摘要GydF4y2Ba
粘蛋白染色可用于评估人体呼吸道的分泌活动。然而,粘蛋白的表位可以由分泌物的物理化学性质被屏蔽。本研究的目的是研究的钙离子螯合剂,乙二醇 - 双 - (β氨基乙醚)的效应-N,N,N',对在检测M1 / MUC5AC粘蛋白的N'-四乙酸(EGTA)分离人支气管准备。GydF4y2Ba
免疫组化研究和抗M1单克隆抗体(MAB)免疫放射分析用于检测M1/MUC5AC粘蛋白,该粘蛋白来源于具有完整表面上皮的支气管制剂或去除上皮的组织(摩擦制剂)。GydF4y2Ba
单克隆抗体标记EGTA中的上皮杯状细胞和粘膜下腺细胞(4) mM)-暴露于支气管制剂中,而EGTA仅染色杯状细胞(0.4 暴露组织。从EGTA(4)提取的支气管液中检测到的M1/MUC5AC粘蛋白量 mM)-暴露于完整和摩擦的制剂或经EGTA处理的支气管液中(4 与未经处理的对照值相比,mM)显著增加了两倍(p<0.001)。此外,在暴露于EGTA(4 mM)表明该治疗不会影响组织活力。GydF4y2Ba
这些结果表明,乙二醇-双-(β-氨基乙醚)-N, N, N ', N ' -四乙酸(4mm)通过改变呼吸道粘蛋白的理化性质,有助于M1/MUC5AC粘蛋白的检测,从而暴露抗M1单克隆抗体反应的表位。这将允许更精确地测量人类气道的分泌活动GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
在犬气管准备中,马林GydF4y2Ba等GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba当组织暴露于贫钙培养基时,硫酸根吸收显著减少。然而,这些研究人员报道了粘蛋白糖蛋白中硫酸盐的释放与钙离子(CaGydF4y2Ba2+GydF4y2Ba)在媒体上。其他研究表明,气管细胞在Ca中的培养GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba-游离培养基诱导粘蛋白糖蛋白基线释放的时间依赖性增加GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba.此外,Ca的增加或减少GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba培养基中的浓度增加了离体鸡气管中粘蛋白的分泌GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba这些数据表明,气管细胞粘蛋白的分泌活性依赖于CaGydF4y2Ba2+GydF4y2Ba科尔斯先生GydF4y2Ba等GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba表明钙的耗竭GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba通过与乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N, N, N ', N ' -四乙酸(EGTA)的螯合,不仅增加了从犬气道释放的糖蛋白的数量,而且通过改变溶解度改变了腺细胞释放的粘液的物理性质。这一结果与前人的研究结果一致GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba介质中阳离子螯合剂的浓度或添加引起粘蛋白流变性和物理性质的变化GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba在这些后期研究中,EGTA暴露后气管粘蛋白的分泌通过将放射性标记物掺入分泌细胞进行监测,很少提供有关释放糖蛋白性质的信息。M1/MUC5AC粘蛋白先前已通过免疫放射分析(IRMA)检测到使用八种抗M1单克隆抗体(单克隆抗体)的混合物GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10GydF4y2Ba特别针对M1粘蛋白的肽核心而培养,并与MUC5AC基因部分编码的M1粘蛋白具有高亲和力GydF4y2Ba11GydF4y2Ba. 最近,这些单克隆抗体也被用于评估人气道的分泌活性GydF4y2Ba12GydF4y2Ba–GydF4y2Ba14GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
本研究的目的是检验钙螯合剂EGTA是否有助于检测人类气道中的M1/MUC5AC粘蛋白。此外,为了排除暴露于EGTA期间EGTA对人类气道生存能力的任何影响,还进行了乳酸脱氢酶(LDH)和蛋白质分泌的测量。GydF4y2Ba
材料和方法GydF4y2Ba
化学品和材料的来源GydF4y2Ba
磷酸盐缓冲盐水(PBS)片、牛血清白蛋白(BSA)、吐温20、辣根过氧化物酶结合抗鼠免疫球蛋白-G(IgG)和EGTA购自Sigma Chemical Co.(美国密苏里州圣路易斯市)。链霉蛋白酶E是Calbiochem(法国生物化学公司,法国)的产品。聚苯乙烯星和管来自Cis Bio Industrie(法国圣昆汀-伊夫林)。用于免疫标记的LSAB-2试剂盒从Dako实验室(美国加利福尼亚州Carpinteria)获得。LDH测定采用Biotrol诊断试剂盒(法国卢浮宫Chennevrières les Louvres)进行。GydF4y2Ba
