摘要
慢性阻塞性肺疾病(COPD)以慢性炎症为特征。这很可能是环境和遗传因素复杂相互作用的结果。由于肺表面活性剂成分在正常肺功能、先天性宿主防御和肺部炎症中发挥重要作用,本研究调查了表面活性剂蛋白基因参与某些COPD病例的假设。
在COPD患者(n=97)和吸烟者(n=82)或非吸烟者(n=99)中进行表面活性剂蛋白(SP)-A、SP- b、SP- b连锁微卫星和SP- d标记等位基因的基因型分析。进行单因素和多因素logistic回归分析。
COPD与吸烟者之间的回归分析结果显示,基于比值比(OR >2.5),存在多个COPD易感等位基因(AA62_A, B1580_C, D2S388_5)。该模型对COPD发展的预测能力较好(c=0.926)。等位基因(B1580_C和D2S388_5)和等位基因-环境(即吸烟)相互作用被检测。当吸烟者对照组与非吸烟者对照组比较时,标记基因D2S388_5似乎是吸烟独立的(p=0.874),而标记等位基因AA62_A (p=0.045)和B1580_5 (p=0.007)是吸烟依赖的。男性的风险较高(OR=6.05, p=0.001),且吸烟(>50包·年)-1)增加风险(OR=5.38, p=0.007)。男性和SP-B基因座侧翼等位基因与更严重的病例相关(1秒用力呼气量/用力肺活量⪕40%)。
目前的结果表明,表面活性蛋白等位基因可能有助于预测慢性阻塞性肺疾病的亚组和/或识别可能用于治疗干预的疾病亚组。这些观察结果现在应该在根据严格的流行病学标准设计的更大的研究中得到证实。
本工作得到了NIH R37 HL34788和宾夕法尼亚州立大学医学院的一般临床研究中心支持。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一个主要的医学问题,也是成年人发病和死亡的主要原因。该病的特点是慢性支气管炎、肺气肿或两者同时引起的进行性气流阻塞1,部分COPD患者以气道疾病为主,其他患者可能以实质疾病为主。尽管迄今为止发展为慢性阻塞性肺病最重要的危险因素是吸烟,但只有10-20%的烟瘾重的吸烟者发展为慢性阻塞性肺病1那2,表明其他环境或遗传因素也会导致慢性阻塞性肺病。环境风险因素包括儿童呼吸道感染、职业暴露、环境空气污染、低出生体重和饮食3..
用于遗传易感性因素证据来自双胞胎的研究导出的何处吸烟肺功能反应进行了研究4.以及显示COPD在家庭中聚集的研究5..慢性阻塞性肺病的遗传危险因素可能包括α遗传缺陷1-抗胰蛋白酶在Z等位基因个体中的作用6.,这是罕见的,并且仅解释了COPD病例的非常小的比例(<1%)1.外生酶的遗传多态性7.和维生素d结合蛋白8.似乎分别与慢性阻塞性肺病风险的增加或降低有关。
尽管肺表面活性剂或其成分有可能是COPD发病机制的贡献者,但在这方面的研究很少。肺表面活性剂是一种脂蛋白复合物,对正常的肺功能至关重要,表面活性剂或表面活性剂的组成部分在细支气管稳定、固有宿主防御和肺炎症过程的调节中发挥作用9..表面活性剂蛋白(SPs)在表面活性剂的功能、结构和代谢中起着重要作用9.SP-A和SP-D参与宿主防御和/或肺炎症过程的调节。
人类SP-A位点位于10号染色体上,由两个转录方向相反的功能基因组成10.人类SP-D与SP-A位点相连,位于离SP-A2基因约80-100 kb的着丝粒近端10.每个SP-A基因都表征了许多等位基因。SP-A1基因最常见的等位基因是6a,6a26,3.6,4.SP-A2基因是1A, lA0.1,11,21,3.拉5.11-13(未发表的观察)。SP-A1和SP-A2等位基因之间的功能差异,以及各基因等位基因之间的功能差异已经被证实在体外表达人类SP-A等位基因14.此外,剪接变异和/或多态性在5 '12这些等位基因的3 '非翻译区域分别指向调控差异15.SP-D也有多个多态性13SP-D等位基因以及SP-A等位基因与肺结核之间的联系已经被观察到16.人类SP-B位点位于染色体2p12-p11.2上。SP-B有许多多态性特征,其中一些与疾病有关17-20..此外,若干个微卫星标记侧翼的SP-B基因座的已被表征21.
