摘要
血小板活化因子(PAF)诱导的中性粒细胞肺分离可能需要细胞表面粘附分子(巨噬细胞-1抗原(MAC-1)和淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1))。在这项随机、双盲、交叉研究中,对9例轻度间歇性哮喘患者进行了PAF和Lyso-PAF(L-PAF)气道激发后的中性粒细胞动力学研究。
在支气管激发前和激发后5、15、45和240分钟外周血(PB)以及激发前和激发后240分钟诱导痰中检测中性粒细胞。通过免疫细胞化学和白三烯B检测MAC‐1和LFA‐1的表达4(LTB4),用酶免疫法测定诱导痰上清。
与基线相比,PB中的中性粒细胞减少了5 PAF后的最小值,而在240 诱导痰中min中性粒细胞增多。与基线检查和L-PAF相比,PAF降低了5岁时PB中MAC-1和LFA-1阳性中性粒细胞的百分比 但增加了中性粒细胞诱导痰中MAC-1和LFA-1的百分比。此外,与基线检查和L-PAF相比,PAF诱导的痰显示出更高的LTB4这一发现与诱导痰中中性粒细胞数量增加有关。
这些发现表明巨噬细胞‐1抗原和淋巴细胞功能相关抗原‐1参与血小板激活因子诱导的中性粒细胞肺交通,并且这个过程被增强的白三烯B调节4在气道内放松。
这项研究得到了加泰罗尼亚大学委员会(2001-SGR00386)、欧洲呼吸学会(ERS)的研究拨款(2000)、Sanidady Consumo部长(Redes Temátions de Investigación Cooperativa, CO3/11)和Esteve集团的资助。188bet官网地址A. Acuña得到了委内瑞拉加拉加斯Gran Mariscal de Ayacucho和西班牙Instituto de Cooperación Iberoamericana (ICI)的支持。
越来越多的证据表明,中性粒细胞可能在不同形式的哮喘中发挥重要作用1- - - - - -6. 事实上,中性粒细胞数量的增加和不同的激活模式,以及中性粒细胞弹性蛋白酶和白细胞介素(IL-8)水平的增加已经在以前得到证实7,8.中性粒细胞和内皮粘附分子在轻度特应性哮喘的血液和痰细胞中表达异常9以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)加重期间10.这可能是由于在COPD加重期间,肺循环中中性粒细胞的隔离增加,导致激活的中性粒细胞在肺内的区隔11.然而,在哮喘和慢性阻塞性肺病中,中性粒细胞从肺血液运输到肺间隙的确切机制,至少在一定程度上,仍未确定。白三烯B的释放4(LTB4)可能导致中性粒细胞趋化和中性粒细胞与内皮细胞的相互作用12,中性粒细胞也是LTB的重要来源413.LTB4COPD患者诱导痰中的水平升高,与弹性蛋白酶活性相关14和LTB4是哮喘和慢性阻塞性肺病中可能参与中性粒细胞隔离的介质之一。
血小板活化因子(PAF)是一种可能参与支气管哮喘发病机制的炎症介质。据推测,paf诱导了肺内中性粒细胞的短暂隔离,这已显示异常15- - - - - -17和哮喘患者18,可能是一个有用的实验室诱导模型,以研究中性粒细胞动力学比起现场目前的作者小组已经研究过它的一些机制15,17,18.在循环血腔内,PAF引起短暂的中性粒细胞减少,接着是中性粒细胞增多,中性粒细胞在肺组织和支气管肺泡腔内募集16,17.也有一些证据表明中性粒细胞被激活,因为在PAF暴露后中性粒细胞体积增加16.PAF是否诱导中性粒细胞表达整合素,从而增加其与血管内皮或呼吸上皮的黏附,分别允许中性粒细胞从血管腔室进入组织或从后者进入支气管肺泡腔,尚不清楚。PAF还可以通过P -选择素促进巨噬细胞‐1抗原(MAC‐1)(CD11b/CD18)依赖的中性粒细胞粘附内皮细胞19,20.PAF本身可增加白细胞黏附而不改变血管直径21.同样,PAF可以促进中性粒细胞诱导的CD11b上调和L -选择素脱落22,通过上调细胞间粘附分子(ICAM) 1,也可导致中性粒细胞粘附内皮细胞23此外,PAF有可能通过刺激LTB的释放促进中性粒细胞的募集4哮喘患者气道上皮细胞的变化24,25, PAF过表达MAC‐1后也观察到这种机制26.