M1粘蛋白标准和单克隆抗体GydF4y2Ba
从卵巢粘液囊肿液中分离的M1粘蛋白用作标准。八种针对M1粘蛋白肽核相关表位的单克隆抗体可检测粘蛋白GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10GydF4y2Ba.这些抗m1粘蛋白单克隆抗体是IgGGydF4y2BaLGydF4y2Ba. 单独使用1-13 M1或21 M1单克隆抗体或八种抗M1粘蛋白单克隆抗体(PM8)的混合物(包括1-13 M1和21 M1单克隆抗体)进行免疫组织化学分析。使用单个21 M1和PM8单克隆抗体进行IRMA实验。GydF4y2Ba
组织GydF4y2Ba
人肺组织取自肺癌手术患者。组织取自离肿瘤区域一定距离的切除肺。随后,将支气管(第三代至第六代支气管)从实质组织中分离出来,并用含有NaCl(139.2 KCl(2.7), 嗯,CaClGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba(1.8 嗯,MgClGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba(1.04毫米),NaHCOGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba(11.9毫米),不GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba阿宝GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba(0.4 mM)和葡萄糖(5.5 mM), pH 7.4。将支气管组织切成4 - 7mm,内径100 - 225mg,湿重的环状。检查有无表面上皮的支气管标本。用湿棉签轻揉支气管环管腔表面,去除表面上皮。GydF4y2Ba
免疫组化分析GydF4y2Ba
在不存在或存在EGTA的情况下孵育60分钟后(0.4或4 人支气管环在福尔马林中固定12小时 h、 脱水、石蜡包埋和切片(5 µm)。组织脱蜡切片在PBS(10)中冲洗 嗯,博士 7.4含有吐温20(0.1%)。然后在0.05%的时间内用链霉蛋白酶E(0.025%)处理切片 M Tris-HC1缓冲液,pH 7.6换7 在室温下暴露粘蛋白表位的分钟数GydF4y2Ba15GydF4y2Ba在PBS吐温20(0.1%)中多次冲洗切片后,内源性过氧化物酶被HGydF4y2Ba2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba(3%) in methanol for 5 min. Tissue sections were incubated in PBS-Tween 20 (0.1%) containing BSA (1%) for 5 min at room temperature and then incubated with the 1-13 M1 and 21 M1 Mabs at the final concentration of 10 µg·mL−1.GydF4y2BaPBS-Tween 20(0.1%)。同样的肺切片也在PBS-BSA(1%)中PM8单克隆抗体的存在下孵育1小时。用PBS- tween 20(0.1%)洗涤几次后,将组织切片与PBS中1:50稀释的辣根过氧化物酶结合的抗鼠IgG在室温下孵育1小时。用二氨基联苯胺/H测定过氧化物酶活性GydF4y2Ba2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba如LSAB-2试剂盒中描述的揭示系统,在黑暗中10分钟,组织切片用Harris苏木精反染色(2分钟)。GydF4y2Ba
人支气管制剂的治疗GydF4y2Ba
Intact and rubbed human bronchial preparations were set up in a microtitre plate (24 wells) containing Tyrode's solution (1 mL) and allowed to equilibrate for 1 h at 37°C in a humidified incubator (5% carbon dioxide (CO2.GydF4y2Ba) /空气)。在平衡期结束时,交换介质,加入之前在37°C加热过的新鲜Tyrode溶液1小时。含人类分泌粘蛋白的支气管液体(期I;基础释放)。然后将支气管环暴露于含EGTA的Tyrode溶液中,浓度为0.4 mM或4mm(最终浓度)。在这些条件下将人体制剂孵育1小时后,收集支气管液体(第二阶段;接触)。第一阶段和第二阶段的支气管液体储存在−20°C,并通过IRMA分析。GydF4y2Ba
乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸治疗支气管液体GydF4y2Ba
从对照人支气管制剂中收集支气管液(第I期和第II期)。在第II期从每个肺样本中的三种制剂中获得的液解冻并等分。一个样本未处理并用作对照(第II期)。其他等分样本在0.4%的浓度下用EGTA处理 毫米还是4毫米 mM(最终浓度)为1 在通过IRMA进行分析之前,在室温下测定h。GydF4y2Ba
免疫放射分析GydF4y2Ba
如Bara先前所述,使用固相双抗体夹心IRMAGydF4y2Ba等GydF4y2Ba16GydF4y2Ba.用1-13 M1单抗(10µg·mL)包被聚苯乙烯星GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba在0.01 M PBS,pH 7.4)通过培养2小时 h在室温下,用PBS吐温20(0.1%)漂洗三次,随后在37°C下在PBS-BSA(1%)中过夜。在多次洗涤后,在40°C下干燥星星,并在4°C下储存,直至使用。M1粘蛋白标准(10 微克·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)、人支气管液在PBS-Tween 20(0.1%)中连续稀释,各稀释液300µL加入1-13 M1单抗包被星形中,37℃孵育过夜。然后用PBS-Tween 20(0.1%)清洗星星,并与PM8单克隆抗体孵育GydF4y2Ba125GydF4y2Ba我(4 - 5×10GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba cpm·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)在37°C的温度下过夜。随后,对恒星进行清洗,并用伽玛计数器(Wizard Model 147005 Evry,法国)测量放射性。根据M1粘蛋白标准得到的IRMA标准曲线估算人支气管液中粘蛋白的浓度。测定了取自6例肺样本的支气管液中的粘蛋白浓度。GydF4y2Ba
计算GydF4y2Ba
IRMA检测的人支气管制剂液体中M1/MUC5AC黏蛋白的浓度表示为M1/MUC5AC黏蛋白·mL的µgGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba根据卵巢囊肿M1粘蛋白标准曲线估算。所有结果均以平均值±sem表示。采用非配对t检验进行统计分析。p值<0.05被视为显著性的指标。GydF4y2Ba
乳酸脱氢酶测定GydF4y2Ba
通过测量340℃时吸光度的变化来评估LDH在浸泡支气管制剂的Tyrode溶液中的释放 使用Biotrol LDH SFBC试剂盒进行nm。在周期I和周期II从对照组和EGTA激发的支气管制剂中收集的支气管液在3000倍的温度下离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba五 最少10份 µl离心支气管液和新鲜的Tyrode溶液,其中含有0.4和4%的EGTA 立即将mM添加到反应混合物中。反应保持在30°C,吸光度读数为340 30纳米 s、 然后每分钟2分钟 最小值。所有值均以单位·mL表示GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba和是来自三个人肺样本的六种支气管液体的平均值±sem。采用非配对t检验进行统计分析。GydF4y2Ba
蛋白质测定GydF4y2Ba
在等分试样(100)上系统地测定总蛋白质浓度 µL)取自从对照组和EGTA收集的人支气管液(4 使用Lowry程序测量总蛋白GydF4y2Ba等GydF4y2Ba17GydF4y2Ba以牛血清白蛋白为标准。GydF4y2Ba
后果GydF4y2Ba
免疫组织化学GydF4y2Ba
尽管用1-13 M1和PM8单克隆抗体在上皮杯状细胞和粘膜下腺细胞的细胞器中观察到M1/MUC5AC粘蛋白标记(图。 1.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)将分离的人支气管制剂暴露于EGTA 60分钟后(4 mM),只有上皮杯状细胞的细胞内细胞器被21 M1单抗标记(图。 1.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).The intracellular organelles of goblet cells of the surface epithelium of control bronchial preparations were stained with the PM8 Mabs (fig. 2⇓GydF4y2Ba).单位为EGTA(0.4 在暴露于mM)的支气管组织中,使用1-13 M1、21 M1和PM8单克隆抗体也检测到存在于表面上皮杯状细胞的细胞器中的M1/MUC5AC粘蛋白的标记(图。 2.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)此外,在对照组和EGTA(0.4或4)中,与表面上皮纤毛接触的M1/MUC5AC粘蛋白用这些单克隆抗体染色 mM)-暴露的支气管制剂(图。 1和2GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