由于慢性阻塞性肺病的特征是慢性炎症和肺功能异常,可能是环境和遗传因素复杂相互作用的结果,本报告通过评估表面活性剂蛋白标记等位基因的相关性,研究了表面活性剂蛋白的遗传变异是否有助于慢性阻塞性肺病的发生。等位基因关联可能有助于从基因上识别更同质的COPD亚组,以研究COPD发病机制,和/或研究对治疗干预的反应。
患者和方法
学习人口
这项研究是在呼吸系统疾病在墨西哥城国立研究所(核能研究所)进行,根据人体受试者机构协议。核能研究所是健康的墨西哥民族院校之一,是一个三级转诊和研究中心。
根据参与研究的意愿,病人和健康吸烟者按顺序从INER的戒烟计划中登记。有>10包-年吸烟史者,一秒用力呼气量(FEV)1) <70%预测,FEV1/强迫肺活量(FVC) <70%且无哮喘病史的COPD患者(例)。受试者有>10包年的吸烟史,但有FEV1> 70%预测,以及fev1/ FVC> 70%被认为是吸烟者对照。此外,连续的,不吸烟无关健康的血液从献血者核能研究所被列入。在核能研究所输血服务供应来自该患者被招募的地理区域。患者和对照组有> 3个上代出生于墨西哥。
肺功能测试
肺量测定法
FEV1使用涡轮肺活量计(Pony Cosmed Inc., Rome, Italy)测定FVC。根据美国胸科协会(ATS)的标准,在三种可接受的强迫呼气姿势中选择最佳的呼气速度1和FVC同时获得最佳FEV1两种追踪方法中最好的植被覆盖度用于FEV1/ FVC比率1.
在本研究中使用的Pony肺活量计在FVC、FEV的范围/准确度方面满足ATS的设备推荐1,流量范围(0-14 L·s-1)、时间、阻力和背压。此外,在COPD患者中,体体积描画与肺活量测量结果具有良好的一致性,进一步支持了目前的数据。
基于本作者的经验,校准会议,这是由同一个技师每周两次做的读数,有<3倍%的差异。此外,生物控制被使用(技术员一个每周提交两个或三个倍到测试)。从超过一年该控制试验的累积结果表明:在再现性差异<3%。
肺容量和扩散能力
总肺活量(TLC)和残气量(RV)通过使用体积描记获得(MasterLab,Jaegger,法兰克福,德国)。所有受试者以前与测试前的设备熟悉。一氧化碳弥散肺容量(D.L,co)操作,>2试验,⪕5%变异性,被认为是可接受的。FVC < 1l和/或不能听从指示或憋气10秒的患者不接受本试验。FEV的变异系数和类内相关系数1FVC分别为3%和0.98;TLC, RV和D.L、co的含量范围分别为5 ~ 12%和0.90 ~ 0.92。所有肺功能检查均以全杰报告的参考值为准22被使用。
动脉血液气体
这些是通过径向穿刺获得的,而患者呼吸室空气> 30分钟,并在煤气流下测量(IL 1310,仪器实验室,Lexington,Ma,Ma,USA)。
利用基于聚合酶链反应的转化限制性片段长度多态性方法对表面活性剂蛋白- a、-B和-D进行基因型分析
转化的聚合酶链反应(PCR)和转化的限制性片段长度多态性/基因型分析(CRFLP)方法是基于含有单碱基多态性的位点(如果它不代表天然酶识别位点)被转化为a通过简单地使用含有必要的错配碱的PCR引物来限制酶识别位点。因为扩增的片段将含有来自两种等位基因的PCR产物,所以预期在纯合子的情况下为一个或其他等位基因的情况下,PCR产物将通过适当的酶消化或不消化。在杂合子的情况下,将消化一种等位基因,另一种等位基因将保持完整。在消化的PCR产物的电泳和可视化之后,人们可以评估特定个体的特定部位的基因型。对于所有PCR反应,除了SP-B的11 KB片段(见后面),热循环仪,Ericomp TwinblockTM系统使用。对于11 kb,使用了Perkin Elmer Cetus DNA热循环(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。
基因型分析
表面活性蛋白-B连接的微卫星标记
基因分型进行四次(D2S2232,D2S388,(AAGG)N和gata41e01)SP-B侧翼微卫星标记(图2⇑),如前所述20.那21.对于每个标记物,特定的末端标记32采用P-γ三磷酸腺苷引物进行PCR, PCR产物在含甲酰胺的6%聚丙烯酰胺凝胶上进行,凝胶干燥,X-AR胶片曝光。根据上述对照等位基因DNA模式进行等位基因评分21.
