抽象
人类冠状病毒(HCOV)占普通感冒的15-30%,但只有一个病例报告描述了冠状病毒感染的效果,即人类呼吸上皮的渐近性。
作者研究了HCoV感染对健康志愿者鼻内接种HCoV 229E后纤毛结构和功能的影响。另外四名志愿者被假感染了紫外线灭活病毒。接种前(第0天)和接种后3天(第3天),通过刷下鼻甲获得纤毛上皮。使用数字高速视频摄影确定纤毛跳动频率并分析跳动模式,以确定运动障碍的证据(0=正常,3=严重运动障碍)。透射电镜观察纤毛超微结构。在研究期间记录症状日记。
所有接种HCOV的受试者,包括三个没有产生上呼吸道感染的症状的三个受试者在第3天发生了呼吸上皮的破坏。虽然第0天之间的平均睫状拍频率没有差异(11.3 Hz(95%置信区间(CI):8.6-14.0)和第3天(9.4Hz(95%CI 7.2-11.6)),在0天之间的睫状体止吐瘤评分中显着增加(p <0.05)(0.2(95%(95%)CI 0-0.5)和第3天(1.1(95%CI 0.5-1.7)。在假感染的受试者中,在第0天和第3天之间没有发现上皮完整性或睫状体结构和功能的差异。
接种与人冠状病毒的健康志愿者导致纤毛上皮和睫状体瘤的破坏。这可能会损害粘蛋白清除。由于人冠状病毒感染,呼吸上皮的损伤可能会出现没有明显的临床症状。
这项工作得到了囊性纤维化的信托,梅索医疗基金会和国家哮喘活动。
“普通感冒”是一种普遍公认的短期疾病,主要症状包括上呼吸道,通常以鼻腔症状为主。了解病毒和上皮细胞之间的相互作用是确定症状产生的机制的一个重要步骤。呼吸道上皮结构损伤1-3.和异常纤毛功能1那4.那5.在病毒感染期间可能会破坏粘液膜4.那6.,有助于鼻排放和障碍的症状。虽然一些受感染的志愿者患有鼻塞和放电,但相同数量的感染受试者没有明确的症状。这仍然不清楚这一点7.。
人冠状病毒(HCOV)是普通感冒的第二个最普遍的原因。他们占熟悉病毒感染的15-30%8.并可能导致抑制症状的呼吸系统疾病如哮喘9.。关于呼吸上皮的HCOV感染效果的数据令人惊讶地稀疏。识别HCOV的初始方法体外气管器官培养物,其中困难地检测到感染。从上皮表面反射的光显微镜被用作睫状体活性的指示,随着病毒感染的结果测量而丧失的光反射10。其他数据包括在为睫状体肽的2岁女性中,HCOV感染的电子显微镜对电子显微镜感染的偶然发现。令人兴趣的是,这种感染无症状无症状,在活组织检查或之后,没有常见感冒的迹象11。
在本研究中,HCOV 229E(美国型文化收集,Rockville,MD,USA),冠状病毒的两种主要血清型核算中上呼吸道感染12,被用来接种健康的志愿者。目的是确定HCOV感染对鼻性上皮超微结构和鼻纤硅的超微结构的影响。
方法
主题
招募了15名成人志愿者(11名男性,四名女性),没有鼻腔或呼吸系统疾病。年龄从18-35(中位数22)YRS。没有任何受试者服用鼻药,没有在6周内患有症状上呼吸道感染。该研究获得了莱斯特郡伦理审查委员会的批准。
人冠状病毒接种
根据人胚胎肺成纤维细胞的良好实验室实践标准培养HCOV 229E(美国型文化收集)。如前所述制备接种物13并根据Gwaltney的标准进行安全测试等等。14。接种物由1ml HcoV 229E悬浮液的等分试样(200%50%组织培养剂量(TCID50.)每mL),其储存在-70℃。如前所述,有11个受试者(九个雄性和两名女性)接种活性病毒7.。简而言之,随着志愿者的头部延伸到45°,将0.5毫升病毒灌输到每个鼻孔中。
除了病毒抗原外,接种物还可能含有从受感染的培养细胞中释放出来的其他小蛋白质,如细胞因子。这些蛋白质可能会干扰感染过程,甚至产生炎症反应。为了控制这一点,如前所述,四名受试者接种了经紫外线灭活的病毒15。通过用活性病毒接种人胚胎肺成纤维细胞中的培养物证实灭活。具有活性病毒的细胞在10天内发育完全的细胞病变效果,而紫外线灭活病毒的细胞显示出培养物停止时18天没有细胞病变效果。
