摘要
气道壁胶原沉积增加或改变是哮喘气道重塑的特征之一。这一增长背后的机制及其功能后果仍有待进一步确定。代表在活的有机体内动物模型在这方面可能有用。
在本研究中,布朗挪威大鼠的气道壁在长时间接触过敏原后出现胶原沉积。致敏大鼠在2周和12周内反复暴露于卵清蛋白(OA)或磷酸盐缓冲盐水。
在暴露于OA 2周的动物中,I型、III型、IV型、V型和VI型胶原的沉积没有改变。在接触OA 12周后,更多的I型胶原沉积在气道内外壁,更多的V型和VI型胶原沉积在气道外壁。12周时,确定血管数量通过IV型胶原染色没有增加,但总血管面积增加。
总之,在致敏大鼠中,长时间的过敏原暴露与I型、V型和VI型胶原沉积增强和血管增加有关。这表明哮喘患者气道重塑的某些方面可能是由长期接触过敏原引起的。
本研究由根特大学协调研究计划(批准号:No.;GOA 98‐6)和葛兰素史克(由M. Johnson提供)。
不同的细胞外基质(ECM)蛋白已经在整个气道壁被鉴定出来。气道上皮下的基底膜(BM)由IV型胶原、蛋白多糖、层粘连蛋白和纤维连接蛋白组成1.正常气道的外基质由I型、III型和V型胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、纤维连接蛋白和层纤蛋白组成。基质的主要纤维成分,I型和III型胶原蛋白和弹性蛋白,是气道机械性能的主要决定因素2.
哮喘气道壁显示结构变化,包括基底下膜增厚,改变黏膜下ECM沉积和新生血管1,3.- - - - - -6.骨膜下的增厚层主要由I型、III型和V型胶原以及纤维连接蛋白和腱蛋白组成1,7.此外,慢性哮喘患者支气管粘膜下层III型、V型和VI型胶原沉积增加3.,4.另一些人则观察到上皮细胞下存在数量增加的碎片弹性蛋白纤维5.哮喘气道中这些ECM改变的发病机制和功能后果仍不确定。
一个合适的在活的有机体内动物模型可以提供这方面的有用信息。目前的作者先前报道过,长时间的过敏原暴露引起了致敏的布朗挪威(BN)大鼠气道的结构变化8.在这些动物中,暴露于过敏原长达3个月导致大气道中胶原蛋白和纤维连接蛋白的数量增加8.通过评估暴露于过敏原14天和3个月的致敏大鼠气道壁中不同类型胶原的数量,进一步表征了胶原沉积的增加。
材料与方法
动物的敏感和暴露
雄性BN大鼠(Harlan CPB, Zeist,荷兰)如前所述致敏并暴露于过敏原8.简而言之,所有动物均因腹腔注射(i.p。)注射1mg卵清蛋白(OA) (Sigma Chemical Co., Poole, UK)和200µg Al(OH)3.第0天。一组动物(n=5)用1mg OA和200µg Al(OH)增强3.i.p。从14-28天开始,每周三次(2周)暴露于1%的雾化OA中。第二组动物(n=5)同样从14-98天(12周)开始暴露于1%的雾化OA中。对照组(n=5·组)−1)暴露于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
肺组织学
麻醉大鼠(60 mg·kg−1戊巴比妥(赛诺菲,利伯恩,法国)i.p。)最后一次气溶胶暴露后24小时,气管插管。灌洗后,用4%多聚甲醛固定肺部通过气管套管。肺切片进行免疫组化和刚果红染色。刚果红染色切片测定支气管周围嗜酸性粒细胞总数8.