表面活性剂protein-D
SP-D基因分型从基因组DNA中扩增出两个片段(376 bp和~ 1 kb)。一个(376 bp)包含密码子AT.G或C.G为氨基酸11 (DA11),另一个含有密码子A.CA或G.CA为氨基酸160(DA160)。下划线的核苷酸多态性核苷酸。如先前所描述担任DA11或DA160位点转换的PCR的模板,每个片段13.
统计分析
基因型数据的分析包括单因素分析和多因素logistic回归分析。三组患者分别为:1)非吸烟者对照组,2)吸烟者对照组和3)COPD患者,均为吸烟者。表1总结了分析中考虑的基因型字段⇓and the location and characteristics of these are depicted in figures 1⇑和2⇑.
单变量分析
两组间等位基因分布比较采用卡方检验(即控制组和COPD组,吸烟者和非吸烟者),除非预期的标记频率太小,在这种情况下使用Fisher’s Exact测试。对于每一个双等位SP-A、SP-B和SP-D标记,也如前所述使用逻辑回归进行分析16,年龄调整,吸烟(>50包·年-1)和性。在这个分析中也评估了等位基因剂量效应,即对一个给定的等位基因来说,纯合子与杂合子有不同的效果。因为只有少数测试对剂量效应有意义,所以推断1个等位基因与2个相同的等位基因具有相同的效果。多等位基因SP-A1、SP-A2标记和微卫星标记与双等位基因标记进行了相似的分析16.
多变量分析
假设等位基因无剂量效应,采用后向选择方法建立显著性水平为0.05的多变量logistic回归模型。进入模型的等位基因是预先选择的,即只有在单变量分析中显示显著的等位基因(p<0.1)被考虑在模型中。性别、年龄、吸烟情况(>50包·年)-1)被迫作为比较COPD和健康吸烟者的模型中的变量,因为进一步的分析表明它们是某些等位基因的混杂物。对于吸烟者和非吸烟者的比较,只包括性别,因为非吸烟者的年龄未知。
结果
慢性阻塞性肺疾病与吸烟者控制
COPD患者和对照吸烟者的临床和功能特征如表2所示⇓,以及包年对COPD患者和非患者的影响(p=0.001)见表3⇓.重型吸烟者(> 50包·YR之间的协会(Chi-Squared 16.9,P <0.001)-1)合并COPD (n=36),无COPD (n=9)。吸烟强度和性别之间的相关性(p=0.012)也被认为是COPD吸烟者或非吸烟者。在COPD组中,吸烟强度和COPD严重程度之间没有相关性,性别和COPD严重程度之间也没有相关性。
单因素分析显示显著差异(p<0.1)的标记等位基因(表4)⇓)纳入多因素分析。一些标记等位基因是显著的。其中包括一颗SP-A1 (AA62_A)、一颗SP-B (B1580_C)和一颗微卫星(D2S388_5)(表5)⇓).根据OR,所有三个标记等位基因,以及性别(男性)、年龄和吸烟(>50包·年)-1)似乎与慢性阻塞性肺病风险增加有关,其范围从1.17倍(年龄)到7.42倍(AA62_A)。在标记位点AA62处有CCA而不是CCG,在标记位点B处有1580 ACT而不是ATT,分别使易感性增加7.42倍和3.65倍。在AA62位点从A到G的转变并没有改变编码的氨基酸,但在B1580位点从C到T的转变使编码的氨基酸从苏氨酸变成丝氨酸,从而消除了一个潜在的n -连接糖基化位点。
当C.-statistic是关于模型预测个体患慢性阻塞性肺病的预期概率的度量值,为0.926,表明这是一个很好的模型。当C.-数据应该在0.5-1.0之间;越大C.t-统计,更好的模型的预测能力将是24.当COPD组与整个对照组(吸烟者和非吸烟者)进行比较时,得到了与前面描述的相似的结果。
等位基因相互作用和混杂因素
