文摘gydF4y2Ba
endogenously-released介质的影响和激活嗜酸性粒细胞气道腔和被动致敏的影响anti-immunoglobulin (Ig) -E-induced收缩反应被videomicrometry调查。gydF4y2Ba
人类支气管部分内部直径2 - 3毫米,250年µL汉克的平衡盐溶液放在microtitre盘子,被数字化图像分析监测和记录。气道准备展出自发缩小(平均±sem−33±5%的腔的面积)。切除支气管上皮细胞几乎完全阻止spontaneuous缩小的发展(−6±3%;p < 0.001)。添加platelet-activating因素刺激人类嗜酸性粒细胞支气管部分导致气道腔明显缩小(−39±9%;p < 0.05)。被动致敏诱导高反应性多克隆ige (−35±8%;p < 0.01)。gydF4y2Ba
得出videomicrometry适用于研究人类的航空公司和炎症细胞之间的相互作用,以及平滑肌上被动致敏反应的影响gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba,没有实施预加载。在这种情况下,人类航空公司展出的自发减少气道腔随着时间的暗示作用epithelium-derived介质因为自发发展的基调是上皮细胞相关的。gydF4y2Ba
这项工作是由授予德国外交部的研究和技术(BMFT 01客9301)和美国国立卫生研究院(hl - 46368,再保险公司hl - 56399, NIAID v01 - ai - 34566)。gydF4y2Ba
对气管平滑肌的响应性的研究对发展的理解很重要的机制参与支气管狭窄支气管哮喘等病症。气道反应可以研究gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba器官浴在静力条件下,静息张力是强加给组织和肌肉力的变化对张力测量gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,或等渗条件,一个固定的力是对组织和测量其长度的变化gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。然而,气道平滑肌收缩gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba既不等距或等渗,而是auxotonic,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba收缩导致的弹性或粘弹性负载下附件的平滑肌组织相邻结构的变量服从。此外,实验在等距和等渗条件下通常在器官浴进行相对大量的,结果在一个广泛的内生因素和稀释授予要求大量的药理物质或生物刺激如孤立的细胞。gydF4y2Ba
小型系统已经开发监测气道腔的面积孤立的变化实时准备直接使用电脑videomicrometrygydF4y2Ba3gydF4y2Ba。这种技术允许测定收缩和扩张的航空公司在一个很小的孵化quasi-auxotonic条件下体积gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
气流限制通过减少气道腔基线条件下,通过夸张的气道狭窄,以应对bronchospasmogenic刺激哮喘和被认为是重要的特性的结果,以及其他因素,嗜酸性气道炎症和sensitization-induced平滑肌功能的改变。由于气道基调是由复杂的交互本地产介质的各种炎症细胞,其中一些被认为在哮喘中发挥重要作用gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,大量孵化器官浴可能不足反映了生理状态由于极度稀释的内生因素。因此,当前作者调查的影响endogenously-released介质和激活嗜酸性粒细胞气道腔除了被动致敏的影响在anti-immunoglobulin (Ig) -E-induced收缩反应使用videomicrometry容量系统。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
气道的准备gydF4y2Ba
肺切除材料从癌症病人胸手术了。宏观上正常航空公司内部直径2 - 3毫米,免费肺泡组织,被解剖,放置在含氧(95%氧气,二氧化碳5%)修改柠檬酸缓冲(pH值7.4;4.7 118.4 mM组合:氯化钠,氯化钾,MgSOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba0.6,CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba1.3,KHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba1.2,NaHCOgydF4y2Ba3gydF4y2Ba葡萄糖25.0,11.1)。气道的准备工作是保持在4°C在含氧克雷布斯和第二天使用。gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞隔离gydF4y2Ba
外周血嗜酸性粒细胞是孤立的过敏性,nonasthmatic捐助者如前所述gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。细胞制剂含有92±1%的嗜酸性粒细胞(±sem, n = 11准备从10捐助者)。gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞活化试验gydF4y2Ba