诱导痰是评估气道炎症的有效方法27.利用这一工具,本文作者测试了PAF是否通过调节中性粒细胞整合素诱导哮喘患者气道中中性粒细胞的积累。PAF或Lyso-PAF (L‐PAF),其非活性代谢物的影响28,关于β的表达2从外周静脉血和诱导痰中分离的中性粒细胞中发现‐整合素(MAC‐1和淋巴细胞功能相关抗原- 1 (LFA‐1))和LTB水平4在轻度哮喘患者的痰上清中进行研究。
方法
患者
该研究招募了9名不吸烟的轻度哮喘患者,并获得了伦理研究委员会的批准,并给出了知情的书面同意。入选标准为:年龄>18岁,<45岁;在过去6周内没有呼吸道感染或哮喘加重;一秒用力呼气量(FEV)1)预测值≥70%,停药12小时后≥1.5 L,正刺激剂量的methacholine导致FEV下降20%1(PD20.<1.9µmol);PAF反应阳性,评估为总呼吸系统阻力增加≥35% (Rrs) 5 PAF后最小值(18 µg)吸入;以前没有使用过口腔甾体类药物治疗;除哮喘外,无任何全身或心肺疾病。所有受试者均为特应性。维持治疗包括必要的气溶胶短效选择性β-肾上腺素能激动剂(表1) 1.⇓).
研究设计
患者在08:00分四次进入实验室。所有访问间隔1周。第一次就诊时,进行临床和功能评估。第二次就诊时,患者接受基线痰诱导。在接下来的两次随访中,患者以随机、双盲、交叉的方式接受PAF或L - PAF支气管刺激。巴基斯坦空军(C16,1‐O‐十六烷基‐2‐乙酰锡甘油‐3‐磷酸胆碱;18µg;瑞士劳费尔芬根Novabiochem AG)和L‐PAF(C16,1‐O‐十六烷基锡甘油‐3‐磷酸胆碱,完全饱和;18μg;Novabiochem AG)的挑战如前所述进行15.在支气管激发前以及吸入PAF或L - PAF后的5、15、45和240分钟进行一组重复测量。这些测量包括Rrs(不是240 分钟),通气和心脏频率记录,外周静脉采血。同时诱导痰 根据先前的研究,完成支气管激发后的分钟16.完成研究的参与者对所有挑战的临床耐受性良好。需短效β2‐激动剂只能使用到研究前24小时。
测量
Rrs用强迫振荡技术测量了其温度15在每一个病人。三导联心电图,心率和动脉血氧饱和度通过脉冲血氧计(HP M1166A;Hewlett-Packard, Boblingen, Germany)的数据在整个研究日都被连续记录下来。通过插入外周静脉的导管厌氧采集外周血(PB)样本。
外周血中性粒细胞的分离
如前所述,中性粒细胞和单核细胞通过葡聚糖沉淀和在Ficoll垫上离心分离29.随后,中性粒细胞和单核细胞计数和活力分别通过血球计和台台蓝染料排除进行评估,并从2×10获得5细胞固定在丙酮中,保存在−70℃,用于后续免疫染色29.
