摘要
关于是否有足够的标本来描述囊性纤维化(CF)气道定植存在争议铜绿假单胞菌.对38例稳定型CF患者的口咽、痰和支气管肺泡灌洗样本进行评估,以检测铜绿假单胞菌在重复检查中,同一宿主内的不同遗传分离株和基因型的纵向变异。
细菌分离株通过脉冲场凝胶电泳的脱氧核糖核酸大限片段进行分型。
检测的敏感性、阴性和阳性预测值和特异性铜绿假单胞菌非咳痰患者的口咽培养分别为35.7、73.5、83.3和96.2%,咳痰患者的口咽培养分别为91.7、94.1、100和100%。口咽拭子和痰液分离的假单胞菌与支气管镜分离的假单胞菌的基因型分别为55%和40%。62%的基因型发生了纵向变异。其中一半的病变仅通过支气管镜检查即可发现。
综上所述,痰标本与支气管肺泡灌洗标本具有同等的检测价值铜绿假单胞菌殖民。口咽培养不适合描述囊性纤维化肺的细菌状况。在同一宿主内不同的基因型和纵向基因改变是常见的,并且可能只在支气管肺泡灌洗液中检测到。
这项研究得到了Mukoviszidose eV, Hoffmann-La Roche基金会和大学医院研究部Charité的资助。
囊性纤维化(cystic fibrosis, CF)患者慢性肺部感染可导致持续性炎症和不可逆的肺损伤1,2在美国,这是一个需要检测的主要问题铜绿假单胞菌尽早定殖CF肺,并开始适当的抗菌治疗。从口咽拭子和痰标本中分离的细菌常规回收,以确定细菌定殖。处于早期疾病状态的患者可能无法提供足够的下呼吸道样本进行微生物检查,而其他晚期疾病患者似乎对基于痰培养的抗生素选择没有良好的反应。因此,以往的研究比较了CF患者的支气管肺泡灌洗(BAL)和口咽培养2- - - - - -6,表明BAL是获取下呼吸道菌群样本的最具体方法。然而,根据患者的年龄和临床背景,比较数据相互矛盾。此外,大多数流行病学研究使用口咽或痰样本,尽管这些样本可能不能充分反映细菌肺部的不适状况。
即使有证据表明铜绿假单胞菌在不同的呼吸室中,这并不意味着这些生物是相同的或来自同一细菌克隆。脱氧核糖核酸(DNA)大限制性内切酶分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)是一种非常敏感、特异且目前可能是确定不同细菌种类间克隆关系最可靠的基因分型技术7- - - - - -13.用限制性内切酶Spe I酶切基因组DNA,然后用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分离限制性片段,是一种有效的分型方法铜绿假单胞菌CF患者分离株3.,8- - - - - -10,14- - - - - -17.