感冒评估
症状日记基于杰克逊使用的日记等等。16记录上呼吸道症状(鼻窦,鼻堵塞和打喷嚏)和全身症状(头痛,不适和寒冷)。根据严重程度,每种症状得分于0-3点。杰克逊的标准等等。16然后通过先前验证的方法进行修改17为了将志愿者用上呼吸道分数分类到以下组:明确的寒冷(在接种后至少两个连续的日子至少两个连续两天的零基线的得分≥2以上);可能的寒冷(在零基线超过零基线的边际增加或≥2的分数在2-6天至少两个连续的日子上以上至少两个日子);没有寒冷(无症状)。
从第3天突出的鼻灌洗中萃取的病毒核糖核酸(RTN)逆转转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)的实验室确认是通过从第3天的鼻灌洗液中获得的。这遵循了先前建立的方法13。
睫状体结构和功能评估
在病毒接种和接种后3天,通过用2mm细胞学刷(BC-15C,South-On-Sea,UK)刷新下鼻鼻甲获得纤毛化样品。18。已发现这是纤毛上皮反复采样的理想场所3.。选择第3天,因为前两天的病毒感染的研究发现几乎没有效果,并且在第4天对呼吸上皮的变化非常重要2。鼻刷置于199 (25 mM羟乙基哌嗪乙烷磺酸,Earles盐,l-谷氨酰胺(pH 7.3))中,其中含有抗生素溶液(链霉素50µg·mL)-1,青霉素50μg·ml-1,Gibcobr Life Technologies,佩斯利,英国)。
透射电子显微镜
通过鼻泌刷涂获得的组织在Sorensons磷酸盐缓冲液中固定在2.5%谷氨酸中48小时,然后固定在1%锇氧化锇中。在蒸馏水中漂洗后,将细胞嵌入45℃下在2%液体琼脂中嵌入,并允许固化。将其通过标准技术加工成树脂。将超薄部分切割为70nm。这些被收集在200目薄棒状铜网上,并染成1%乙酸铀酰染色并在Reynolds铅磷酸盐中染色。然后通过透射电子显微镜检查部分。
以盲目的方式评估纤毛的上皮,用于上皮和睫状体超微结构的变化。首先通过评估细胞类型来评估上皮完整性。纤毛细胞,粘液细胞和死细胞的数量表示为检查所有细胞的百分比。其次,使用曾荫描述的评分系统量化组织的破坏和损伤等等。19。简而言之,对以下参数进行评分:从纤毛细胞中丧失纤毛:0(完全纤毛),1,2,3(3 =少数纤毛可见);从上皮边缘投射细胞:0(正常对准),1,2,3(3 =从边缘突出但与其他上皮细胞有一些接触);细胞质膨胀:0(不存在),1(次要),2(主要);线粒体损伤:0(不存在),1(现在)19。
通过检查微管和Dynein臂缺陷的睫状体超微结构来评估对单个纤毛的损伤。通过测量睫状体取向来确定细胞内单个纤毛的对准20.。
计算含有纤毛,细胞投影,细胞质膨胀和线粒体损伤的细胞数量的百分比。类似地,计算具有微管或Dynein臂缺陷的细胞的百分比。
睫毛击败频率和节拍模式
通过两个相邻的盖子滑动将盖滑动和玻璃滑块分离产生的腔室中的上皮悬浮的上皮条悬浮在腔室中。将载玻片放置在Leitz的加热阶段(37°C)上,安装在抗振塔(Wentworth Laboratories Ltd,Sandy,Bedfordshire,英国)。使用×100干扰对比度镜片检查标本。研究了长度的不缺失的纤维条带的>50μm。
使用数字高速摄像机(Kodak Motioncorder 1000,柯达,San Diego,CA,USA)以400帧·s的速度记录击打丝状边缘-1,使用如前所述的4,000英寸的快门速度21。简单地说,摄像机允许视频序列以降低帧率或逐帧重放。这样就可以在每根纤毛的跳动周期中观察到它们的精确运动。从每个纤毛边缘的不同区域采集10个纤毛跳动频率(CBF)读数。