确认由platelet-activating嗜酸性粒细胞刺激因子(空军(1 -gydF4y2BaOgydF4y2Ba-hexadecyl-2-acetyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba-glycero-3-phosphocholine);Calbiochem-Novabiochem GmbH是一家,坏Soden,德国)、超氧化物阴离子(OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba·gydF4y2Ba−gydF4y2Ba代测定超氧化物歧化酶(SOD;从牛红细胞)抑制减少细胞色素c(从马的心),基本上中描述gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。反应混合物含有嗜酸性粒细胞,ferricytochrome c和拥堵(1µM)或控制缓冲孵化在37°c。整除(225µL)撤回在5、10、15、30、45分钟。细胞被离心沉淀(12000×gydF4y2BaggydF4y2Ba为2分钟)和200年灭绝-µl部分浮在表面的测量在96 - 550海里标。细胞色素c还原计算从灭绝的增加相比,控制样本的SOD (30 U·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)添加立即刺激之前。结果表示为每10 nmol细胞色素c减少gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞在15分钟,基于摩尔消光系数21.1×10的ferrocytochrome cgydF4y2Ba3gydF4y2Ba米gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba·厘米gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
被动致敏gydF4y2Ba
支气管一夜之间,戒指被孵化在包含修改后的柠檬酸缓冲管(被动致敏)或缺失(nonsensitized控制)的IgE-rich血清(10% /卷卷),如前所述gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
VideomicroscopygydF4y2Ba
孤立的航空公司被切成戒指∼1 - 2毫米厚,放置在10毫升器官浴含有汉克斯平衡盐溶液(哈佛商学院(Gibco-BRL、Eggenstein、德国),pH7.4在37°C)≥60分钟才被转移到microtitre板井包含哈佛商学院(37°C)。组织被洗了三次,然后转移到包含250井µL哈佛商学院(图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
的)显微图像trans-illimunated段支气管戒指。b) cis-illuminated段支气管戒指的形象。气道腔的面积可以由videomicrometry决定。gydF4y2Ba
横断面图像被俘15分钟后使用徕卡Stereozoom 6显微照相机(,艾伦代尔徕卡微系统公司,新泽西,美国)和日立kp - 501彩色摄像机传输图像松下AG1970录像机,这是连接到个人电脑配备了TrueVision德佳+ 16/32视频数字化板(美国在TrueVision)。随后的录音、井之间满是密封薄膜,以防止蒸发的缓冲区。gydF4y2Ba
常数体液充分捕捉图像至关重要,因为缓冲区的半月板表面microwells充当放大透镜的焦点将体积的变化而变化。因此,初步实验来确定意义的蒸发microwells及其可能的影响时间/气道腔的面积变化的准备。为了这个目的,一个金属环腔的截面积和气道部分记录并行一段时间≤90分钟。金属环和组织样本同样与缓冲完全淹没在测量。gydF4y2Ba
录音的时间点是基于这些初步研究的结果。所有更改的时间/课程腔的地区一个剂量的药物后,车辆或细胞(时间/课程实验)或药物浓度增加的影响(浓度/效应实验)记录。对于这两种类型的实验,计算参考图像的像素数量(时间0)被捕后15分钟第一图像(见前)。时间/课程实验、药物、车辆或细胞应用于组织之后立即。捕获的图像是在5 - 15分钟间隔45分钟(时间5、10、15、20、30日和45分钟)。浓度/效应曲线ige 10范围内gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−5gydF4y2Bamg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba建立了以累积的方式通过添加浓度增加以日志的间隔每10分钟。gydF4y2Ba
由于体液的变化导致图像的放大,变化的总量保持不变的microwell通过删除卷等于随后应用之前的药物和嗜酸性粒细胞gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。控制组织总是并行运行来确定自发的横截面积随时间的变化。这些组织(时间控制)接收缓冲区在最初的下半场平衡时期,当药物或收到的其他组织细胞。结束时,每个实验,证实了组织生存能力的10µM碳酰胆碱(σ化工、Disenhofen、德国)或1µM异丙肾上腺素化学(σ)诱导收缩或放松,分别。gydF4y2Ba
在某些实验上皮的航空公司被机械摩擦的腔的表面准备和抑制管道清洁前切成戒指。实验完成后,epithelial-denuded准备保存了组织学评估上皮的完整性。gydF4y2Ba
测量和分析的结果gydF4y2Ba
准备通过videomicrometry系统的图像记录在录像带,如前所述gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,横截面积的变化确定像素数字使用图像分析软件(摩卡gydF4y2BaTMgydF4y2Ba科学/ SigmaScan®Pro,许可证gydF4y2BaTMgydF4y2Ba美国,芝加哥,IL)。气道狭窄的百分比表示为腔的横截面积的变化从该地区立即记录之前的药物(0),gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba在下半场microwell平衡时期。gydF4y2Ba