I型、III型、IV型、V型和VI型胶原的免疫组化染色
根据制造商说明书,在Technovit 8100 (Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim, Germany)植入的肺组织中用多克隆山羊抗I型胶原蛋白进行I型胶原染色。其他类型的胶原蛋白在石蜡包埋组织中检测到。用过氧化氢(H2O2),以阻断内源性过氧化物酶活性和0.1%的胰蛋白酶(Sigma Chemical)在0.1%的氯化钙2(pH 7.8)在37°C。切片用蒸馏水冲洗,随后与正常兔血清(NRS)一起孵卵1小时,并加入1% NRS稀释的一级多克隆抗体(Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL, USA),按如下比例:山羊抗I型胶原蛋白(1:20),山羊抗III型胶原蛋白(1:100),山羊抗IV型胶原蛋白(1:50),山羊抗V型胶原蛋白(1:50)和山羊抗VI型胶原蛋白(1:300)。切片清洗后用1:200稀释的生物素化兔抗山羊免疫球蛋白- G (DAKO A/S, Glostrup,丹麦)孵育。用链霉亲和素生物素化辣根过氧化物酶复合物(Nycomed Amersham Plc, Buckinghamshire, UK)稀释1:200检测一抗-二抗复合物。过氧化物酶活性在二氨基联苯胺(DAB) (DAKO)中发展,给出棕色反应产物。切片用苏木精反染。大鼠皮肤作为不同胶原蛋白类型的阳性对照。用正常山羊血清代替一抗作为阴性对照。
定量胶原沉积
通过光学显微镜检查不同类型胶原蛋白的沉积,并使用计算机化图像分析系统(徕卡Q500MC;徕卡剑桥有限公司,剑桥,英国)如上所述8.每个实验组检查每只动物的三个肺切片。在所有大气道(BM (Pbm) >2 mm)中测量在气道壁不同腔室中沉积的特定胶原蛋白的数量,这些气道被切割成合理的截面(由最小与最大内径<0.5的比值定义)。气道壁的不同腔室有:由基底膜和外外膜定义的总壁;由BM界定的内壁和平滑肌的外边界;外壁,由平滑肌和外外膜的外边界所定义。这些隔室的边界被人工标记,并通过软件分析沉积在这些区域的特定胶原蛋白的数量。
测量血管面积
用IV型胶原蛋白染色其骨髓,以确定血管。使用图像分析系统(徕卡Q500MC)在用于IV型胶原定量的切片上测量大气道气道壁血管面积。船体面积由船体BM内部的所有结构定义,并由Qwin软件(徕卡剑桥有限公司)计算。统计气道壁血管总数。
数据分析
报告值以平均值±sem表示。将一个实验组各切片的胶原沉积、血管面积及血管数量数据汇总。每个实验组平均进行16个大气道(范围12-25)的定量。总胶原沉积面积、气道内外壁的数值归一化为Pbm。将血管面积归一化为总壁面积,将血管数量除以总壁面积,得到血管数量·mm−2.PBS组和OA组的Pbm频率分布采用Kolmogorov-Smirnov检验进行比较,以确保气道尺寸范围相似。气道总、气道内外壁、血管面积、血管数量的平均值·mm−1在一个实验中,通过未配对t检验对OA和pbs暴露动物进行比较。采用Spearman秩相关系数检验气道壁胶原沉积量与支气管周围嗜酸性粒细胞数量的相关性。p‐值<0.05被认为是显著的。
结果
不同胶原蛋白类型的分布
I型胶原清晰地存在于整个气道壁,并与气道上皮平行形成束状(图1a和b)⇓).III型和VI型胶原普遍存在于气道黏膜和外膜,其沉积模式相似(图1c, g, h)⇓).V型胶原主要沉积在气道外壁,靠近气道平滑肌细胞和血管(图1f)⇓).IV型胶原蛋白在上皮细胞和周围血管下方的基底膜以及平滑肌束内被发现(图1e⇓).
暴露12周的Brown Norway大鼠大气道中类型特异性胶原染色的显微照片(hematoxilyn反染色)。暴露于a)卵清蛋白(OA)或b)磷酸盐缓冲盐水(PBS)大鼠气道中的I型胶原。c) III型胶原蛋白,e) IV型胶原蛋白,f) V型胶原蛋白。暴露于g) OA或h) PBS的动物中的VI型胶原。d)胶原蛋白染色的代表性阴性对照。
不同类型的胶原蛋白在对照组动物和暴露于过敏原的动物中分布模式相似,与暴露时间无关(图1)⇑).
定量I型、III型、V型和VI型胶原沉积
两周内暴露于PBS或OA的敏感BN大鼠在大气道总气道内壁和外气道壁沉积的胶原亚型的数量没有差异(数据未显示)。
暴露于过敏原的大鼠在12周内观察到胶原蛋白类型的定量变化。I型和VI型胶原蛋白在整个气道壁均增加(p<0.001)与暴露于pbs的动物)(图2a和c⇓).I型胶原蛋白在气管内壁(p<0.01)和气管外壁(p<0.001)均有增加(图2a⇓), VI型胶原蛋白的增加主要出现在气道外壁(p<0.001)(图2c⇓).虽然OA和pbs暴露大鼠总气道壁V型胶原含量无差异,但过敏原暴露大鼠气道外壁V型胶原沉积较多(p<0.05)与(图2b⇓).OA与pbs暴露大鼠ⅲ型胶原沉积无差异(12.56±1.24与13.93±2.33µm2·µm·BM−1).
