文摘
由于肺血管是复杂的区域差异在结构和功能,重要的是要理解内皮素(ET)的合成和ET系统沿轴向的分布肺动脉的途径。
大的表达ET-1等转换酶(ECE)和等一个受体在大鼠肺动脉检查在正常和缺氧条件下使用免疫组织化学方法和北部污点分析。
在正常情况下,大ET-1表达肺动脉内膜和媒体的主要分布在远端部分和优惠定位在媒体上,而等一个受体主要表达在近端部分。ECE是既定的内膜中表达和媒体。暴露于低氧后,信使核糖核酸(mRNA)表达式ET-1和等一个受体被双重和免疫反应性差异大ET-1 ECE、等一个受体明显增加了2 - 5倍,远段。
平滑肌细胞在肺动脉endothelin-1的重要来源。大endothelin-1和内皮素受体的分布肺动脉不符在正常情况下,他们的表达与此同时增加远端段在缺氧的条件下。这种异质性可能发挥重要作用在肺血管张力的调节。
内皮素(ETs)及其受体肺和假设中大量表达发挥重要作用在肺血管张力的调节。我,一个强有力的血管收缩剂和平滑肌21个氨基酸组成的有丝分裂原,是合成在Trp大我正和一个特定的乳沟21瓦尔22ET转换酶(ECE) [l 2]。我的行为是由两个不同的受体,等一个和等B受体1,2。等一个受体在肺血管平滑肌细胞和调节平滑肌收缩和平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖,而等B在内皮细胞受体表达等B1受体)和平滑肌细胞(等B2受体),导致松弛或收缩,分别2,3,4。由于肺血管床是复杂的区域差异在两种结构和功能,重要的是要知道ET-1和ET受体的定位和分布。尽管众所周知,ET-1表达各种细胞包括内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、组织巨噬细胞在肺2,5,6,很少有研究表明ET-1和ECE表达的分布沿轴向肺动脉的途径。
表达的信使核糖核酸(mRNA) ET-1,等一个和等B受体,ET-1肽的生产过剩证实了在整个肺缺氧性肺动脉高压的实验模型6- - - - - -11。此外,阻塞等一个与选择性受体拮抗剂变弱的肺动脉压力和血管重塑的发展与慢性缺氧有关12- - - - - -14。而很明显,ET-1和ET受体缺氧肺动脉高压的病理生理学中扮演很重要的角色,它是不确定在肺阻力动脉ET-1合成增加,肺血流量监管的重要站点,在缺氧条件下快速适应和改造。
在目前的研究中,大ET-1和ECE的定位和分布在大鼠肺动脉调查,和时间的变化表达在暴露于缺氧为了阐明ET-1合成的网站在正常和缺氧条件。大ET-1和ECE的分布也比等一个受体肺动脉探索ET-1和ET受体之间的相互作用在正常肺循环和缺氧肺动脉高压。
材料和方法
动物
用于分离大鼠肺的方法都是相同的那些之前报道,除了是特别注意保持动物在缺氧条件下肺前准备,因为肺ET-1 mRNA表达报道迅速降低慢性缺氧性肺动脉高压大鼠暴露于normoxia短暂接触后4,15。简单地说,成年男性Sprague-Dawley老鼠(8周大,260 - 280 g)为0.5,被3、7、14天在一个特殊设计的低比重的室(氧浓度减少到10%)。尽量减少接触normoxia,老鼠被转移到低比重的商会和保存在一个满室10%氧/ 90%氮肺前准备。年龄组在室内空气保持。肺部后被隔离大鼠腹腔内管理60毫克戊巴比妥,心脏内的注入100 U肝素。套管插入肺动脉、左心房和肺灌注在36而言不啻2O通过肺动脉插管磷酸盐(PBS)。右主支气管肺切除,在液态氮冷冻,储存在−80°C到提取细胞总RNA。左肺和4%多聚甲醛灌注(PFA),夸大了注入4%的PFA通过气管插管插入,并固定在4% PFA一夜之间在4°C。PFA摘除后,肺组织充满了最佳切削温度(10月)化合物通过气管插管,10月嵌入化合物,并存储在−80°C,直到它被用于免疫组织化学研究。缺氧肺动脉高压的发展确定的重量比右心室/左心室+隔(RV / LV + S),如前所述16,每组动物的数量是4到6。