所有值表示为均值±表示数量的sem实验用不同个体的组织。统计分析的数据执行时间/课程实验使用成对的或未配对t−测试。一个p < 0.05被认为是显著的。gydF4y2Ba
冻干拥堵的溶解,给的浓度为1毫米,在去离子水15 - 30分钟之前使用和稀释至所需浓度在消息灵通的缓冲区(玫瑰,20毫米;氯化钠,132毫米;氯化钾,6毫米;KHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,1.2毫米;毫克gydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,1.0毫米;CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,1.0毫米;d−葡萄糖,5.5毫米;BSA(分数V粉),0.25% w / V;pH值7.4)。化学碳酰胆碱、组胺(σ)、异丙肾上腺素和多克隆ige化学(σ)是在生理盐水溶解并稀释立即使用前。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
横截面积随时间的变化gydF4y2Ba
五次获得的数据从一个金属环的录音表明,横截面积的测量没有显著影响蒸发的时间60分钟(图。2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。失去反应缓冲区在1 h为8.7±0.4µL·gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,总量的3.5%。gydF4y2Ba
![图2. -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/19/6/991/F2.medium.gif)
Videomicrometric测量横截面积相同的金属环。数据显示个人的测量金属环在五个不同的场合表达为绝对数量的像素(•)。这五个实验的平均值±sem表示为百分数从基线(○)。gydF4y2Ba
Epithelium-intact人类支气管环始终表现出自发的腔的缩小后的初始平衡∼15分钟的时间60分钟(图。3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。吲哚美辛(1µM)没有影响自发腔的缩小epithelium-intact支气管环(数据未显示)。gydF4y2Ba
![图3. -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/19/6/991/F3.medium.gif)
时间/自发的腔的狭窄的气道部分完整的上皮细胞。基于这些数据,后续实验的“时间0”被设定为15分钟后第一个照片拍摄gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:平衡时期。数据提出了从21日均值±sem实验和表达为改变腔的面积%的基线,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba第一个图像记录。gydF4y2Ba
除上皮对自发腔的缩小gydF4y2Ba
相比epithelium-intact支气管环自发腔的狭窄epithelium-denuded制剂显著降低在所有的测量时间点(p < 0.05;图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。组织学评估的组织上皮细胞被擦破证实选择性切除上皮没有固有层的潜在损伤层和基底膜在所有样本评估(结果未显示)。gydF4y2Ba
![图4. -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/19/6/991/F4.medium.gif)
时间/课程,每段,表明有自发的缩小气道部分完整的上皮(○),主要是没有在上皮组织剥蚀(•)。数据提出了均值±sem从六个实验。*:p < 0.05;* *:p < 0.01,而上皮完整的准备,表示为腔的面积变化从时间0。%gydF4y2Ba
组胺对腔的面积gydF4y2Ba
0.1毫米的组胺显著减少了腔的面积在epithelium-intact epithelium-denuded组织(p < 0.05;图5gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。Histamine-induced宫缩类似规模的准备,不管epithelium-intact自发缩小观测的控制。gydF4y2Ba
![图5. -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/19/6/991/F5.medium.gif)
组胺(100µM)导致显著增加腔的缩小(▪:上皮完整,n = 11)超出了自发的缩小(•:完整的时间控制,n = 6)。组胺引起的上皮细胞去除不影响缩小(□:上皮剥蚀,n = 6)。数据提出了均值±表示数量的扫描电镜实验。*:p < 0.05,而epithelium-intact时间控制。gydF4y2Ba
激活嗜酸性粒细胞对腔的面积的影响gydF4y2Ba
