纤维细胞增殖。在第二组实验中,在终浓度为5 ng·ml的终浓度下刺激细胞24小时。-1,加上FP或S,或加上两种药物的组合,浓度为0.1nm-100nm。未刺激的成纤维细胞被用作阴性对照,而单独用BFGF刺激的细胞被用作阳性对照。[3.H] TDR(0.1 MicroCi·井-1然后加入,18小时以后,将细胞冷冻并在-20℃下保持≥24小时。解冻后,用自动细胞收割机收集细胞在滤纸上,溶解在聚丙烯小瓶中的3ml闪烁流体(ICN生物医学SRL)中的过滤器和[3.H]使用液体闪烁计数器测量TDR掺入16..掺入被表达为·min-1(cpm)。每个实验都有三个重复。刺激24小时后,采用台盼蓝排除试验(Euroclone Ltd)评估细胞活力16..
人胎肺成纤维细胞粘附分子表达的评价
将细胞生长在24孔板中并用TNF-α或IL-4刺激,收集,在DMEM中洗涤两次,在DMEM中重悬于2%FCS和NaCl 0.9%的0.1%叠氮化物中,并用单克隆抗体染色评估粘附分子表达。通过台盼蓝染料排除试验评估细胞活力。评估ICAM-1和H-CAM的表达,100μL·孔-1将细胞悬液放入96孔圆底微滴度板中。异硫氰酸荧光素(FITC)偶联单克隆抗体(MAB)、抗人(ah)-ICAM-1 (CD54) (Biosource International Inc., Camarillo, CA, USA)或抗人(ah)-H-CAM (CD44) (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA)在4°C孵育30分钟后,细胞洗涤两次,然后用0.5%多聚甲醛固定,并用免疫荧光流式细胞术(Becton Dickinson Immunocytometry Systems;Mountain View, CA, USA)。为了比较同一实验中不同样品的荧光强度,使用相同的对数放大器设置,并用CELLQuest软件(Becton Dickinson)分析listmode文件。将线性荧光强度单位转换为线性荧光强度单位,以获得大范围内荧光强度的线性函数,然后将对照抗体(抗人抗体(ah)-CD3 FITC (Becton Dickinson))获得的平均背景线性荧光值从特异性染色细胞的平均荧光强度中减去。通过流式细胞仪的前向光散射信号控制不同条件下细胞大小的可能变化,与细胞大小成正比,并根据细胞表面积的增加进行代数调节,从而获得相对线性荧光单位的强度。这种调整允许平均荧光强度与染色抗原的细胞表面密度的相关性。所有实验都有三个重复。荧光强度用平均荧光通道(mfc)表示。17..
为了评估FP和/或S对粘附分子表达的影响,在不同浓度的FP,S或两种药物的缔合物存在下,刺激成纤维细胞24小时,在两种药物的缔合物(0.1-100)存在下进行TNF-α或IL-4(0.1-100 nM). Evaluation of ICAM-1 and H-CAM was performed as described above. Cell viability was evaluated by Trypan blue dye exclusion test.
数据与统计分析
Mann-Whitney U-Test或配对T检验用于在适当时比较数据。数据参数分布式作为算术平均值±SEM呈现。P值<0.05被设定为指示统计学上显着差异的水平。
结果
碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子-α或白介素-4刺激后成纤维细胞增殖和粘附分子表达
在测试的刺激中,bFGF在诱导剂量依赖性肺成纤维细胞增殖方面非常有效,在所有浓度测试中均有统计学意义(p<0.01,与对照组比较;图1⇓).相比之下,当用IL-4或TNF-α刺激细胞(P> 0.05,每比较时,观察到肺成纤维细胞增殖的显着增加(每次比较;图1⇓).
不同刺激对人胎肺成纤维细胞系增殖的影响。不同的文化条件,IE。未受刺激的细胞(□)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)(▴)、白细胞介素(IL)-4(〇)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(•)刺激的细胞(□)与氚化胸腺嘧啶(3.HTDR)细胞增殖评估为数分钟-1(cmp)。值表示为平均值±sem。* *: p < 0.01;* * *: p < 0.001与如果细胞。
在DMEM培养基中生长的未受刺激的成纤维细胞显示出可忽略的ICAM-1基础表达,但H-CAM水平升高(图2)⇓).TNF-α(5 ng·mL-1)能够通过肺成纤维细胞诱导ICAM-1表达的上调(对照:6.88±0.44mFC; TNF-α5ng·mL-1:21.47±2.44 MFC;p = 0.0004)(图2⇓).IL-4没有看到这种上调(图2⇓).