免疫组织化学
在肺血管检测ET-1合成,反对ET-1抗体anti-ECE-1抗体而不是anti-ET-1抗体,因为疣状使用三种anti-ET-1抗体购自不同的公司表现出一定程度的非特异性染色(数据没有显示)。冻结部分(4µm)削减在−20°C低温恒温器安装在幻灯片,和孵化10%正常山羊血清,以减少非特异性结合的第二抗体。组织部分用于ECE染色被放置幻灯片进行预处理以0.01 M柠檬酸缓冲在120°C高压釜孵化前10分钟。血清被孵化了兔子和部分反人类的大ET-1多克隆抗体(IBL Inc .、树胶肿、日本)10,µg·毫升−1,antirat ECE单克隆抗体(aec27 - 121的礼物T.K.制药有限公司东京,日本)17在60岁µg·毫升−1,或者兔子anti-rat等一个受体多克隆抗体(IBL Inc .)、梅毒瘤,日本)在5µg·毫升−112 h在4°C。此外,单克隆抗体对大鼠血管细胞粘附molecule-1µg·(VCAM-1)(5毫升−1圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯、钙、美国)和人类α-smooth肌肉(SM)肌动蛋白(0.2µg·毫升−1DAKO斯特鲁普,丹麦)作为内皮标记和平滑肌标记,分别。的部分进一步孵化与生物素化的山羊antirabbit免疫球蛋白(Ig) - g抗体(稀释1:10 0)30分钟,然后用avidin-biotin-peroxidase复杂(稀释1:10 0,向量实验室,Inc .,伯林盖姆,CA,美国)30分钟。随后,immunoperoxidase颜色反应是由孵化5分钟三羟甲基氨基甲烷/盐酸液中含0.05% 3、3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride和0.01%的过氧化氢。消极的控制与兔子准备多发地血清代替主要抗体或avidinbiotin过氧化物酶通过省略步骤的复杂过程。与甲基绿复染色的部分(大型ET-1染色,VCAM-1等一个受体,α-SM肌动蛋白)和苏木精染色(ECE)。串行部分与弹性彩色van Gieson染色对动脉和静脉的准确识别内部弹性板的存在与否18。对于每一个老鼠,肺动脉是分组根据外径(ED): 60 - 200µmµm 200 - 500和500 - 1000µm。的部分是由光学显微镜检查没有知识的治疗组两个特定个人。免疫染色的强度分级半定量的0 - 3:年级0,没有染色;1级,震源染色或染色较弱;二年级,分散适度染色;三年级,很强的染色4。评估的表达变化大ET-1 ECE、和α-SM肌动蛋白暴露于低氧后,肺动脉的疣状的成绩估计从每个动物在肺的部分。在每个动物,至少30动脉(60 - 200µm ED)与终端细支气管或躺在腺泡内,动脉和3 - 5大于500µm ED进行分析。在每个部分中,各个领域进行评估连续。每组数据计算。
北部污点分析