暴露于磷酸盐缓冲生理盐水(□)或卵清蛋白(光盘)12周后,I型、V型和VI型胶原在总、内外气道壁的沉积。*: p < 0.05;* *: p < 0.01;* * *: p < 0.001。
12周暴露大鼠气道壁I型胶原的数量与支气管周围嗜酸性粒细胞的数量相关(秩相关系数(r年代)=0.72, p<0.05)⇓).VI型胶原的沉积也与气道壁嗜酸性粒细胞的数量有关(r年代=0.86, p<0.01)(数据未显示)。气道壁V型胶原的数量与嗜酸性粒细胞的数量无关。
![图3. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/20/2/280/F3.medium.gif)
Brown Norway大鼠气道壁I型胶原沉积量与支气管周围嗜酸性粒细胞数量的相关性。〇:大鼠暴露于磷酸盐缓冲盐水;•:暴露于卵清蛋白的大鼠。等级相关系数(r年代) = 0.721, p < 0.05。WAt:总墙面积。
基膜IV型胶原蛋白
OA暴露2周和12周大鼠气道壁IV型胶原沉积量无差异(1.51±0.21与1.33±0.4µm2·µm·BM−1在暴露于pbs的动物中)。此外,在支气管壁每个区域的血管数量上也没有发现差异。2周后,暴露于oa的动物气道中有265±27根血管·mm−2与332±20血管·mm相比−2在暴露于pbs的大鼠中12周后318±13根血管·mm−2与288±31血管·mm−2PBS组。暴露于OA的动物在12周内血管面积正常化为总壁面积增加(图4)⇓)与pbs暴露动物相比(p<0.05)。
![图4. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/20/2/280/F4.medium.gif)
磷酸盐缓冲盐水(□)或卵清蛋白(镜像)暴露2周和12周对大气道血管的影响。*: p < 0.05。
讨论
本研究的目的是描述反复暴露于过敏原的致敏BN大鼠大气道壁上胶原沉积的变化8.结果表明,过敏原暴露12周后,这些气道中I型、V型和VI型胶原蛋白含量增加。三种类型的胶原蛋白在气道外壁均有增加;I型胶原也沉积在内壁。III型和IV型胶原的沉积没有观察到差异。OA暴露12周后血管灌注增加。
与慢性哮喘有关的气道壁胶原蛋白组成的两个方面的变化是增厚的网状层和粘膜下层胶原蛋白沉积的增加3.,4.从支气管活检研究中获得的信息主要涉及基板下区域的组成。在哮喘气道中,网状层代表不规则分布的纤维化区域。BM下方的胶原基质带含有大量的I型、III型和V型纤维胶原蛋白,但也含有纤维连接蛋白和腱蛋白1,3.,7.在本模型中,这一区域I型胶原蛋白的增加最为显著。虽然在哮喘患者的支气管活检中,与正常人相比,网状层的厚度增加1,9这种上皮下纤维化的意义尚不清楚。在一些研究中,没有发现增厚与哮喘的严重程度、持续时间或病因之间的关系9- - - - - -11.其他研究证实,在特应性哮喘中,基底膜下基质带增厚,但在非特应性哮喘中没有12与哮喘的严重程度相关,但与哮喘的持续时间无关13,14.
