摘要
炎症细胞,例如嗜酸性粒细胞,似乎是哮喘炎症过程中的关键球员。这些细胞被趋化因子吸引,例如Eotaxin和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)。
在这项研究中,作者调查了eotaxin和MCP‐1在人气道平滑肌细胞中的表达和释放是否可以通过增加细胞内环磷酸腺苷(cAMP)浓度来调节。还研究了cAMP依赖性蛋白激酶A (PKA)的可能参与。
Forskolin,腺苷环酶的直接刺激剂,分别降低白细胞介素(IL)-1β-诱导的肠漾和MCP-1分别释放73±8和65±6%。8Bromo-CAMP,一个阵营模拟,同样地将趋化因子产生58±9和63±8%,分别用于Eotaxin和MCP-1。前列腺素E2,称为前列腺受体EP的活化剂2和EP.4.与腺苷酸环化酶正偶联的,也分别降低了IL-1β诱导的嗜酸性粒细胞趋化因子和MCP-1的产生57±17%和53±4%。PKA抑制剂H-89能够抑制forskolin诱导的eotaxin和MCP-1蛋白释放的减少。通过westernblot分析,未发现cAMP对IL-1β诱导的p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号相关激酶或cJun的影响N- 终体激酶活化。
本研究表明,细胞内环磷酸腺苷浓度的增加可能会降低白介素- 1β诱导的eotaxin和单核细胞趋化蛋白- 1的表达和产生。这可以通过添加H‐89来抑制,H‐89是环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶的抑制剂。白细胞介素‐1β诱导的p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号相关激酶或cJun未见下降N-末端激酶激活。这些发现可能对进一步开发新的抗炎药很重要。
W.A. Wuyts是弗拉达登基金会的研究员。这项研究由Fonds voor wetenschappelijk onderzoek Vlaanderen G 0220.99资助。G.M. Verleden是the Katholieke Universiteit Leuven的葛兰素史克肺药理学主席。
哮喘是一种慢性炎症性疾病,其特点是可变气流阻塞、支气管高反应性和气道炎症。肥大细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞是哮喘患者气道中最重要的炎症细胞1那2目前广泛认识到嗜酸性粒细胞及其毒性衍生蛋白可导致哮喘气道的支气管粘膜损伤,这可能导致哮喘症状3..
嗜酸性粒细胞被认为是被趋化因子吸引的,例如eotaxin(主要吸引嗜酸性粒细胞)和单核细胞趋化蛋白(MCP)‐1(也吸引其他类型的炎症细胞)。目前的作者已经证明,培养的人气道平滑肌细胞(HASMC),当受到白介素(IL)‐1β的刺激时,可以表达和释放MCP‐1、‐2和‐34..IL-1β是一种有效的促炎细胞因子,在哮喘患者的炎症反应中起中心作用。这些细胞因子可在哮喘患者的支气管组织和支气管肺泡灌洗液中检测到5.-7..
环磷酸腺苷(cAMP)的形成是由腺苷酸环化酶(AC)完成的。Forskolin是AC的直接刺激因子,可增加细胞内cAMP浓度([cAMP])一世).8Bromo(8Br)-cAMP是已知的cAMP和前列腺素(PG)E的类似物2行为通过前列腺素受体EP2和EP.4.,它们是正耦合的通过刺激性G蛋白转化为AC.[cAMP]的变化一世能够调节多种细胞类型中多种基因的表达,如人肺成纤维细胞中Il-1β诱导的Il-6释放8.,IL-1α诱导人系膜细胞中IL-6和IL-8基因的表达和释放9.和肿瘤坏死因子(TNF)α诱导的系膜细胞MCP-1释放10经典观点认为,cAMP通过激活cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)发挥作用11,但有一些报告表明,cAMP也诱导一些PKA非依赖性效应12.
在之前的一项研究中,目前的作者已经证明了p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、细胞外信号相关激酶(ERK)和cJunN- 在HASMC中涉及IL-1β诱导的EL-1β诱导的ETAXIN和MCP-1的表达和生产13.