免疫组化法对分离的人支气管标本进行抗m1单克隆抗体(Mabs)继发乙二醇双(β-氨基乙醚)-N, N, N ', N ' -四乙酸(EGTA) (4 mM;60分钟)。用1-13 M1单克隆抗体(A, B)和PM8单克隆抗体(C, D)标记上皮杯状细胞和粘膜下腺体的胞内细胞器。用21 M1单克隆抗体(E)标记支气管表面上皮杯状细胞的胞内细胞器。内标条分别为80µm (A, C, E)和160µm (B, D, F)。L:气管腔;G1:腺体;箭头:单克隆抗体标记和/或腺体。GydF4y2Ba
用抗M1单克隆抗体(单克隆抗体)继乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)后对离体人支气管标本切片进行免疫组织化学染色(0.4 mM)暴露。仅对照支气管制剂表面上皮杯状细胞的胞内细胞器用PM8单克隆抗体(A)染色。在EGTA中类似(0.4 用1-13 M1(B)、21 M1(C)和PM8单抗(D)标记暴露于mM的制备物、杯状细胞的细胞内细胞器。内部比例尺=160 µm。L:气道腔;Gl:腺体区;箭头:单克隆抗体标签和/或腺体。GydF4y2Ba
具有完整表面上皮的人支气管制剂暴露于乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸GydF4y2Ba
对照人支气管制剂M1/MUC5AC粘蛋白的基础释放量为0.32±0.07 微克·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba(期一,九支气管备八肺;图3GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).在对照条件下(第二阶段)的实验方案期间以及支气管制剂暴露于EGTA(0.4)60分钟后,该值没有显著改变 mM;0.53±0.11 M1/MUC5AC粘蛋白(µg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba);图3GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)然而,当组织暴露于更高浓度的EGTA(4 mM),支气管液中检测到的M1/MUC5AC粘蛋白数量显著增加(约两倍;0.82±0.11 M1/MUC5AC粘蛋白(µg·mL)GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba);图3GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)当将数据与来自同一肺的配对对照制剂的液体中检测到的量进行比较时(0.35±0.10 M1/MUC5AC粘蛋白(µg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba);图3GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).虽然泰罗德溶液中含有EGTA(4 mM)的pH值为5.4,在调节至该酸性pH值的Tyrode溶液中培养支气管制剂不会改变液体中检测到的M1/MUC5AC粘蛋白的数量(数据未显示)。GydF4y2Ba
使用抗M1放射性标记单克隆抗体(Mabs, PM8)的免疫放射法检测来自分离的人支气管制剂的支气管液中M1/MUC5AC粘蛋白。在第一期(基础释放;来自8个肺样本的9个制剂)和第二阶段(对照;来自8个肺样本的9个准备)。经乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N, N, N ', N ' -四乙酸(0.4 mM;三份肺样本的三份制剂)和EGTA (4mm;9个肺样本13个样品)数据以平均值±sem表示。***:与基础值有显著差异(p<0.001)(第一阶段)。GydF4y2Ba
无表面上皮的支气管制剂暴露于乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸GydF4y2Ba
The quantities of mucin detected in fluids with the PM8 Mabs were not significantly modified when bronchial preparations, in which the surface epithelium had been removed, were exposed to EGTA (0.4 mM; 0.68±0.24 M1/MUC5AC mucin (µg·mL−1.GydF4y2Ba);无花果。 4⇓GydF4y2Ba).然而,在EGTA (4 mM;1.24±0.17 M1/MUC5AC粘蛋白(µg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba);无花果。 4⇓GydF4y2Ba).当使用21 M1单克隆抗体检测粘蛋白时,对照组和EGTA之间未观察到M1/MUC5AC粘蛋白数量的变化(4) mM)-暴露的支气管制剂(图。 4.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