北部污点分析如前所述19。互补脱氧核糖核酸(互补)探针老鼠ET-1 ECE-1,等一个受体被逆转录酶合成(RT)聚合酶连锁反应(PCR)。使用的引物PCR如下:感觉5′GCGATCCTTGAAAGACTTAC-3′, 5′反义-CTCGGTTGTGTATCAACTTC-3′preproET-1;感觉5′-TTCCAGCTGGAATCCTGCAG-3′, antisense-5′GTTCTGAGAACTCCTTGGAG-3′ECE-1;和5′TGTTGCTGTTGTCACCAGTCC-3′, 5′反义-GAGCGCAGCTGCTGCGTGACCG3′等一个受体20.- - - - - -22。10微克细胞总RNA提取肺在1%琼脂糖凝胶电泳,转移到尼龙膜(HiBond N, Amersham日本,东京,日本),和膜与互补脱氧核糖核酸探针杂交。的乐队杂化探测被测密度术量化使用计算机辅助图像分析仪(BAStation;美国马Scanalytics, Billerica)。与ET-1探测后,ECE-1或等一个受体的互补,条纹和reprobed膜32P-labelled 28 s核糖体RNA (rRNA)使用互补脱氧核糖核酸是一个积极的控制。大量的ET-1 ECE-1,等一个受体信使rna表达的比率ET-1, ECE-l或等一个受体信使rna 28 s rRNA。
统计方法
数值数据表示为±sem。统计分析的免疫组织化学评分和autoradiographic测密度术是由单向方差分析(方差分析)。的假定值< 0.05被认为是显著的。
结果
测量心室重量显示RV / LV + S比率在控制老鼠,0.31±0.03、0.33±0.01、0.36±0.01、0.38±0.01、0.61±0.03在缺氧大鼠暴露于0.5,3、7和14天分别控制与7和14天,p < 0.05, n = 4 - 6)。弹性van Gieson染色组织学检查发现在大鼠暴露于低氧7和14天也符合先前的报道的缺氧性肺动脉高压模型,这是一个渐进的内侧增加壁厚和逐步扩展的肌肉分解成更小的动脉23。结果表明,肺动脉高压的重要程度和血管重塑发达后7和14天暴露于低氧(p < 0.05)。
利用北部污点分析检测ET-1 mRNA表达的变化,ECE-1和等一个受体在大鼠肺组织缺氧(图。1⇓)。2.3 kb preproET-1 mRNA转录表达在正常和hypoxia-exposed鼠肺。与控制的老鼠相比,比ET-1 mRNAto 28 s rRNA大约是双重的更高的0.5天暴露于低氧后,然后减少接触后3天,有增加了1.7和2.2倍比7和14天曝光后,分别(图2所示⇓)。4.4 kb乐队ECE-1发现在控制和hypoxia-exposed鼠肺(图。1⇓)。ECE-1 mRNA比28 s rRNA倾向于增加0.5分,3天,之后略有下降7和14天曝光,但变化不显著(图2所示⇓)。
的等一个针对受体探针杂交与5.2和4.3 kb乐队(图。1⇑)。有80 - 100%的比率增加一个受体信使rna 28 s rRNA暴露于低氧后,虽然短暂的下降比率在3天观察(图。2⇑)。
在正常大鼠肺,一个微弱的免疫反应性大ET-1大型肺动脉内膜中发现(图3⇓)。一定数量的大ET-1免疫反应性观察肺小动脉内膜和媒体的< 200µm ED(图3 e⇓)。大ET-1沿轴向的分布途径远端肺动脉是主要的部分。暴露大鼠缺氧后7 - 14天,有免疫反应性的增加大ET-1大型肺动脉内膜和媒体和媒体的小肺动脉(无花果3 b⇓分别为,3 f)。大ET-1似乎表示优先在媒体上比小肺动脉内膜,由不同模式的免疫染色证实为特定VCAM-1内皮(图3 g⇓)。半定量的分析显示大ET-1增加了三倍,500 - 1000年的肺动脉µm ED,肺动脉和双重的60 - 200 7和14天后µm ED暴露于低氧(图4所示⇓)。