因此,在本研究中,作者研究了IL-1β诱导的HASMC中的趋化因子释放是否可以通过增加[cAMP]的药物进行调节一世以及这种调节是否依赖于PKA。作者还想研究cAMP的这种效应是否是由于p38 MAPK、ERK或JNK的调节所致。
材料和方法
人气道平滑肌细胞的培养
如前所述,HASMC由人支气管平滑肌外植体培养而成4..根据当地道德委员会批准的程序,从肺癌接受肺癌手术的患者获得气道组织,从未有过任何化学治疗。没有一个患者具有血症的特征。通过解剖分离支气管平滑肌组织。在Dulbecco改良的Eagle媒介(DMEM)(Gibco Life Technologies,Merelbeke,Merelbeke,Merelbeke,比利时)中制备和培养了小外植体和培养,补充有10%胎牛小牛血清,L-谷氨酰胺(2 mm),青霉素(100 U.·ML.-1),链霉素(100μg·ml-1)和两性霉素B(1.25) 微克·毫升-1).每天更换培养基,直到细胞开始生长,然后每3天更换一次培养基。当细胞达到融合时,移走外植体并将其分离 h后,使用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)收集细胞,并将其镀入75%的溶液中 厘米2瓶。细胞传代两次后,使用抗人平滑肌肌动蛋白抗体对培养物进行免疫组化鉴定。用于实验的原代细胞培养显示>95%的细胞为平滑肌肌动蛋白染色。在达到融合后,细胞被洗涤,并在刺激前用无血清DMEM孵育24小时。
所有的实验都是在第3至第6段进行的。从四个不同的病人身上培养细胞。
实验方案
HASMC用几种[cAMP]预处理一世-增剂和30 分钟后IL-1β(10 ng·mL-1)又增加了4个 h(核糖核酸(RNA))或24 h(蛋白质)。在相同的时间间隔内,将mRNA表达和蛋白质释放与仅用IL-1β刺激的HASMC中测得的mRNA表达和蛋白质释放进行比较。
用10 µM forskolin(默克,鲁汶,比利时),AC的直接刺激剂,1 8Br-cAMP(默克)的毫米,类似于cAMP,或1 µM铂族元素2(Sigma-Aldrich,Bornem,比利时),前列腺素受体EP的激活剂2和EP.4..在研究的第二部分,无关性实验中,使用IL‐1β、forskolin(10µM)和不同浓度的H‐89(0.1、0.3和3µM),一种特异性PKA抑制剂(Calbiochem, Nottingham, UK)刺激HASMC。
在研究的第三部分,用IL-1β(10)刺激HASMC ng·mL-1)福斯科林(10) µM),用于多个时间点(5–120 min)调查[cAMP]增加的影响一世p38mapk、ERK或JNK激活。
单独使用IL‐1β刺激的HASMC作为对照,测量值以这些对照细胞中测量值的百分比表示。
Northern杂交分析
采用硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取和异丙醇沉淀法分离总RNA14.将RNA样品进行1%琼脂糖/甲醛凝胶,含有20mM的吗啉磺酸,5mM乙酸钠和1mM EDTA(pH7.0),并呈上尼龙膜。用特异于人兴蛋白互补(C)脱氧核酸(DNA)的227个碱基对(BP)片段进行杂交,特异于人MCP-1 cDNA的170bp片段和对大鼠甘油醛特异的1,200bp cDNA片段 -3-磷酸脱氢酶(GAPDH)cDNA(Clontec,Heidelberg,德国)。使用[α-]通过随机引物标记试剂盒标记cDNA。32P] dCTP(3000 Ci·mM-1)(MBI Fermentas,St Leon-Rot,德国)。在含有50%甲酰胺的缓冲液中在42℃下进行4小时后,4×标准柠檬酸钠(SSC),50mM Tris-HCl(pH7.5),5×Denhardt的溶液,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS),5 mm EDTA和250μg·mL-1变性鲑鱼精子DNA,在42°C下与标记探针(1–2×10)杂交过夜6. cpm·mL-1).在杂交之后,在暴露于X-OMAT-S膜之前,将印迹在55℃下洗涤0.1×SSC的0.1×SSC,0.1%SDS。在足够的暴露时间之后,通过激光密度计开发和分析了自身显影。RNA水平表达为趋化因子信使(M)RNA与GAPDH mRNA的比率。
总蛋白测定
总蛋白用Bradford法测定15使用市售的测定(Bio-Rad Laboratories GmbH,德国慕尼黑)。
ELISA法测定eotaxin和MCP-1的分泌
在培养的HASMC上清液中测定Eotaxin和MCP-1。按照制造商的规定,使用商用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(英国阿宾顿研发系统欧洲有限公司)进行检测。这些ELISA试剂盒具有高度特异性,并且在所研究的任何细胞因子之间没有明显干扰。检测下限为5.0 pg·mL-1对于MCP-1和eotaxin。