a) 使用混合PM8放射性标记单克隆抗体(MAB),通过免疫放射测定法测定从去除表面上皮的制剂中提取的支气管液中M1/MUC5AC粘蛋白的含量。数据以平均值±sem表示,并在周期I(基础释放;来自三个肺样本的五种支气管制剂)和将制剂暴露于乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)(0.4)后获得 mM;周期II;从三个肺样本中提取七种支气管制剂)和EGTA(4 mM;周期II;从3个肺样本中提取7个支气管制剂)。b) 在第二阶段从对照组(两个肺样本的两种支气管制剂)和EGTA(4)获得的液体中检测到M1/MUC5AC粘蛋白的数量 mM)-暴露的支气管制剂(来自两个肺样本的两种支气管制剂),并用单个21 M1单克隆抗体检测。***:与基础值(周期I)或配对对照组(周期II(b))相比,差异显著(p<0.001)。GydF4y2Ba
乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸4治疗支气管液体 嗯GydF4y2Ba
当使用EGTA(4)处理第二阶段来自完整对照支气管制剂的液体时 mM;1.38±0.23 M1/MUC5AC粘蛋白(µg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba);无花果。 5⇓GydF4y2Ba),当PM8单抗检测到这些M1/MUC5AC粘蛋白的数量时,与对照支气管液体或EGTA处理的液体(0.4 mM;0.36±0.04 Ml/MUC5AC粘蛋白(µg·MlGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba);无花果。 5⇓GydF4y2Ba).此外,EGTA中M1/MUC5AC粘蛋白的数量(4 从去除表面上皮的制剂中提取的经mM处理的支气管液也使用单个21 M1单克隆抗体进行测量。在后一种情况下,检测到的M1/MUC5AC粘蛋白水平相似(0.83±0.23) 微克·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba和0.73±0.10µg·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba,分别来自对照组、第I期和治疗组、第II期的液体;n=4个肺样本)。将后一个值与PM8测量值进行比较时,比率为∼检测M1/MUC5AC的比例为2:1(1.38±0.23 M1/MUC5AC粘蛋白(µg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba相对GydF4y2Ba0.73±0.10 M1 / MUC5AC粘蛋白(微克·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),第二阶段;分别为PM8和21 M1)。GydF4y2Ba
用乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)(0.4和4)处理来自对照制剂的支气管液 mM)和M1/MUC5AC粘蛋白的量通过使用汇集的PM8单克隆抗体(单克隆抗体)的免疫放射测定法测定。数据以平均值±sem表示,并在第二阶段(未经处理的液体;来自三个肺样本的六种支气管制剂)和使用EGTA(0.4%)治疗支气管液体后获得 第二阶段,从三个肺样本中提取六种支气管制剂)和EGTA(4 mM;周期II;从六个肺样本中提取10个支气管制剂)。***:与基础值(第一周期)相比,差异显著(p<0.001)。GydF4y2Ba
乳酸脱氢酶与蛋白质测定GydF4y2Ba
来自暴露于EGTA的组织的支气管液中的LDH释放没有显著改变(4) mM)将结果与对照制剂中获得的值进行比较时(表 1.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).In addition, EGTA (4 mM) did not significantly alter the quantities of protein released from bronchial preparations when results were compared with data from paired control preparations (table 1⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