关于胶原蛋白在粘膜下层和外膜区分布的资料很少。威尔逊和李3.在哮喘气道和Lee粘膜下层观察到III型和V型胶原含量增加et al。4发现哮喘患者粘膜下层的VI型胶原蛋白增加。这些发现始终没有得到证实,因为其他人没有观察到哮喘受试者中总胶原蛋白数量的增加,也没有观察到I型和III型胶原蛋白沉积的增加10.在本研究中,反复的过敏原刺激被证明可诱导外气道壁I、V和VI胶原蛋白沉积增加。这个区域对应于软骨和/或平滑肌层之间的外膜组织。在正常气道中,外膜主要由纤维组织和血管组成,但就目前作者所知,哮喘气道外膜中胶原沉积的数据尚不存在。因此,目前尚不清楚上皮下纤维化是否可以作为改变的标志,如ECM蛋白沉积遍布粘膜下层和外膜,如所建议的那样15.因此,目前的作者不能确定本研究中观察到的变化与人类哮喘的变化一致。
有关哮喘患者气道管壁内血管变化的资料也很少。最近的报道显示哮喘患者气道壁血管增多16- - - - - -18.与对照组相比,在致命哮喘患者中,大气道中的大血管数量增加,而在较小气道中则没有19.同样,哮喘患者和对照组之间气道粘膜下层血管所占总面积没有差异19.在本模型中,血管通过免疫染色鉴定IV型胶原,这是血管BM中存在的主要胶原亚型。使用这种方法,血管总量增加了·mm−2无法确认。然而,与Li和Wilson的数据相符6时,发现血管占据的黏膜总面积增加。
在该模型中,过敏原诱导的胶原沉积增加的机制仍有待进一步阐明。胶原蛋白的形成是对损伤的组织修复反应的一部分,试图使组织再生。当这一修复过程失调和延长时,可能会导致其特定变化的进行性纤维化20..不同类型的胶原蛋白似乎在再生过程的不同阶段产生。在反复暴露于过敏原的大鼠气道中产生ECM,类似于纤维连接蛋白先于胶原沉积形成临时ECM的组织再生过程21.此前,目前的作者已经表明,纤维连接蛋白沉积的变化开始于2周后,但胶原蛋白含量和气道壁组成的增加只有在较长的暴露时间后才能观察到22.此外,I型和V型胶原通常被认为反映了完全建立的纤维化病变,发生在再生过程的后期23,24.胶原蛋白的主要来源可能是成纤维细胞和/或肌成纤维细胞,它们对各种刺激有反应,包括各种生长因子,如转化生长因子- β、胰岛素样生长因子或血小板衍生生长因子25,26.这些因子可以从不同类型的细胞中释放,特别是上皮细胞和嗜酸性粒细胞26- - - - - -28.值得注意的是,在本研究中发现,暴露12周的BN大鼠气道壁中I型和VI型胶原的数量与嗜酸性粒细胞的数量呈正相关。嗜酸性粒细胞是否表达这些生长因子至今尚不清楚。
在目前的研究中观察到的气道壁胶原沉积的增加和改变可能具有重要的功能后果。数学模型将气道重塑与气道高反应性(AHR)联系起来29.气道结缔组织组成的改变可影响平滑肌缩短30.,根据ECM沉积改变的程度和位置,这些可能会保护而不是增强气道对支气管收缩刺激的反应性31- - - - - -33.在最初的研究中,目前的作者观察到,暴露于OA的大鼠在12周内AHR的损失与总气道壁中的总胶原蛋白和外气道壁中的纤维连接蛋白的增加有关22.作者认为,肺实质与气道外壁的紧密粘附可能会影响气道的力学性能22.已知VI型胶原微原纤维在其他ECM成分之间形成纤维连接34.因此,这些纤维可能是间质胶原原纤维和其他基质结构(包括基底膜和弹性蛋白微原纤维)之间的机械链接35.I型胶原蛋白形成相对坚硬的线性纤维网络,也可以增加气道壁的硬度36.因此,oa暴露大鼠I型胶原和VI型胶原的增加可能会增加气道壁的刚性,从而对抗而不是诱发AHR。
这些观察结果强调了在评估重建的功能作用时,包括整个气道壁发生的所有结构变化的重要性。迄今为止,在男性中,这种分析仅限于上皮下胶原沉积,将I型和III型胶原沉积的程度与气道反应性的增加联系起来,而不是降低。然而,两者之间的因果关系尚不清楚。目前的模型警告不要将结构改变的一个方面与气道功能联系起来,而不考虑共存的改变的潜在贡献。
综上所述,12周内暴露于过敏原的致敏大鼠气道壁I型、VI型和V型胶原沉积增加可能是由于炎症细胞持续存在而反复诱导的组织修复过程所致。不同的胶原蛋白可以增加气道壁的硬度和硬度,从而防止气道高反应性。
致谢
作者要感谢A. Neessen和I. De Borle的技术援助。
- 收到了2001年6月26日。
- 接受2002年3月13日。
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