本研究的目的是评估从临床稳定的CF患者的口咽、痰和BAL中回收的样本,以检测铜绿假单胞菌,用于在同一宿主内出现遗传上不同的分离物,并用于在重复检查期间评估基因型的纵向变异。
材料和方法
主题
本研究于1996年6月至1999年7月期间对来自德国柏林和慕尼黑儿童大学医院的38名CF患者进行了调查。所有患者都参加了支气管肺泡灌洗评价抗炎治疗(BEAT)研究,这是一项多中心试验,旨在前瞻性评估肺功能正常的稳定CF患者的支气管炎症自然进程和多纳酶α的影响18。如果患者符合以下条件,则他们有资格参加本研究:≥5. 岁,肺功能正常,定义为1秒用力呼气量(FEV1) > 80%的预测。患者接受抗炎治疗(布洛芬、全身或吸入皮质激素和α1-抗胰蛋白酶)以及有过敏性支气管肺曲霉菌病证据的患者不包括在本研究中。所有患者必须在首次BAL前至少6周内无急性呼吸道感染和肺部恶化。
从两次调查(t1和t2),间隔约18个月,通过口咽拭子、痰液收集和支气管镜检查(BAL)从上、下呼吸道进行。由各中心有经验的工作人员进行口咽深层培养,擦拭舌根、扁桃体和咽。第一次调查时,患者年龄5.2-34.2岁(平均14.2岁),FEV180-120%(平均95%)。所有患者在进行BAL治疗前至少6周无急性呼吸道感染和肺部恶化,每次BAL治疗前静脉注射抗生素和喹诺酮类药物需暂停使用5周。观察期间每3个月进行一次肺功能检查。如确诊新感染铜绿假单胞菌,吸入妥布霉素(如敏感)或黏菌素抗生素治疗1年 yr(n=4)。肺恶化(n=6)患者静脉注射头孢菌素和氨基糖苷类药物。
该研究得到了参与中心伦理委员会的批准;在所有情况下都获得了父母和/或患者的书面知情同意。
如前所述进行支气管镜检查和BAL18.为了使BAL程序标准化,在每个中心由同一研究者进行支气管镜检查。落下帷幕了通过外径为3.5毫米的挠性支气管镜 年龄<10岁的患者中的mm yrs和4.9 在老年患者中为mm。局部麻醉完成通过吸入2-4 BAL前4%利多卡因溶液毫升,1-4毫升 将支气管镜引入气道时,根据需要注入1%利多卡因mL。患者使用咪唑安定(0.2-0.3)联合镇静 mg·kg体重−1)异丙酚(负荷剂量为2 mg·kg体重−1重复剂量为10mg)。所有病人的支气管镜均卡入舌部或舌部的一个节段。灌胃量为3ml·kg−1生理盐水加热至体温。体重<20的儿童 公斤,3×1 毫升·千克−1注入生理盐水,并立即通过温和的手动抽吸抽出。体重>20的儿童 kg,分20等份进行BAL mL注射器,总体积不超过3 mL·kg体重−1. 在2个培养基上获得细菌培养物 在过滤前,将第一份BAL液体样品的mL接种到哥伦比亚琼脂上。而不是使用1×105作者认为,无论细菌计数如何,BAL液中的任何病原体都是相关的,这与之前CF患者研究中使用的方法类似2.
在选择的培养基上稀释细菌培养物铜绿假单胞菌采用API 20 NE系统(Bio Mérieux, Marcy-Etoile,法国)鉴定。阳性培养被定义为有机体在任何密度下的生长。任何表型不同的分离株的单个菌落,如果从同一培养中获得,将被选择作进一步的研究。采用微量肉汤稀释法进行药敏试验。分离菌株在−80℃冷冻,在37℃下在McConkey琼脂上重新培养过夜,并通过基因分型技术进行鉴定。