诱导痰及处理
由De Vilbiss Ultraneb 99超声雾化机(Healthcare Inc., Somerset, PA, USA)依次雾化3,4和5%无菌高渗盐水溶液5分钟,通过吹口诱导痰,如前所述,不使用阀或鼻夹27,29- - - - - -31.随后立即对新鲜诱导痰标本进行处理。选择痰塞,称重,与四倍大体积的0.1%二硫苏糖醇(DTT)混合并处理,如前所述4.根据痰塞重量的不同,痰液上清量也不同。样品的最小重量为200mg,认为对随后的分析是满意的。上清保存在−70°C,细胞颗粒在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬,以评估细胞活力,总细胞数和差异细胞数,并用于细胞纺丝的制备。用May-Giemsa-Gruenwald染色的细胞离心机进行细胞计数。在所有病例中,由两名盲观察人员计数200个非鳞状细胞,结果以非鳞状细胞总数的百分比表示。
外周血和诱导痰中性粒细胞粘附分子的表达
使用两种特异性单克隆抗体(mAb 2LPM19c)评估PB和诱导痰中CD11b/CD18 (MAC‐1)和CD11a/CD18 (LFA‐1)(DAKO A/S, Glostrup, Denmark)的表达:mAb 2LPM19c与人MAC‐1蛋白的165kd A‐chain (CD11b)反应;和mAb E25.3,直接针对MHM24,与人类LFA - 1蛋白(DAKO a /S)的180-kd a‐chain (CD11a)反应。这些抗体分别以1:100稀释1 h。一种无关抗体抗免疫球蛋白G1(DAKO) 1:10稀释作为阴性对照。用链霉亲和素-生物素碱性磷酸酶技术进行免疫反应。两名观察人员分别独立读取每张幻灯片上的400个细胞。结果以阳性中性粒细胞减去总PB的百分比或诱导的痰细胞比率表示。观察者间的一致系数很好(Kappa=0.93)。
白三烯B4诱导痰的测量
痰LTB4如前所述,通过特定的酶免疫分析方法(英国小查丰阿默森国际有限公司)评估水平29. 该方法的检测限为6 pg·mL−1. 在分析之前,将样品稀释1:5,并根据稀释度校正该值。
中性粒细胞趋化性试验
从健康供体PB中获得的中性粒细胞以1×10浓度重悬6毫升−1在含CaCl的PBS中2(0.5 mM)和MgCl2(1 mM),并检测PAF和L‐PAF激发患者诱导痰上清液对中性粒细胞的趋化活性。此外,为了评估诱导痰标本的趋化活性是否与LTB的存在有关4,在存在和不存在LTB的情况下进行实验4受体拮抗剂(LY-223982, 10µM;Eli Lilly, Basinstoke,英国)。使用48孔微趋化室进行趋化(Costar;neuroprobe Inc., Cabin John, MD, USA),如前所述29.趋化试验用诱导痰上清量为27ml。标本在测定中性粒细胞迁移前不稀释。通过计算迁移到孔径为3µm的趋化室滤纸上的细胞数量来评估迁移。每个实验条件都是重复进行的,并对3到4个区域的细胞迁移进行评估。LTB的趋化活性4此外,在相同浓度的诱导痰上清液中,在0.1%DTT溶液中自发迁移的细胞数也进行了评估(即。在数据分析之前,从所有测量值中减去阴性对照)。
统计分析
数据表示为中位数(25 - 75%)。多重比较Rrs中性粒细胞和粘附分子表达采用单因素方差分析(ANOVA),并用Bonferroni校正。使用带有Bonferroni校正的Wilcoxon标记试验评估痰细胞差异。相关性采用斯皮尔曼等级检验。A <0.05被认为是显著的。
后果
攻毒后全身、肺阻力及细胞变化
8例患者在PAF后5分钟出现面部潮红和呼吸困难,2例出现咳嗽,1例出现轻度鼻炎。相比之下,L - PAF后没有明显症状。PAF后5分钟,与基线相比,Rrs增加(p<0.0001)(表 2.⇑),而PB中中性粒细胞减少(p<0.004)(图1⇓).随后,与5 min相比,15 min (p<0.0005)、45 min (p<0.0002)和240 min (p<0.0001) PB中性粒细胞增加。相比之下,L - PAF后没有变化。
![图1. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/22/2/290/F1.medium.gif)
外周血a)中性粒细胞及其b)巨噬细胞‐1抗原(MAC‐1)和c)淋巴细胞功能相关抗原- 1 (LFA‐1)在各自基线(BL)和lyso -血小板激活因子(L‐PAF)和PAF后5分钟的表达。横线表示中值。#:p<0.006;¶:p<0.004;+:p<0.003;§:p<0.002;ƒ: p < 0.02。