为了评估睫状拍图案,每个边缘被赋予基于以下评分系统的分数。正常协调的睫状体在前向后运动中的速度均得分为0.玉米菌,似乎击败了动员行动的程度,根据边缘沿边缘的异常搏动程度(沿着边缘的所有纤毛跳动3)的程度得分为1-3。
CBF直接确定。鉴定了击打纤毛组,并记录完成10个周期所需的帧数。通过简单的计算将其转换为CBF(CBF = 400 /(10次拍摄号码帧)×10)21。
统计分析
每个组的平均值和95%置信区间(CI)计算为测量所有参数的第0天和第3天计算。计算基线的平均变化(第3天0)和95%CIs。不包括0的结果表明第0天和第3天之间的差异,通过配对样品T检验分析。使用Wilcoxon签名等级测试来比较第0天和第3天的动态节拍模式。
未配对的T检验用于将表达的差异分组为来自两组基线的变化即:(第3天第0天)电晕对照(第3天到第0天)假。这表示为组间平均差异和95% CI。
结果
接种HCOV的11种志愿者中有三种没有寒冷的症状。四个开发了一个明确的寒冷,四个有“可能的冷”。开发了明确或可能感冒的志愿者的患者,所有患有温和的上呼吸道症状。这些受试者中的六个头痛,四次咳嗽和两次发烧。四个具有明确的感冒和四种具有可能感冒的四种中的三种具有在鼻分泌物中检测到的病毒RNA。在四个志愿者中未检测到病毒RNA,没有寒冷的症状。接种UV灭活病毒的两个受试者在接种后2天开始2天的持续温和地阻断鼻子持久。本集团没有报告其他症状。
所有接种活性HCOV的受试者,包括三个没有发展上呼吸道感染的症状,在第3天的呼吸上皮产生了呼吸上皮。与活性病毒接种之前和之后的八个配对样品是从11名志愿者获得的用于透射电子显微镜和睫状函数的比较。
表1⇓总结了细胞类型中所见的变化。与HCOV接种后,纤毛细胞比例显着降低(P <0.05),死细胞比例增加(P <0.05)。在粘液细胞的百分比中没有看到任何变化。
通过定量纤毛损失,细胞投影,细胞质膨胀和线粒体损伤的上皮破坏和损伤全部在第3天显着增加(P <0.05)(表2⇓图。 1a and 1b⇓)。
评估纤毛超微结构(表3⇓),在第3天内发现了微尘异常的少量增加(P <0.05)。对于Dynein臂缺陷和睫状体取向之间的第0天和第3天之间没有发现差异。在第0天和第3天的平均CBF之间没有看到显着变化(表3⇓),但纤毛被发现在第3天击败了动达(P <0.05)。
从志愿者接种uV灭活病毒的志愿者的样品中没有发生结构或功能的变化(表1-3⇑⇑⇑)。受到活性HCOV或UV - 灭活病毒接种的受试者之间的基线变化的比较显示,组之间的显着差异:纤毛细胞的丧失,死细胞增加,含有纤毛的细胞,细胞投影,细胞质膨胀,线粒体损伤,线粒体损伤,微管缺损和睫状体障碍(表1-3⇑⇑⇑)。
讨论
目前的结果表明,鼻腔接种HCoV会对呼吸道上皮造成严重损害,即使没有明显的感冒临床症状。在所有接种了活动性HCoV的志愿者中发现了鼻上皮破裂和纤毛运动障碍的证据,即使有3名受试者没有感冒症状。假感染灭活病毒的受试者未见上皮损伤。假感染后损伤的缺乏表明,组织损伤是感染过程的结果,而不是对病毒抗原的免疫介导反应,或接种物中存在的细胞因子的影响,因为它只发生在给药时活病毒。
虽然上皮的分析是盲目的,但接种没有盲目或安慰剂控制。然而,鼻测量表明,该模型成功,在所有接种的人和大多数人感冒的临床症状中都有明确的上皮损伤证据。选择RT-PCR作为鉴定HCOV的方法,因为它已被证明比血清学或培养技术更敏感13。回想起来,血清学和细胞文化可能提供了有用的额外的感染证据。尽管在所有情况下,尽管在所有情况下,但仍仅为接种的比例阳性。对RT-PCR测定期间产生的样品,样品质量和假阴性结果的可能性有关的原因可能与样本,样品质量和假阴性结果的可能性有关。