组织样本显示无显著变化缩小后的5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba未经处理的人类嗜酸性粒细胞(30±7% 45分钟gydF4y2Ba与gydF4y2Ba时间控制28±7%;n = 11),而刺激的嗜酸性粒细胞1µM拥堵导致显著缩小支气管部分相比时间控件(45±9%;p = 0.01gydF4y2Ba与gydF4y2Ba时间控制,p = 0.05gydF4y2Ba与gydF4y2Ba如果细胞控制;图6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。先前的实验显示,拥堵的孤独没有影响腔的面积(19±6%gydF4y2Ba与gydF4y2Ba时间控制28±4%;n = 5)。gydF4y2Ba
![图6. -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/19/6/991/F6.medium.gif)
添加5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba人类嗜酸性粒细胞(□)对气道口径无显著影响。当1μM platelet-activating因素是嗜酸性粒细胞,一个重要的观察气道狭窄(▪)。数据提出了均值±sem从11个实验。*:p < 0.05;* *:p < 0.01相比,匹配时间控制(•)。gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞的活化是证实并行实验测量OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba·gydF4y2Ba−gydF4y2Ba释放PAF-activated和未激活的嗜酸性粒细胞。嗜酸性粒细胞的活化导致的时间增加gydF4y2Ba2gydF4y2Ba·gydF4y2Ba−gydF4y2Ba生产的嗜酸性粒细胞(p < 0.0001为每个单独的时间点;图7gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
![图7. -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/19/6/991/F7.medium.gif)
刺激人的嗜酸性粒细胞呼吸爆发platelet-activating因子(PAF)参谋长。在37°C细胞pre-incubated前10分钟的空军(▪)或缓冲(□)。超氧化物阴离子生成测量作为超氧化物歧化酶抑制减少ferricytochrome每10 cgydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞在15分钟。数据提出了均值±sem从10实验。* * *:p < 0.001相比,匹配时间控制。gydF4y2Ba
被动致敏的影响在反应腔的狭窄多克隆anti-immunoglobulin−EgydF4y2Ba
多克隆ige的浓度范围内1 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Baµg·-10毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba导致passively-sensitized腔的狭窄浓度增加和nonsensitized组织(图8所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。最大反应passively-sensitized气道准备工作就绪nonsensitized匹配控制相比,显著增加(p < 0.05;图8gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
![图8. -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/19/6/991/F8.medium.gif)
被动致敏(•)浓度明显增加,anti-immunoglobulin E (Ig)−−感应腔的缩小在bronchial-ring准备。数据提出了均值±sem从六个实验。* *:p < 0.01,与nonsensitized相比,配对控制(○)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
电脑videomicrometry适合人类气管平滑肌的反应的研究gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。条件允许的利用率非常少量的组织以及物质或细胞诱导反应气道的准备工作。技术提供了机会学习呼吸道口径的变化实时条件下自发的语气,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba在缺乏外源预加载或休息时,身体紧张,这可能是由等距固定在organ-bath力传感器系统。gydF4y2Ba
尽管videomicrometry并不完全复制的技术gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba情况下,气道平滑肌收缩gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Baauxotonic,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba不断增加的负载平滑肌缩短气道狭窄gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,所以这是一个很好的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba近似的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba的情况。实验auxotonic测量只能测量长度的变化和执行力同时在准备中,负载的增加肌肉缩短。在目前的研究中,bronchial-ring准备从第五或第六代肺泡周围组织的解剖免费。然而,他们不仅包含平滑肌,但软骨和结缔组织。因此,在一个戒指准备、弹性负载的平滑肌细胞存在,在那些中央和相对僵硬的航空公司,可能比负载更大的相关性,可以由肺泡周围组织gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