DNA大分子酶切及PFGE铜绿假单胞菌如前所述进行分离14,只做了一些修改。细菌分离物在37°C胰蛋白胨大豆肉汤琼脂中培养过夜,光密度为0.7 (λ=590 nm)。悬浮液用0.5 M乙二胺四乙酸(EDTA)孵育,10000 rpm离心3分钟(Eppendorf离心机5415D;埃普多夫,德国汉堡)。在100µL氯化钠/EDTA (SE)缓冲液(75 mM NaCl, 0.5 M EDTA, pH 7.4)中洗涤和重悬微球后,将悬浮液加热到55℃,并加入100µL 2%低熔点琼脂糖(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)。悬浮液被移到塞模中,并在4°C下硬化。塞在1ml氯化钠/ n -月季酰肌氨酸(SLS)缓冲液(0.5 M EDTA, 1% SLS, pH 9.5)中孵育,蛋白酶K最终浓度为0.5 mg·mL−1。混合物在55°C下温和摇动过夜。用Tris/EDTA(TE)缓冲液洗涤后(在10分钟内洗涤5次) h) ,2×5 从塞子上切下mm块,并在37°C温度下与15℃温度下孵育过夜 限制性内切酶Spe I(德国曼海姆勃林格)的U。通过添加TE缓冲液(10 嗯,特里斯,1 mM-EDTA,pH 将塞子装入1%琼脂糖凝胶(用于PFGE的Seakem Gold琼脂糖;美国ME Rockland的Bio Products)上铜绿假单胞菌从作者实验室获得的参考菌株已添加到每个凝胶中进行内部控制。还包括分子大小标准(DNA大小λ梯形图;德国曼海姆勃林格)。槽中填充2%低熔点琼脂糖和电泳(Chef DRII系统;美国加利福尼亚州里士满Bio Rad Laboratories)在0.5×Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液中使用以下斜坡条件运行:1–25 24美元 h在12°C温度下,电流=0.1安培(6伏(V)/cm),电压=200 五、 夹角120°C。此后,凝胶用溴化乙锭染色,用宝丽来相机拍照,并用肉眼进行比较。
所有的样品都是通过重新培养从冷冻砧木中分离出来的分离株进行分型的。分型模式和结果解释之间的关系是使用Tenover提出的标准来确定的et al。17. 因此,如果分离物的PFGE模式在不超过三条限制性条带上存在差异,则认为它们是密切相关的。表现出4到6条片段差异的菌株被认为可能相关,而具有6条以上不同限制性片段的菌株被认为是遗传无关的。
两项调查的数据(t1和t2)进行统计分析,并计算呼吸道标本的敏感性、特异性和预测值。
后果
38名受试者中有18人(患病率47.4%)的增长率为铜绿假单胞菌在至少一项调查中(表1)⇓).7名患者在第二次调查时退出了研究(患者的数据为阴性铜绿假单胞菌没有显示)。的两个铜绿假单胞菌-阳性患者仅接受一次支气管镜检查。在第一次调查中,13名儿童可咳痰,5名非咳痰者,而在第二次调查中,由于肺部状况普遍改善,只有5名患者是咳痰者,11名非咳痰者。除了对不能产生痰液的患者进行口咽拭子采集外1)和四(t2)患者分别进行了口咽和痰培养,因为这些受试者最初无法咳出痰,但在采集口咽样本后会吐出痰。共有80株铜绿假单胞菌收集。其中77株分离株经DNA大分子酶切和PFGE鉴定。其中3个分离株尚无基因分型结果。
每一个病人的收获铜绿假单胞菌BAL中的液体如表所示 2.⇓.1×10之间2-10年9菌落形成单位·mL−1属于铜绿假单胞菌在每个阳性样本中进行了鉴别。
定期进行的肺功能测试显示患者的肺功能下降铜绿假单胞菌观察时间为~ 18个月。意味着FEV1捕食率从95%下降到87%。
检测的敏感性、特异性和预测价值铜绿假单胞菌肺的定植情况如表所示 3.⇓.