尽管只有4名志愿者被假感染,但我们发现接种了活动性HCoV的志愿者和假感染的志愿者之间有明显的差异。在假感染组,接种3天后没有上皮损伤或纤毛运动障碍的证据。这表明病毒抗原或接种物内的介质不负责上皮细胞的变化发现。活动性病毒感染似乎是上皮细胞损伤发生所必需的。
Bende等等。7.对24种成人志愿者进行的生理测量,其中患有HCOV,其中13个临床症状,八个没有明显的临床症状,但发生了病毒脱落,三个没有感染。鼻气抵抗力和鼻粘膜的温度在有症状和没有症状的情况下增加,这两组均表明肿块炎症。鼻子血液流动在鼻子和鼻粘液分泌中仅增加在有症状的那些中。这些结果与本发现一致,即可能在接种患有HCOV的志愿者中发生炎症过程,该志愿者没有患有寒冷的临床迹象。
公开病毒上呼吸道感染通常延迟鼻粘片清除率5.。盲目的上皮和动员没有动达的纤毛缺失可能是这一点的主要因素,但粘液流变的变化也可能是重要的6.。在本研究中,症状持续时间在接种后第4天达到高峰,第7天消失。本研究仅提供接种后3天的数据。暴露于冠状病毒感染后上呼吸道上皮恢复正常所需的时间尚不清楚。在自然获得性感冒中,大多数患者的上皮细胞在3周后恢复正常1,而病毒感染后几周粘液间隙可能是异常的5.。
使用数字高速视频系统进行纤毛分析的一个主要优势是能够播放纤毛运动的慢动作,允许测量它们的节拍频率和评估它们的节拍模式。在接种HCoV 3天后,尽管记录到跳动频率在正常范围内,但运动障碍纤毛明显增加。CBF的读数是在生理温度下进行的,纤毛跳动在> 11hz。如此高的频率意味着,如果没有观看慢速运动的能力,通常是不可能评估运动障碍的。需要好好等等。5.在自然获得的普通感冒之后研究了22°C的睫状体功能。在这个温度下,纤毛在其正常速率的一半击败,允许更容易地检测到节拍模式的毛重变化。他们还注意到在感染的前几天最大的睫状体的大幅增加。其他人也发现CBF,在生理温度下测量,在病毒感染后的正常范围内,但它们没有评论止咳碱基的存在,可能由于快速拍频而错过了睫状体障碍症。2。
电子显微镜表现出显着的上皮完整性的损失,并且在冠状病毒接种后纤毛细胞数量非常显着降低。在与其他病毒的鼻感染后已经记录了类似的结果5.那6.那22那23。
在第3天,作者发现外周和中央微管异常的少量增加。这少于先前在儿童自然获得的病毒感染中报道的3.虽然该研究中没有患者没有冠状病毒感染。在30张培养的培养病毒感染,卡尔森中的22集中等等。3.发现微训练添加和删除。在剩下的8例案例中,上皮细胞异常和纤毛细胞的损失太严重,以允许评估睫状体结构。拍摄频率或对睫状体障碍的分析并未探索3.。
尽管上皮损伤,本研究中,在本研究中,在电子显微镜下没有观察到恶性病毒。这是在普通感冒的发作期间与人鼻腔和支气管上皮的电子显微镜的其他报道保持在。1那3.那24那25。相比之下,有许多已发表的报告体外冠状病毒感染细胞26-28。afzelius.11记录了一个2岁的女孩鼻呼吸上皮细胞的单一案例,其2岁的女孩没有常见感冒的症状。这是对排除原发性睫状体障碍诊断的活检的偶然发现。可以在纤毛细胞内部和外部看到病毒粒,但不在粘液细胞内。有些病毒群体位于微绒毛杆附近,在顶端电池膜中的袋中有其他动物,表明微毛虫可能是第一次接触的部位。
由于病毒感染,可能发生呼吸上皮的损伤,而没有明显的临床症状。这可能对肺病有影响;例如,在慢性化脓性疾病中,在症状和无症状病毒感染后肺功能显着降低29。病毒对人冠状病毒感染呼吸道上皮细胞的损伤机制有待进一步研究。
致谢
作者谨此感谢J. Thompson统计高级讲师,位于莱斯特大学的统计资格,用于统计建议。作者还感谢莱斯特皇家医务室的病毒学实验室,以支持他们的支持。
- 收到2000年10月26日。
- 公认2001年6月1日。
- ©ers Journals Ltd