分离人支气管制剂支气管液中乳酸脱氢酶(LDH)和蛋白释放的检测。GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
Exposure of isolated human airways with an intact surface epithelium to the calcium chelator EGTA (0.4 and 4.0 mM), increased the immunohistochemical tissue detection and the quantities of M1/MUC5AC immunoreactivity in fluids obtained from human bronchial preparations. In airway preparations, where the surface epithelium has been removed, EGTA (4 mM) exposure also induced an increase in the detected quantities of M1/MUC5AC mucin. These results suggest that M1/MU5CAC mucin may also be present and secreted from the region of the submucosal glands. In addition, EGTA (4 mM) treatment of the bronchial fluids derived from control preparations lead to an enhanced detection of M1/MUC5AC mucin specifically with the pooled Mabs (PM8 Mabs). In contrast, EGTA (4 mM) treatment of bronchial preparations was not associated with the release of either lactate LDH or protein. Together, these observations suggest that EGTA may modify the physicochemical properties of mucin by inducing conformational changes in the mucin glycoprotein. Such a modification unmasks other epitopes on respiratory mucin to which the different anti-M1 Mabs are reactive, thereby facilitating the detection of this glycoprotein in human airways.
巴拉GydF4y2Ba等GydF4y2Ba9GydF4y2Ba免疫组织化学报道的数据表明,各种抗M1的Mab与胃M1反应也粘蛋白标记的组织从人的呼吸道。这些研究者证明,单独的1-13 M1,M1 9-13和58种M1单克隆抗体与人呼吸道上皮表面反应,并且也表现出在粘膜下腺区域微弱的标记。这些最初的观察结果通过最近的研究,其显示表面上皮的该杯状细胞是由1-13 M1和M1 21周的Mab在未受刺激的人支气管制剂染色支持GydF4y2Ba12GydF4y2Baas well as in EGTA (0.4 mM)-exposed preparations (present report). These latter results demonstrated that the M1/MUC5AC mucin was principally detected in the goblet cells of bronchial tissues and was not derived from the submucosal glandular region, since the 21 M1 Mab failed to label this area even after EGTA treatment (figs. 1 and 2⇑GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).这些数据与Labat之前的报告一致GydF4y2Ba等GydF4y2Ba12GydF4y2Ba然而,目前的数据也表明,在暴露于EGTA的支气管制剂中(4 用1-13 M1单抗和PM8单抗对粘膜下腺体中的粘蛋白进行染色,表明组织的EGTA暴露暴露暴露于抗M1单抗特异反应的粘膜下腺体中的粘蛋白的其他表位 在暴露于mM的支气管组织中,腺体未标记单个21 M1单克隆抗体,而在杯状细胞中观察到染色(本报告)相比之下,IRMA在EGTA暴露制剂的支气管液中检测到M1/MUC5AC粘蛋白,这些后一结果表明,两种检测粘蛋白的技术可能存在差异。可以对这些差异提出几种可能的解释。首先,可能更容易获得表位对于21 M1单克隆抗体,当呼吸道粘蛋白处于溶液中时,而在组织标记中,只能暴露有限数量的位点。然而,单克隆抗体的组织固定和通过IRMA检测粘蛋白之间的相关性尚未建立,需要进一步的实验来检验这些检测差异的原因其次,EGTA可能干扰粘蛋白的酶促形成,从而揭开表位的神秘面纱。粘膜下腺体中M1/MUC5AC的糖基化可能不同于上皮细胞,因此掩盖了21 M1表位GydF4y2Ba等GydF4y2Ba18GydF4y2Ba已经在胃粘膜中的MUC-1 PDTRP表位(MUC-1蛋白核心串联重复结构域中的主要表位)中显示出这种隐匿现象。GydF4y2Ba