计算同一样本中测得的蛋白质与总蛋白质的比率,并将蛋白质水平表示为IL-1β诱导蛋白质产生的百分比。
p38mapk、JNK和ERK的免疫印迹分析
提取胞浆蛋白后,通过Western blot分析,使用磷酸化p38 MAPK、JNK和ERK多克隆抗体(仅与所研究的MAPK的磷酸化形式反应)分析p38 MAPK、JNK和ERK的苏氨酸和酪氨酸磷酸化。如前所述进行分析16.按照制造商的建议(美国马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室)稀释磷酸化p38 MAPK、磷酸化JNK、磷酸化ERK、p38 MAPK、JNK和ERK多克隆抗体。
在足够的暴露时间后,用激光密度计对放射自显影图进行分析。水平表示为磷酸化与非磷酸化MAPK的比率。
统计数据
所有数据均以平均值±sem表示。使用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis检验对绝对值进行统计分析。
结果
[cAMP]的影响一世-IL-1β诱导eotaxin释放和表达的提升剂
下图显示了以下结果 1.⇓.目前的作者无法在未受刺激的HASMC中检测到任何eotaxin mRNA或蛋白质,但是,如前所述,IL-1β诱导了巨大的蛋白质释放4..分泌的eotaxin实际值为26±3 ng·mL-1福斯科林先生(10) µM)使eotaxin mRNA表达降低68±4%(p<0.01,n=4)。使用forskolin也显著降低eotaxin蛋白释放(73±8%,p<0.01,n=4)。
细胞内环磷酸腺苷(cAMP)增敏剂对嗜酸性粒细胞趋化因子表达和释放的影响forskolin(10)预处理人气道平滑肌细胞 µM),8溴(8Br)-cAMP(1 mM)或前列腺素(PG)E2(1 μM),30 分钟后白细胞介素(IL)-1β(10 ng·mL-1)增加了4个 Ha) Eotaxin表达,表示为Eotaxin信使核糖核酸(mRNA)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA的比率。数据表示为仅对IL-1β的对照反应的百分比,并表示为四个独立实验的平均值±sem,使用从四个不同供体培养的细胞,细胞传代三到六次,重复进行。还显示了一个代表性实验的重复斑点。b) 嗜酸性粒细胞趋化因子24小时后释放 h、 *:p<0.05;**:p<0.01。
8Br-camp(1 mm)在刺激4小时后将Etaxin的mRNA表达降低38±12%(p <0.05,n = 4)(n = 4)(图1⇑).8Br-cAMP显著抑制eotaxin蛋白释放(58±9%,p<0.05, n=4)。
铂族元素2(1 µM)使eotaxin mRNA表达降低48±11%(p<0.05,n=4)。这些结果与蛋白质释放的结果一致。添加铂族元素2导致趋化因子释放显著减少。IL‐1β和PGE刺激24小时后2时,eotaxin释放量下降57±17% (p<0.05, n=4)。
[cAMP]的影响一世-IL-1β诱导MCP-1释放和表达的提升剂
下面的结果如图2所示⇓.分泌的MCP-1的实际值为106±13 ng·mL-1;当HASMC未受到刺激时,MCP-1的产生低于检测限(5 pg·mL-1)福斯科林先生(10) µM)使MCP-1 mRNA表达降低57±8%(p<0.05,n=4),蛋白质释放降低65±6%(p<0.01,n=4)。
细胞内环磷酸腺苷(cAMP)增加剂对单核细胞趋化蛋白(MCP)-1表达和释放的影响 µM),8溴(8Br)-cAMP(1 mM)或前列腺素(PG)E2(1 μM),30 分钟后白细胞介素(IL)-1β(10 ng·mL-1)增加了4个 h、 a)MCP-1表达,表现为MCP-1信使核糖核酸(mRNA)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的比率mRNA。数据表示为仅对IL-1β的对照反应的百分比,并表示为四个独立实验的平均值±sem,使用从四个不同供体培养的细胞,第三至六代,重复进行。还显示了一个代表性实验的重复印迹。b)24小时后MCP-1释放 h、 *:p<0.05;**:p<0.01。
8Br-cAMP (1 mM)使MCP‐1 mRNA表达降低29±9% (p<0.05, n=4), MCP‐1蛋白释放降低63±8% (p<0.01, n=4)。
铂族元素2(1 µM)使MCP-1 mRNA表达和蛋白释放分别降低51±7%(p<0.05,n=4)和53±4%(p<0.05,n=4)。
[cAMP]存在时阻断cAMP依赖性蛋白激酶的作用一世增加代理
使用forskolin 10后,IL-1β诱导的eotaxin和MCP-1产生显著降低(分别为73±8%和65±6%) 在HASMC中为µM。当添加PKA激活抑制剂H-89时,观察到forskolin对IL-1β诱导的嗜酸性粒细胞趋化因子和MCP-1释放的影响随浓度的变化而减弱,3个剂量组的残余减少率仅为28±7%和27±7% μM的H-89(p<0.01,n=6)(图。 3.⇓).