当标志物A的存在会影响具有另一标志物b的个体患COPD的易感性时,就存在交互作用。注意,在交互作用分析中,在COPD/吸烟者比较中,性别、吸烟和年龄再次进行了调整。在COPD和健康吸烟者的比较中,B1580_C和D2S388_5之间存在交互作用(p=0.055)。本文研究的两种等位基因的联合存在可能在某些病例中更好地预测COPD(图3)⇓).如果B1580_C和D2S388_5同时存在,COPD的OR值为24.3 (p=0.0004),而两种标志物均不存在(A,图3)⇓).No significant differences were observed for situations B and C in figure 3⇓当两者与A比较时。
基因型和吸烟之间的相互作用也在COPD和吸烟者组中进行了测试,在将包年和个体基因型纳入模型后,没有发现有统计学意义。然而,未能检测到任何显著的相互作用项可能仅意味着基因型与COPD之间的关联不受吸烟数量的影响,但这并不一定意味着基因疾病的关联不能通过吸烟暴露来改变。由于COPD患者和吸烟对照组均暴露于吸烟环境中,后一种可能性无法直接检测,但当COPD患者与非吸烟对照组比较时,有两个不同的等位基因(6A4./D160_G)的显著性(未发表的数据)为这一假设提供了部分间接支持。因此,为了进一步了解目前的研究COPD/对照,对吸烟者进行单因素分析与不抽烟的人C.ontrol was performed (table 6⇓)假设没有剂量效应,对于留在COPD模型中的三个等位基因(AA62_A,D2S388_5,B1580_C)与吸烟者。在调整性别后,吸烟者和非吸烟者之间的等位基因AA62_A和B1580_C的频率有显著差异(p=0.045和p=0.007, or分别为0.337和0.346)。而D2S388_5等位基因频率在这两个对照组中无显著差异(OR=0.94, p=0.874)。这些发现表明,基于本研究使用的标记等位基因的两个对照组(吸烟者和非吸烟者)是不同但重叠的群体。此外,吸烟者和非吸烟者的比较结果表明,D2S388_5标记等位基因是“吸烟独立”的标记等位基因,AA62_A和B1580_C标记等位基因是“吸烟依赖”的标记等位基因,指出了潜在相互作用的复杂性。吸烟如何影响这些标记等位基因还有待确定。
本研究还调查了混杂因素的可能性。混杂因素会导致对OR的偏置估计,但它可能不会影响两组之间OR的同质性。例如,如果不调整混淆器(比如标记B),标记A的OR为3。调整混杂器后,标记A的OR变为5。在这个例子中,3的OR是一个有偏估计。
在COPD/吸烟者的比较中,单因素分析中AA62_A标记等位基因的OR为4.09(表4)⇑),但多变量分析为7.42(表5)⇑),而B1580_C和D2S388_5的or在单变量和多变量分析之间是相似的(表4⇑和5⇑).这些观察结果表明,AA62_A标记等位基因是由一些其它标记(多个)混淆。进一步的分析表明B1580_C可以是用于一个AA62_A混杂因素,但D2S388_5不是AA62_A一个混杂因素。
基于严重程度的慢性阻塞性肺疾病亚组
为了确定标记等位基因是否与COPD的严重程度相关,根据FEV将COPD人群分为两个亚组1/ FVC值。一组为FEV患者(n=46)1/FVC>40%,另一组患者(n=47)伴有FEV1/ FVC⪕40%。进行多因素logistic回归分析,只包括在单变量检验中显示显著的标记等位基因。年龄和吸烟似乎不是重要的危险因素,但性别似乎是重要的。因此,在模型中,性被强制作为一个变量。两个标记等位基因(B_18_C和D2S388_4)以及性别(雄性)均显著(表7)⇓).根据ORs,所有这三个因素与COPD重症病例的相关性约为3 - 4倍。这些结果也在包括表1中描述的所有标记等位基因的多变量分析(未显示)中得到证实⇑,不预先选择显著(p<0.1)标记等位基因。
讨论