在本研究中,DNA宏观限制和PFGE被证明是一种高度可靠的鉴别工具。分型能力和重复性为100%。在6号、7号和9号患者中,DNA宏观限制能够检测到初始定植菌株的遗传改变,即单个条带的丢失或增加(RFLP类型分别为7b、8b和8d;图。 1.⇓)。为了排除这些宏观限制模式的变化是由人工制品引起的可能性,对细菌进行再培养,并再次输入。
流行病学分型结果铜绿假单胞菌-阳性患者见表2⇑.其中2例患者没有参加第二次灌洗,1例患者没有基因分型结果。每个病人至少有一个典型的宿主铜绿假单胞菌压力。第4和5号病人在第二次调查时携带了一种相同的菌株。目前尚不清楚这是交叉定殖的结果还是由于一种常见的感染源。在第二次BAL中,患者no。7号病人的宿主典型菌株定殖。除了主要的定殖菌株外,表明是交叉感染。7号和9号患者的气道中存在相关菌株。然而,这些分离菌株的来源仍不清楚。14号和15号病人是姐妹,有证据表明有一种相同的菌株。
在55.6%的调查中,经支气管镜检查发现的分离株与口咽拭子和痰液的基因型不同(表4)⇓).在7号、11号和12号患者中,支气管镜标本检测到与主要定植菌株流行病学无关的其他菌株。5号患者在t2,而最初的毒株在评估期间持续存在于肺部。这些分离株的基因分型表明,这是由于与新菌株同时感染,而不是由于初始菌株的突变,因为PFGE模式的片段数差异为>6。从6号、7号和9号病人的BAL液中分离的一些菌株的PFGE谱图中可以观察到单个限制性谱带的缺失或增加(图1)⇑),表明这些分离菌与其初始定殖菌株关系密切。
在8例患者中,可以评估可能的纵向遗传变异(表5)⇓).DNA宏观限制显示在四次调查中出现了额外的菌株。3号患者出现应变替换(图。 2.⇓),其中主机典型铜绿假单胞菌菌株已经丢失,但在第二次调查时获得了一个新的分离物。在四个病例中,基因型的纵向变异仅可通过支气管镜检测到(患者编号3、7、9和12;图 1.⇑和2⇓).
抗生素敏感性试验和基因分型的结果显示相关性较差(数据未显示)。具有相同基因型的细菌分离株在多达三种抗生素上的耐药模式不同。相反,有时不同铜绿假单胞菌基因型表现出非常相似的抗性特征。
讨论
本研究结果表明,为了获得可靠的CF微生物学结果,需要对来自呼吸道不同室的样本进行培养。对经BAL、口咽拭子和痰液回收的分离株的评估表明,在18个月内,同一株内的变异、菌株的丢失、菌株的替换和可能通过合并感染获得的附加菌株经常发生遗传变异。最重要的是,其中一些变化仅能被BAL检测到。
在本研究中,敏感性和阴性预测值对单一口咽培养进行检测铜绿假单胞菌肺部定植率较低(表1) 3.⇑).相反,在存在铜绿假单胞菌在18次检查中仅获得1次,且敏感性高。然而,只有28个调查(40.6%)采集了痰标本,许多患者无法咳痰。
以往的研究比较了CF儿童的BAL、痰和口咽培养3.,5,6成人和青少年/2,4结果相互矛盾。阿姆斯特朗et al。3.前瞻性收集了75名1-52月龄患有CF和轻度肺病的婴儿的口咽涂片和BAL液,随访时间为30个月。缺乏铜绿假单胞菌从有症状儿童的口咽培养中不排除该病原体存在于下呼吸道。这些数据得到了拉姆齐的证实et al。5在他们对43名年轻CF患者(平均年龄8.2岁)的调查中 yrs)呼吸状况良好。
在一项多中心研究中,罗森菲尔德et al。6,包括上述阿姆斯特朗检查的患者et al。3.还有拉姆齐et al。5,收集了141例年龄小于5岁、无肺加重经验的CF患者的培养。在这个年龄范围内,特异性和阴性预测值的检测铜绿假单胞菌是很高的。然而,口咽培养的敏感性差和阳性预测值表明阳性标本不能可靠地预测低气道定植。
康斯坦法得到口咽培养与BAL的良好一致性et al。2.他们对18名年龄为≥12 yrs患有中度肺病,病情稳定,临床表现良好。但是,与目前的患者和阿姆斯特朗的患者相比,研究对象的病情更为严重et al。3.,拉姆齐et al。5和罗森菲尔德et al。6,以及铜绿假单胞菌殖民率要高得多(88.9%,而本研究中为47.4%)。