a) Eotaxin和b)白细胞介素(IL)‐1β刺激的人气道平滑肌细胞释放单核细胞趋化蛋白(MCP)‐1 (10 ng·mL)-1)和forskolin(10µM)在增加H‐89(环磷酸腺苷依赖蛋白激酶抑制剂)浓度(0.1、0.3和3µM)后,于30 min前加入。数据以单独对IL‐1β的对照反应的百分比表示,并以独立实验中使用4个不同供体培养的细胞、传代3至6个细胞的重复值的平均值±扫描电镜表示。* *: p < 0.01。
[cAMP]的影响一世-p38mapk、ERK和JNK激活的增敏剂
为了检验增加[cAMP]的影响一世在IL-1β诱导的P38 MAPK激活中,用10μm叉胶预孵育30分钟,然后用IL-1β刺激5,15,30,60或120分钟。免疫印迹分析显示P38 MAPK激活的峰值在5-15分钟之间,并且在60分钟后与基线相当。与用IL-1β处理的细胞相比,与Forskolin预孵育没有显着抑制磷酸化的P38 MAPK水平(图4A⇓).
A)磷酸化P38丝裂剂活化蛋白激酶(P-P38Mapk)的比例,以不磷酸化的P38 Mapk,B)磷酸化的C;N在白细胞介素(IL)‐1β刺激的人气道平滑肌细胞中,‐terminal kinase (p‐JNK) to un磷酸化JNK和c)磷酸化的细胞外信号相关激酶(ERK) to un磷酸化ERK-1),有或无forskolin(10µM),以显示时间点。所有数据均表示为平均值±sem (n=4)。
IL-1β(10 ng·mL-1)还诱导JNK和ERK的苏氨酸和酪氨酸磷酸化,在15–30分钟后激活峰值 此后,60分钟后,激活减少并消失 与添加10%的对照组相比,JNK或ERK激活没有差异 µM forskolin(图。 4b和c⇑).
讨论
在这项研究中,目前的作者观察到[cAMP]的增加一世诱导IL-1β刺激的HASMC中eotaxin和MCP-1的表达和释放减少。已知的PKA抑制剂H-89能够阻止观察到的forskolin对IL-1β诱导的eotaxin和MCP-1蛋白释放的抑制,表明这些作用依赖于PKA。作者还证明[cAMP]一世不调节IL - 1β诱导的p38 MAPK、ERK或JNK的激活。
众所周知,cAMP可以调节多种基因的表达。为了研究IL‐1β诱导的eotaxin和MCP‐1释放是否可以被cAMP调节,我们将IL‐1β与AC的直接刺激因子forskolin、cAMP的类似物8Br‐cAMP或PGE联合刺激HASMC2,已知激活前列腺受体EP2和EP.4..众所周知,所有这些药剂都会增加[营地]一世17那18. [营地]的增加一世导致eotaxin和MCP-1 mRNA表达减少。eotaxin和MCP-1蛋白的释放也减少(4周后) 这些数据与运动员的研究结果一致等.19谁发现了那个PGE2在抗胸腺细胞抗体诱导的肾小球损伤中降低肾小球MCP‐1 mRNA的表达。在HASMC中,庞和诺克斯已经证明了这一点20增加[cAMP]一世显著抑制TNF-α诱导的eotaxin释放。此外,同一组研究表明,沙丁胺醇和福斯科林是两种[cAMP]一世与单独使用类固醇相比,增加药物和皮质类固醇对TNF-α诱导的IL-8释放的抑制作用更强21.此外,在TNF - α孵育的人和小鼠系膜细胞中,已显示[cAMP]的增加一世抑制TNF-α诱导的MCP-1基因表达10那22.Ammit等.23已经证明,RANTES(激活后调节,正常T细胞表达和分泌)释放在[cAMP]增加后减少一世在哈斯姆。目前的结果证实了Hallsworth的结果等.24,表明cAMP能够减少IL-1β诱导的嗜酸性粒细胞趋化因子的产生。然而,目前的研究范围更广,据作者所知,这是第一次在[cAMP]增加后观察到eotaxin和MCP-1 mRNA表达和MCP-1释放减少一世在Hasmc用IL-1β刺激。此外,作者已经证明了这种效果是PKA依赖性的。