作为了解表面活性剂蛋白在慢性阻塞性肺病发病机制中的可能作用的一种方法,本研究开展了病例-对照关联研究,以确定这些标志物在识别易感性增加或降低的慢性阻塞性肺病亚组中的有用性。COPD患者与吸烟者对照比较发现SP-A1 (AA62_A)、SP-B (B1580_C)和微卫星(D2S388_5)标记等位基因可能增加COPD易感性,性别(男性)、吸烟和年龄是COPD易感性的重要因素。此外,某些标记等位基因(B_18_C、D2S2388_4)和性别(男性)与COPD重症病例相关。吸烟者和非吸烟者对照的比较揭示了慢性阻塞性肺病和吸烟者之间的三个显著标记等位基因(AA62_A, B1580_C, D2S388_5)的异同。在某些亚组中,COPD的发展可能需要同时具有“吸烟依赖性”和“非吸烟依赖性”的标志物(表面活性剂蛋白和/或其他)的组合。在本研究中,COPD易感性D2S388_5标记等位基因与吸烟无关,吸烟者与非吸烟者之间无显著差异,而标记等位基因AA62_A和B1580_C是“吸烟依赖”的。因此,表面活性剂蛋白基因标记等位基因单独和/或与其他标记等位基因一起可能有助于识别疾病亚群。这些亚组患者可能为研究COPD亚组发病机制提供足够的遗传同质性,并/或在研究药物反应时的治疗干预研究中有用。
回归分析数据显示,吸烟是COPD的一个重要变量,这与观察到的重度吸烟者(>50包·年)之间的相关性(p<0.001)一致-1)和慢性阻塞性肺病(表3⇑).虽然吸烟是COPD的主要决定因素,但只有一小部分吸烟者发展COPD1那2.FEV正常的吸烟者1炎症增加,但患慢性阻塞性肺病的吸烟者和没有患慢性阻塞性肺病的吸烟者之间这种炎症的特征不同25.遗传因素与吸烟有关26也许未知的遗传因素可能决定哪一组吸烟者对慢性阻塞性肺病的易感性增加。表面活性剂蛋白标记等位基因可能有助于区分这一亚群。通过标记等位基因(AA62_A和B1580_C)识别的吸烟者亚组与缺乏这些等位基因的吸烟者相比,对COPD的易感性增加。
SP-A1 (AA62_A)、SP-B (B1580_C)或SP-B连锁微卫星(D2S388_5)标记位点本身或连锁位点是否与COPD有关仍有待确定。有趣的是,杂合子SP-B小鼠的SP-B含量是纯合子SP-B小鼠的一半,在正常情况下,表现出较小的生理肺异常27.在某些情况下,某些SP-B等位基因可能与肺功能受损有关。例如,与COPD相关的标记等位基因B1580_C在标记位点B1580编码苏氨酸(而不是异亮氨酸)。在这个标记位点上的苏氨酸可以导致一个额外的n -连接糖基化位点。虽然这种变化的功能作用尚不清楚,但可能会影响前体SP-B分子的加工,导致SP-B含量低,进而损害肺功能。相反,SP-A1 AA62_A单核苷酸多态性,存在于等位基因6A中2和63.(图1⇑),并且不改变编码的氨基酸,可能识别AA62_A和其他SP-A1等位基因和/或染色体或等位基因组之间的调节差异,导致COPD。同样,微卫星D2S388标记位点是一个未知的标记位点,而D2S388_5标记等位基因可能与一个导致COPD的基因有关。
SP-A和SP-B在功能上是交互式的,因为两者都是必需的,例如表面活性剂的结构形式称为管状髓磷脂的表面活性剂方面9..某些表面活性剂蛋白等位基因组合的功能可能通过加性和/或上位性相互作用网络严重损害宿主防御和/或肺泡完整性28-30.在分子、细胞或组织水平上。然而,在本研究中,AA62_A(或6A)之间未观察到相互作用2和63.;图1⇑)和两个(B1580_C, D2S388_5)显著标记中的任何一个(未显示),表明一个标记等位基因的存在并不影响具有其他标记的个体对COPD的易感性。相反,吸烟可能对AA62_A和B1580_C等位基因产生影响,因为这些等位基因似乎“依赖吸烟”。尽管潜在的机制尚不清楚,但遗传因素在吸烟中扮演的角色已经被证实了26.