当使用videomicroscopy系统,实验条件必须仔细控制。作者以前用豚鼠气道videomicroscopy研究表明,折射的变化引起的室体积的变化会影响明显腔的面积的大小gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。因此,它是重要的,以确定videomicrometric测量的重现性与microwell体积的蒸发的影响。初始实验使用金属环代替支气管部分表明,横截面积的测量由videomicrometry是可再生的,而不是显著影响蒸发的时间60分钟,有限长度的一个实验1 h。然而,如果超过这个记录时期,它不能排除记录减少横截面积是一个人工制品由蒸发引起的。gydF4y2Ba
一个了不起的发现的研究是使用videomicroscopy系统在这些near-auxotonic条件下,支气管环展出一个自发的60分钟内缩小epithelium-denuded几乎完全没有准备。自发的发展缩小是环氧酶抑制剂的影响,吲哚美辛,排除前列腺素类为最主要的介质。这一发现与自发的形成了鲜明对比,prostanoid-mediated腔的缩小观察豚鼠气管在相同条件下gydF4y2Ba3gydF4y2Ba以及缺乏自发缩小epithelium-intact人类航空在静力条件下的器官浴gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。这表明人类呼吸道上皮细胞产生介质,增加气道的基调。一种解释缺乏自发的气道狭窄的器官浴是大量稀释这些介质通过使用∼40倍高孵化卷。gydF4y2Ba
符合观察器官浴,组胺诱导的收缩气道薄切片和最大响应后5 - 10分钟。这种最初的反应后,进一步观察缓慢腔的面积减少,平行于自发减少epithelium-intact控制组织。按照豚鼠气管gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,histamine-induced气道狭窄auxotonic条件下影响环氧酶的抑制和去除上皮,仅表明epithelium-derived因素导致自发的语气和不影响诱导宫缩。与以前公布的数据gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,结果表明受体激动剂的作用和效力取决于videomicrometry特征明显具有可比性的影响他们在器官浴唤起。gydF4y2Ba
与organ-bath技术相比,videomicroscopy孵化小卷的重要优势(250µL videomicroscopicgydF4y2Ba与gydF4y2Ba∼10毫升organ-bath实验),从而允许调查航空公司之间的相互作用的因素只能在有限的数量,如孤立的细胞。因为嗜酸性粒细胞被认为发挥重要作用在哮喘的病理生理学gydF4y2Ba12gydF4y2Ba、人类支气管的交互和孤立的嗜酸性粒细胞videomicrometry调查。而如果细胞没有明显影响呼吸道口径,PAF-activated人类嗜酸性粒细胞引起了一场小但显著缩小人类支气管部分,获得符合之前的数据通过一个类似的技术gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。然而,在之前的研究中,嗜酸性粒细胞对呼吸道口径的影响不能实时观察,细胞被置于支气管部分,然后关闭两端,孵化为60分钟,切成圈,此后,评估校准放大透镜gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。因为它是非常困难的大量研究细胞介导气道反应器官浴,videomicrometric评估迄今为止似乎最合适的系统这一特定目的。gydF4y2Ba
Passively-sensitized人类航空公司,一夜之间引起的响应性过敏原是孵化IgE-rich血清与特应性个体,被用作模型气道代答的调查及其药理调制。organ-bath研究以类似的方式,评估的部分passively-sensitized videomicrometry证明增加航空公司的响应性与非致敏控制多克隆ige相比。在未来这个试验装置可以提供敏感信息影响endogenously-released介质的释放和效果。gydF4y2Ba
总之,本研究中的数据表明,在生理和药理gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba少量的研究,反应人类的航空公司可以通过videomicroscopy系统评估。在这种情况下,人类支气管展览的自发收缩依赖于一个完整的上皮细胞的存在,但独立的花生四烯酸环氧酶代谢产物。该技术特别适合研究使用非常小的卷。这不仅允许对兴奋剂的调查,但与孤立的细胞相互作用,如嗜酸性粒细胞。还有待观察是否videomicrometry不仅可以应用于研究气道,而且血管药理学。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2001年6月28日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2002年1月13日。gydF4y2Ba
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