本研究增强了目前关于cAMP在IL-1β诱导的气道炎症中作用的认识。IL-1β是哮喘中的一种促炎症细胞因子,它可能通过增加趋化因子的释放从而增加炎症细胞的吸引力而加剧炎症。然而,与此同时,似乎存在一种平衡,一种通过激活环氧合酶-2从而激活细胞内PGE来减少炎症反应的机制2释放,导致前列腺受体EP的激活2和EP.4..这增加了[营地]一世25,减少趋化因子的释放,如本研究所示。因此,增加[cAMP]一世可能被认为是一种自动制动机制,可防止炎症过度并导致明显损伤。
经典观点认为,cAMP的作用是由其受体PKA介导的,PKA可以磷酸化细胞质和核室中的多种靶蛋白26.一些作者推测,负责营地和PKA负责的AC,以这样的方式排列,通过分子机制将阵营从AC转移到PKA27. 相反,在一些细胞类型中,cAMP的某些作用被描述为与PKA无关。在胰岛β细胞系INS-1中,已经证明用H-89抑制PKA不能逆转forskolin诱导的胰岛素转录抑制12. 布莱斯et al。25结果表明,db-cAMP和forskolin提高cAMP活性对受刺激外周血单个核细胞增殖有显著影响。这些抗增殖作用甚至在与选择性PKA抑制剂共孵育后仍然存在28因此,目前的作者研究了是否有可能用PKA的特异性抑制剂H-89阻断forskolin诱导的嗜酸性粒细胞趋化因子和MCP-1生成的减少。在forskolin刺激后,观察到MCP-1生成减少的浓度依赖性抑制。这表明PKA参与增加[cAMP]后观察到的eotaxin和MCP-1产量的减少一世. 最近,在HASMC中观察到H-89治疗可阻止沙丁胺醇对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、RANTES和eotaxin释放的抑制作用24.研究表明,阻断PKA会降低添加沙美特罗(众所周知沙美特罗会增加[cAMP])的协同抑制作用。一世),21相反,同一组的研究表明,阻断PKA不会改变TNF-α诱导的eotaxin释放20.这些数据表明cAMP的作用是多么复杂,以及它是如何依赖于用来刺激细胞的细胞因子的。
据目前作者所知,他们是第一个描述阻断PKA可以阻止在HASMC中观察到的IL-1β诱导的eotaxin和MCP-1产生的减少的人。
以前的研究表明,在某些细胞类型中,cAMP对p38mapk的激活有调节作用29那30.在之前的研究13本研究作者表明p38 MAPK、ERK和JNK是IL-1β诱导的eotaxin和MCP-1表达和产生的重要途径。因此,增加[cAMP]对IL-1β诱导的这些MAPK活化的影响一世调查了。但是,当增加[营地]一世在IL-1β诱导的p38 MAPK、ERK或JNK激活中未发现任何作用。观察到的cAMP诱导的eotaxin和MCP-1表达抑制机制尚不清楚,需要进一步研究。
总之,已经证明,人气道平滑肌细胞中白细胞介素-1β诱导的eotaxin和单核细胞趋化蛋白-1的蛋白释放和信使核糖核酸表达受细胞内环磷酸腺苷水平的调节;细胞内环磷酸腺苷的增加减少这些趋化因子的释放和信使核糖核酸的表达。细胞内环磷酸腺苷增加后观察到,环磷酸腺苷蛋白激酶似乎是趋化因子表达减少的关键因素。这些发现可能支持人类气道通畅的重要性肌细胞,不仅作为收缩细胞,而且作为促炎症细胞,可能在哮喘等疾病中诱导、增强甚至控制气道炎症。这些发现可能对未来新型抗炎药的开发具有重要意义。
致谢
作者要感谢横山(日本爱浜)和G. Opdenakker(比利时Rega研究所)赠送的人类eotaxin探针。
- 收到二○○二年十二月三日。
- 公认2003年4月15日。
- ©ERS期刊有限公司