此外,表面活性剂蛋白标记等位基因可能有助于根据严重程度划分COPD亚组。2号染色体上的两个标记等位基因(B_18_C和D2S2388_4)与重症COPD相关。男性也更有可能(OR=3.6)出现严重(FEV)1/FVC⪕40%)COPD亚组,这也与男性之间的强相关性一致(p<0.0001,表2⇑)和慢性阻塞性肺病。与之相关的是最近的一个初步发现SP-B基因的内含子4变体17在德国人群中COPD急性呼吸衰竭的发生率较高。在COPD严重亚组中,这种变异的频率在女性中较高31.这些数据表明,性别在慢性阻塞性肺病中很重要,不同的标记等位基因可能会识别男性和女性加重的严重程度。在COPD严重程度亚组中,吸烟不再是一个变量,这与COPD组中吸烟和基因型缺乏相互作用相一致。这些数据表明,吸烟的数量可能对COPD的严重程度没有影响,但它可能改变基因与疾病的相互作用,通过这种改变,吸烟对具有特定遗传背景的个体的COPD有一定的影响。在这方面,表面活性剂蛋白标记等位基因可能有助于识别COPD亚群。
对于被测试的标记,有一种可能性是某些结果仅仅是偶然的。例如,在表1中考虑的33个标记中⇑,如果每个标记以p<0.05的显著性水平单独检验,则偶然观察到至少一个显著标记的概率为0.82,偶然观察到3个或3个以上标记的概率为0.23,偶然观察到6个或6个以上标记的概率为0.05。表4中分别鉴定了4个和6个标记⇑,卡方检验p<0.05, logistic回归p<0.05。因此,表4中的一些标记⇑可能仅仅是由于偶然,也可能不是。虽然概率(0.23和0.05)很低,说明“机会”因素单独成为主要因素的概率确实很低,但这些观察结果需要根据严格的流行病学标准设计更大的研究来证实。
总之,这些数据表明表面活性剂蛋白在慢性阻塞性肺疾病中的作用,并指出表面活性剂蛋白标记等位基因在疾病研究中的有用性。由于慢性阻塞性肺疾病是一种病因复杂的疾病,可能存在鉴别同质临床亚组进行研究的困难。表面活性剂蛋白标记等位基因可能在这方面有用,并有助于识别一个重要的慢性阻塞性肺疾病亚群。这样一个亚组,连同其他亚组,可以用于药物反应的研究,或其他治疗干预。此外,遗传标记的使用作为附加参数来识别更均匀的子组可能促进机制的研究指定的慢性阻塞性肺疾病发病机制的子组,这可能反过来帮助理解为什么,例如,只有一小部分吸烟者发展疾病。
致谢
作者感谢S. Phillips, B. Phillips和A. Matthews的贡献,感谢S. Myers打出了这份手稿。
- 收到了2000年5月12日。
- 接受2001年5月9日。
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