人胎肺成纤维细胞表面细胞间粘附分子(ICAM)-1 (CD54)和透明质细胞粘附分子(H-CAM, CD44)的表达。不同浓度(0.5-20 ng·mL)刺激成纤维细胞CD54表达的流式细胞仪直方图-1)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(A)或白细胞介素(IL)-4(C)。用不同浓度TNF-α(b)或IL-4(d)刺激成纤维细胞对成纤维细胞表达的流式细胞术直方图。MFC:平均荧光通道;CTR:控制。
TNF-α和IL-4都不能显著增加H-CAM的表达,可能是因为H-CAM的高基础表达(对照:129.71±5.60 mfc)(图2)⇑).
丙酸氟替卡松和/或沙美特罗对成纤维细胞增殖的影响
在所有测试的浓度下,FP对BFGF诱导的成纤维细胞增殖没有显着影响(图3⇓).相反,在相同浓度下,S能有效抑制成纤维细胞增殖(p<0.01,与bfgf刺激的培养物比较;图3⇓).虽然在测试的三种最高浓度下,与S加FP相比,单独的抑制活性似乎更高,[3.S单独存在或S+FP时的TdR无统计学差异(p>0.05,每次比较;图3⇓).
不同浓度的丙酸氟替卡松(•)、沙美特罗(〇)或两种药物的联合(▴)对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人胎儿肺成纤维细胞增殖的影响。不同浓度(0.1-100 nM)的药物与氚化胸腺嘧啶(3.以计数·min评估成纤维细胞增殖-1.值表示为平均值±sem。□:如果细胞。* *: p < 0.01;* * *: p < 0.001与没有药物的BFGF刺激的细胞培养物。
氟替卡松丙酸盐和/或唾液鼠对粘附分子表达的影响
在评价FP和S诱导的粘附分子表达变化时发现,两种药物均能显著抑制人肺成纤维细胞表面ICAM-1和H-CAM的表达。FP暴露诱导TNF-α刺激的ICAM-1表达量呈剂量依赖性下调,在所有检测浓度下均显著(p<0.001,与TNF-α刺激培养物比较;图4⇓).在所有检测浓度下,S均能显著下调TNF-α刺激的ICAM-1表达(p<0.01,与TNF-α刺激的培养物比较)。在3种最高浓度下,S的抑制作用均低于FP (p<0.01;图4⇓).单独的FP的效果和FP + S之间的比较显示,在同一浓度下加入到FP的两个最高浓度(10和100nm),同时在ICAM-1表达式上增强了FP诱导的抑制(FP 10 nM 6.97±1.00 mfc, FP+S 10 nM 4.53±0.77 mfc, p=0.0058; FP 100 nM 5.19±0.84 mfc, FP+S 100 nM 4.63±1.37 mfc, p=0.008).
不同浓度的丙酸氟替卡松(•)、沙美特罗(n)或两种药物的联合(▴)对肿瘤坏死因子-α (TNF-α)诱导的细胞内黏附分子(ICAM)-1 (CD54)表达(a)和构成性透明质细胞黏附分子(H-CAM;CD44)在人胎儿肺成纤维细胞系表面的表达(b)。不同浓度(0.1-100 nM)的药物与平均荧光通道(mfc)绘制。值表示为平均值±sem。□:如果细胞。*: p < 0.05;* *: p < 0.01;* * *: p < 0.001与在没有药物的情况下种植的控制细胞培养物。
由于TNF-α和IL-4都没有修饰H-CAM的表达,在初步实验后,我们在未受刺激的成纤维细胞上评估这两种药物对这种粘附分子的影响。每一浓度的FP或S单独显著抑制H-CAM的表达(图4)⇑).其中,FP在抑制基础H-CAM表达方面强于S,但差异无统计学意义(p>0.1)。此外,S未显著改变FP的抑制活性(p>0.1;图4⇑).FP,S或两种药物组合诱导的这些效果均未与细胞活力的统计学显着改性有关(P> 0.1,每个比较;数据未显示)。
讨论
评估在体外,人胎肺成纤维细胞系,已经显示出长效β2- Aganists S非常有效地抑制成纤维细胞增殖和ICAM-1和CD44表面分子表达。虽然在FP存在下观察到细胞增殖的变化,但在下调ICAM-1和CD44表达中,该药物比S更有效。最后,相关的S单独在ICAM-1表达上显着增加FP的抑制活性。
与增加数量的成纤维细胞相关的耻骨上的层增厚是哮喘中的气道重塑的特征4.那5.那18.-20..来自哮喘学的内核活检标本的评估表明,耻骨上层由致密的纤维胶原III和v成纤维细胞组成,而不是上皮血管5.那6..虽然炎症过程对胶原沉积的影响尚不清楚,但一些炎症细胞类型,包括肥大细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和上皮细胞,能够产生和释放刺激成纤维细胞的因子6..