鲍曼et al。4试图确定支气管镜和半定量BAL在病原体鉴定中的作用,主要是铜绿假单胞菌,在11例患有严重阻塞性疾病的成人CF患者的下呼吸道。尽管根据抗生素敏感性模式进行抗生素治疗,但支气管镜检查的适应症在临床上并不令人满意。在41%的患者中,铜绿假单胞菌在同期痰液中未发现。46%的支气管镜检查导致了抗菌治疗的改变,要么是因为在BAL液中发现了一种新的病原体,要么是因为敏感性测试的结果。因此,鲍曼et al。4提示BAL对于痰敏试验指导治疗失败的CF患者是一个有用的工具。
参与本研究的所有患者对BAL的应用都有良好的耐受性。但是,支气管镜检查不是筛选细菌病原体的标准诊断工具。本研究未收集诱导痰。因为sputa样本检测的敏感性铜绿假单胞菌CF患者的定植与支气管镜标本的定植基本一致,且预测值较高,因此可以推测,无法自行产生痰液的患者诱导痰标本的结果与BAL培养的结果相当。这一建议被最近一项使用诱导痰的研究结果所证实19,尽管作者没有将诱导痰标本与BAL液进行比较。
此外,基因的改变铜绿假单胞菌对CF患者进行评估。结果表明铜绿假单胞菌从气道的不同部位培养的菌株,在个体宿主中,很大比例的菌株在基因上是不同的。特别是,从口咽拭子和痰液中分离的菌株的基因型可能与通过支气管镜检查获得的菌株在很大比例的调查中有所不同。与先前对CF患者的研究相比,which评估了口咽或唾液样本,这项研究是首次对其进行基因分型铜绿假单胞菌从上呼吸道和下呼吸道(包括BAL液)回收的分离物。尽管基因型的主要和次要变化在所有隔间内都可见,但在相当多的病例中,基因型的纵向变化仅通过支气管镜检测到。由于患者数量较少,调查时间相对较短,患者的变化与患者的关系铜绿假单胞菌基因型和临床表现未见。此外,基因分型与抗生素敏感性试验之间没有相关性。在未来的研究中,探讨来自支气管树不同部位的基因型支气管镜样本纵向变化的临床意义可能是有价值的。
基因组分型分析铜绿假单胞菌CF分离株表明,大多数CF患者长期被一个或几个谱系的分离株定植10,11,16,20,21然而,Oliver最近的研究表明CF患者中存在高变异假单胞菌菌株et al。20.还报告了与一个或多个菌株的共同感染和菌株替换11,16,21.阿姆斯特朗et al。3.是第一个也是唯一一个进行基因分型的铜绿假单胞菌从CF患者的BAL液中分离的菌株。对参与研究的75名儿童中的9名进行随机选择的配对口咽和BAL培养进行比较,在8名患者中观察到基因型的一致性。但是,作者没有寻找基因型的纵向持续性或变化。
这些数据提出了一个问题:“应该定期从多少个部位收集呼吸道分泌物?”痰液样本已被证明优于口咽拭子,即使这些样本是以标准化的方式和尽可能高的精度进行的。在非暴露患者中,诱导痰可能是口咽培养的更可靠的替代物。与支气管肺泡灌洗相比,诱导痰在理论上具有优势反映支气管树不止一个区域微生物菌群的年龄。这些问题应作为进一步调查的主题。对于治疗难治性肺恶化,应进行支气管肺泡灌洗。除了作为诊断工具的价值外,支气管肺泡灌洗的应用必须正确回答流行病学问题,并可靠地检测宿主呼吸道内细菌分离物基因组的纵向变化。
致谢
作者要感谢C.Wolz、C.Goerke和A.Steinhuber对该方法的建议,以及M.Müller、C.Schweynoch和I.Schneider对其中几个实验的协助。细菌分化和耐药模式由E.Halle和S.Groß执行。统计计算由S.Bisson监督。作者还要感谢达文波特先生的批判性阅读。
BEAT研究的参与者E.Rietschel(德国科隆)、F.Ratjen(德国埃森)、H.von der Hardt、M.Ballmann(德国汉诺威)和D.Reinhardt(德国慕尼黑)。
- 收到2001年8月12日。
- 接受2001年12月15日。
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