微弱的ECE发现免疫反应性的大型和小型肺动脉内膜和媒体控制老鼠(无花果。5 a, c⇓分别)。本地化的ECE肺动脉似乎不同于大ET-1;如。ECE内膜表达更丰富的媒体。ECE似乎一致的分布沿轴向通道控制肺动脉的老鼠。暴露于低氧7和14天后,ECE的表达增加内膜和媒体的大型和小型肺动脉(无花果。5 b和d⇓分别)。ECE的免疫反应性增加了三倍的肺动脉2.5 500 - 1000年,µm ED和60 - 200µm ED暴露于低氧后14天(图6所示⇓)。等一个受体是容易在媒体上表达了大型肺动脉,而小染色发现小肺动脉控制鼠肺(图7 a和c⇓分别)。与大的我,等的分布一个沿着轴向通道受体肺动脉是占主导地位的近端部分。有一个显著增加等的免疫反应性一个受体在暴露后的远端肺动脉段大鼠缺氧7和14天,而没有特别的变化是观察到的近端部分(图7 d和b⇓分别)。的免疫反应性等。一个受体增加4 - 5倍,肺动脉的60 - 200µm ED暴露于低氧7和14天之后,分别(图8所示⇓)。
观察α-SM肌动蛋白免疫反应性的大小控制鼠肺动脉(图9 a和c⇓分别)。按照大ET-1 upregulation ECE、等一个受体肺动脉的远端部分暴露于低氧后,对α-SM肌动蛋白免疫反应性也在媒体上增加肺动脉(图9 d⇓)。有进步提高免疫反应性α-SM肌动蛋白在60 - 200的肺动脉µm ED和达成的双重曝光后大鼠缺氧为14天,而其表达稍微增加了500 - 1000年在肺动脉µm ED(图10所示⇓)。
讨论
肺血管床被认为是肺ET-1生产的主要来源。虽然人们普遍认为我主要在血管内皮细胞产生,几项研究表明,主要培养肺动脉平滑肌细胞分离表示和ET-1生产在体外5,24。研究表明,大ET-1和ECE中的在活的有机体内在肺动脉内膜和媒体在正常和缺氧条件。有趣的是,本地化的大ET-1更加突出在媒体上而不是在内膜远端肺动脉段占主导地位时的内膜近端部分。数据显示,平滑肌细胞,内皮细胞,似乎在肺动脉ET-1的重要来源。结果符合最近的一份报告,肺动脉平滑肌细胞分离的羊ET-1和ECE表示25。因此ET-1合成是由同步表达和对应于本地化ECE及其底物大ET-1内皮细胞和平滑肌细胞。因为我是假设行动主要是当地一个调制器的血管语气和ET受体表达内皮细胞和平滑肌细胞1,2肺动脉,ET-1合成可能发挥自分泌和旁分泌作用在正常条件和在缺氧肺动脉高压的发展。
自从肺动脉床是复杂的区域差异在两种结构和功能,必须考虑ET-1及其受体的分布在肺动脉系统评估的精确作用等1,2,26。然而,很少有研究关注ET-1沿轴向的分布肺动脉的途径。在目前的研究中,大主旨的分布,ECE、等一个受体在正常和缺氧肺动脉条件了。一起在之前的一项研究中作者、大ET-1和分布等一个和等B沿着轴向通道受体肺动脉的示意性地总结了图11所示⇓4。控制老鼠,大ET-1是不同的分布等一个;大主旨表达与主要分布在远端肺动脉段,虽然等的分布一个受体是占主导地位的近端部分。与等一个受体的分布等B媒体(ET受体B2受体)是big-ET-1相似。这些发现表明,ET-1-induced肺阻力动脉血管收缩是施加等B受体而不是等一个受体在正常情况下。观察是一致的与前面的药理研究利用小肺动脉与正常大鼠等B受体激动剂是更有效的比ET-1引起血管收缩。等一个受体拮抗剂对ET-1-induced血管收缩的影响不大1,27。相反,等一个受体拮抗剂阻止ET-1诱导血管收缩主要利用大鼠肺动脉28。