科尔斯和同事GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba先前的研究表明,在EGTA存在的情况下,犬气管外植体或上皮细胞中黏蛋白糖蛋白的基线释放量增加,且与螯合剂的浓度成正比。这些研究者GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba据报道,暴露于EGTA后从气管外植体中去除表面上皮(4 mM)改变了分泌反应,表明粘蛋白的释放增强主要来自Ca的粘膜下腺体GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba镁GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba-自由媒体。在EGTA中(4 在本报告中,观察到M1/MUC5AC粘蛋白的检测比基础水平高出约两倍。此外,在没有表面上皮的支气管制剂中,EGTA(4 mM)治疗使基础水平增加约六倍(第二阶段,对照)。在EGTA中检测到的M1/MUC5AC粘蛋白数量也显著增加(4) 与对照组相比,从裸露的支气管制剂中提取的经mM处理的支气管液。总之,这些数据支持M1/MUC5AC粘蛋白在这些实验条件下部分来源于粘膜下腺体的观点。一些调查GydF4y2Ba19GydF4y2Ba–GydF4y2Ba22GydF4y2Ba已经证明,腺通常与MUC5B相关,而MUC5AC在表面上皮的杯状细胞中发现GydF4y2Ba12GydF4y2Ba.但是,奥迪GydF4y2Ba等GydF4y2Ba23GydF4y2Ba已经表明,在人肺中,粘膜下腺表达基因MUC5AC;EGTA处理的结果可用于在功能性研究揭露的MUC5AC粘蛋白在人呼吸道中存在提供了一个有趣的技术。有趣的是,拉巴特GydF4y2Ba等GydF4y2Ba12GydF4y2Ba结果表明,PM8单克隆抗体对支气管组织中M1/MUC5AC粘蛋白的检出率比21 M1单克隆抗体高约10倍。PM8单克隆抗体检测M1/MUC5AC黏蛋白的比值GydF4y2Ba相对GydF4y2Ba本报告中的21 M1单抗为∼EGTA处理后2:1。这一观察结果间接支持了呼吸粘蛋白发生构象变化的建议,从而暴露了单克隆抗体所针对的其他表位。这些数据支持先前的研究结果,表明EGTA引起粘蛋白复合物的显著离解并改变粘度GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba.由于囊性纤维化患者分泌物中的钙浓度据报道升高GydF4y2Ba24GydF4y2Ba,EGTA处理这些受试者的粘液可能有助于在涉及生化分析的临床研究中溶解和/或稀释这些样本。GydF4y2Ba
先前的研究GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba25GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26GydF4y2Ba据报道,由于在Ca培养,气道制剂的上皮脱落GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba-含有离子螯合剂的游离培养基可能是增加糖蛋白检测的原因。然而,提供的数据表明,这一现象可能并不涉及,因为:1)EGTA切片的光学显微镜观察(4) mM)-孵育的组织未发现上皮或粘膜下层的任何损伤;2)与对照组相比,从EGTA激发的支气管制剂中提取的支气管液中未观察到LDH或蛋白质释放增加。GydF4y2Ba
总之,本研究报告的数据表明,乙二醇双-(β-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(4 mM)可揭穿呼吸道粘蛋白上的位点,从而暴露与抗M1单克隆抗体反应的其他表位。这些未被掩盖的表位存在于来源于人类气道支气管粘膜下腺体的粘蛋白上。GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
作者要感谢外科中心Marie Lannelongue生物化学实验室的S. Fatal,感谢他出色的技术援助。GydF4y2Ba
- 收到了GydF4y2Ba二○○○年十二月二十日。GydF4y2Ba
- 认可的GydF4y2Ba2001年3月28日。GydF4y2Ba
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