除了分泌细胞外基质成分外,成纤维细胞还能释放多种炎症细胞因子和趋化因子21.那22.并表达表面分子,如ICAM-115.和CD448.那9..ICAM-1作为表达在嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞表面分子的配体23..炎性反应组织中ICAM-1表达增加24.它与白细胞在成纤维细胞上的转移有关25.嗜酸性粒细胞黏附和活化增加10..因此,响应于细胞因子的ICAM-1的表达增加可以代表成纤维细胞粘附并与特应患者呼吸道粘膜中的炎性和免疫效应细胞相互作用的机制10.那23..
CD44跨膜糖蛋白代表细胞外基质组分的受体,并认为参与在纤维发生期间发生的细胞对细胞和细胞至基质相互作用的调节8.那12..除了为组织提供机械支撑之外,细胞外基质越来越被认为是细胞定位,迁移,分化和激活的信号源12.那26.那27..最近的数据表明CD44可能与损伤后的成纤维细胞迁移和肺修复有关。CD44是支持细胞运动性的基质蛋白的表面受体,包括纤维素和透明质酸28,其表达在肥厚瘢痕成纤维细胞中增加29.有趣的是,来自急性肺泡纤维化患者的肺组织通过新形成的纤维化组织(Filopropodia和Ladellopodia)发现CD44表达CD44表达的间充质细胞,沿着成纤维细胞的动机结构(氟覆盖症和层层体)发现了高浓度的这种表面蛋白质28.
本研究最令人惊讶的发现是,S在抑制bfgf诱导的成纤维细胞增殖方面比FP更有效。β2肾上腺素受体激动剂与特定的细胞膜受体相互作用,激活信号转导机制,导致不同细胞类型的细胞反应可能不同14..实际上,除了抑制或逆转支气管平滑肌的收缩响应之外,这些化合物也调节各种炎症和免疫效应细胞功能,包括T淋巴细胞增殖和单核细胞表面受体表达14.那16.那30..使用人胎肺成纤维细胞系,该研究表明,S在下调成纤维细胞增殖中具有高效,并且在减少可能参与气道重塑的粘合分子的表达中。此外,在测试的两个最高浓度下,S单独在ICAM-1表达上显着增加FP的抑制活性。这些发现与最近的报告结果一致,表明在预先存在下,人肺成纤维细胞原发性培养物抑制ICAM-1表达31.事实上,β2-肾上腺素能受体激动剂也可能激活原代人肺成纤维细胞中的糖皮质激素受体32.
虽然FP在降低表面分子表达方面比S更有效,但对bfgf诱导的成纤维细胞增殖没有直接抑制活性。糖皮质激素不仅影响蛋白质翻译,还影响蛋白质合成的转录后加工33.参与糖皮质激素活性的机制的复杂性可以解释为什么对这些药物的细胞反应不仅高度依赖于细胞类型,而且对细胞功能进行了高度依赖性33-35.
临床研究表明,在哮喘中,低剂量吸入的皮质类固醇不仅能够下调支气管炎症的强度,而且还可以降低耻骨上的层厚度6.那14..的确,体内通过抑制炎症过程的若干方面,皮质类固醇可有效地控制组织重塑,例如调节与能够激活白细胞和肺实质细胞的细胞因子相关的基因的转录5.那6.那31-33.
总之,这些数据支持在生物学水平的假设中,两种药物的组合,长效β2-肾上腺素受体激动剂和吸入类固醇,不仅可以更好地控制哮喘的临床,而且可能有助于防止肺功能的长期恶化1.虽然使用的药物浓度在体外本文类似于在50μg吸入剂量的Salmeterol后在外周肺组织中发现的那些35,在此报告的实验观察的临床重要性应得到进一步调查。
- 收到了2000年7月27日。
- 公认2001年3月6日。
- ©ers Journals Ltd