ET-1和ET的表达一个受体信使rna在肺增加0.5天暴露在缺氧和有一个持久的海拔在7和14天,虽然减少了瞬态mRNA表达检测3天。虽然下降的原因还不清楚,这可能反映了降低nonvascular网站的表达式。此外,一部分ET-1 mRNA表达的变化可以归因于的上皮细胞的基因表达6。最近的研究显示各种机制的应对缺氧。例如,低氧诱导因子(HIF) 1, loop-helix-loop转录因子,transactivates基因编码的蛋白质如促红细胞生成素、血管内皮生长因子,诱导一氧化氮合酶,参与体内平衡对缺氧的反应。最近,HIF-1绑定缺氧反应元素被确认在5′侧翼序列的ET-1基因29日。因此早期增加ET-1信使rna可能部分通过HIF-1应对缺氧诱导。
暴露于慢性缺氧与伴随的免疫反应性的增加大ET-1 ECE、等一个小肺动脉的受体在媒体上。这些发现支持北方污点分析证明持续增加的mRNA表达的表达ET-1和等一个受体7和14天后缺氧。结果表明ET-1-induced肺阻力动脉紧缩行动是对通过等一个受体而不是等B2受体在缺氧状态。此外,增加big-ET-1和ECE表达与ET相伴一个受体在肺阻力动脉血管重塑中发挥重要作用,原因如下。首先,ET-1已知为平滑肌细胞具有促有丝分裂的活动等一个受体(1 - 3)。第二,见α-SM肌动蛋白的免疫组化染色,两大ET-1和空间定位等一个受体引起的缺氧大致接近平滑肌细胞增殖的地方主要是接触后发生缺氧。最后,时间的这些变化还互相通信。相比之下,尽管大upregulation ET-1和ECE大肺动脉暴露于低氧后,等一个受体没有显著增加平滑肌细胞在相应的网站4。这可能的原因之一的平滑肌细胞增殖程度不太明显的近端部分相比与远端肺动脉段。因此,先前的报道,目前的数据表明,并发upregulation ET-1和等一个受体是至关重要的对肺动脉平滑肌细胞的增殖与慢性缺氧有关。虽然封锁ET受体是一种有效的治疗缺氧性肺动脉高压,抑制ET-1 ECE抑制剂的合成可能防止血管重塑和提供另一个选择与慢性缺氧相关肺动脉高压的发展30.。
vasocostriction自血管紧张素ⅱ是一个重要的中介和血管细胞生长,当地表达血管的血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素ⅱAT1 at₂受体可能与缺氧肺动脉高压的发展。显著的纵向变化在ACE表达正常肺脉管系统演示,水平最高的发现在小肌肉和呼吸细支气管动脉与终端31日。ACE表达增加检测动脉内皮或墙壁的小肌肉缺氧肺动脉高压的动物模型和临床病例主要和次要的肺动脉高压31日,32。此外,慢性低氧诱导远muscularization与at₂和AT1受体的表达明显增加,在大鼠实验模型33。这些观察表明,局部肾素-血管紧张素系统,以及系统,肺阻力动脉也会导致缺氧肺动脉高压的发展。内皮一氧化氮(NO)、内皮产生的另一个重要的平滑肌肉张力调节器是没有合酶(以挪士)。在常氧大鼠,以挪士是表达内皮的肺动脉阻力和管道34。虽然以挪士表达增加缺氧暴露2天后,仍高在7和14天暴露在导管动脉,表达逐渐增加后7和14天暴露在阻力动脉34,35。这些发现表明,老年病以挪士的阻力动脉可能修改等,肾素-血管紧张素系统介导的血管重塑35。
总之,endothelin-1合成在平滑肌细胞以及内皮细胞在大鼠肺动脉。大endothelin-1的分布、内皮素转换酶和内皮素A和B受体似乎沿着轴向不同肺动脉的通路,这异质性可能发挥重要作用在肺循环的规定在正常和缺氧条件。
确认
作者要感谢k Tanzawa(生物研究实验室、制药有限公司,东京,日本)提供单克隆anti-ECE抗体和k .福田(药物代谢与药物动力学研究实验室、制药有限公司,有限公司)为疣状的建议。
- 收到了2000年8月28日。
- 接受2001年3月2日。
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