与基线和L‐PAF相比,两者诱导的痰总细胞数、活力和PAF后的鳞状细胞百分比没有显著差异(表3)⇓).然而,中性粒细胞百分比(诱导痰中的中性粒细胞)增加(p<0.04和<0.008)(图2⇓),而巨噬细胞减少(p<0.02, <0.008)。相比之下,每次注射后嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和上皮细胞的百分比基本保持不变。
从外周静脉血(a、b、e和f)和诱导痰(c、d、g和h)中分离的中性粒细胞在基线(顶行)和5(外周血)和240时对巨噬细胞-1抗原(a、c、e和g)和淋巴细胞功能相关抗原-1(b、d、f和h)的代表性免疫染色(红色) 血小板活化因子(PAF)激发后的分钟(痰中)(最下面一行)。数据显示,与相应的基础染色相比,暴露于PAF后,这两种分子的表达(外周血)减少(痰)增加(痰)。
Immunodetection的β2-外周血和诱导痰中性粒细胞中的整合素
与基线和L‐PAF相比,PAF后5分钟,中性粒细胞在PB中表达MAC‐1 (p<0.003)和LFA‐1 (p<0.004和<0.02)的百分比分别下降(表2)⇑,以及无花果 1和2)。发现在PB中表达MAC-1和LFA-1的中性粒细胞百分比减少与PB中中性粒细胞减少之间存在显著相关性(rho分别为0.89和0.87;p<0.02) PAF后min。L-PAF后未观察到任何变化。
相比之下,与基线(10.1(5.5-12.1)%)和L‐PAF(10.2(7.1-17.8) %)相比,PAF暴露后,中性粒细胞诱导的表达MAC‐1的痰液百分比增加(至25.0 (16.5-35.4)%)(p<0.02和p<0.008)(图)。2和3⇑⇓,及表3⇑).同样,与基线(10.1(4.4-12.5)%)和L‐PAF(10.3(7.2-17.7) %)相比,PAF后诱导痰中表达LFA‐1的中性粒细胞百分比增加(至24.5 (20.1-38.6)%)(p<0.008),尽管有3例患者没有反应,表明在吸入PAF期间存在异质性。诱导痰中表达MAC‐1和LFA‐1的中性粒细胞百分比的增加与诱导痰中中性粒细胞的增加具有显著相关性(rho=0.84, p<0.02;rho=0.73, p<0.04)。
诱导痰的百分比a)中性粒细胞及其b)巨噬细胞‐1抗原(MAC‐1)和c)淋巴细胞功能相关抗原- 1 (LFA‐1)在各自基线(BL)和lyso -血小板激活因子(L‐PAF)和PAF后240分钟的表达。当排除PAF后MAC‐1和LFA‐1的两个最高个体值时,两者的差异仍然显著(n=7;P分别<0.032和<0.02)。横线表示中值。#: p < 0.04;¶:p<0.008;+: p < 0.02。
白三烯B4诱导痰上清的测定
与基线(0.32 (0.30-0.60)ng·mL)相比−1) (p<0.02)和L‐PAF (0.44 (0.35-1.05) ng·mL−1LTB) (p < 0.03)4水平增加(至1.36 (1.09-2.73)ng·mL−1) PAF后240 min(图4a⇓),其升高与诱导痰中中性粒细胞数量升高密切相关(rho=0.83, p<0.02)(图4b⇓).
a)个体白三烯4(LTB4)在基线(BL)和lyso -血小板激活因子(L‐PAF)和PAF后240分钟诱导的痰上清中水平。当两者LTB最高时,这些差异显著4排除PAF后的值(n=7;p < 0.05)。横线表示中值。#:p<0.02;¶: p < 0.03。b)增加的LTB之间的Plot4诱导痰上清液和外周静脉血中的绝对中性粒细胞水平5 PAF激发后的min,均以对数标度表示。rho:0.83;p<0.02。
中性粒细胞趋化性
与基线(31.0(25.7-40.7)细胞·高功率场相比−1)和L‐PAF(46.0(27.3-56.5)细胞·高功率场−1)中性粒细胞趋化活性增加(达到169.2(148.9–199.3)个细胞·高功率·场−1) (p<0.008,各)(图5⇓).此外,中性粒细胞与LTB预孵育4受体拮抗剂LY-223982对PAF诱导的痰液趋化活性的抑制率为52.8(38.7-62.9)%,表现为迁移中性粒细胞数量减少(89.0(68.0-99.5)细胞·高倍场−1) (p<0.008)(图5b⇓).
a)基线(BL)和lyso -血小板激活因子(L‐PAF)和PAF后240分钟诱导痰上清的趋化活性。#: p < 0.008。b)白三烯b的作用4(LTB4)受体拮抗剂(LY-223982) (LY)诱导的痰中性粒细胞趋化活性在BL(39.0(38.7-40.7)细胞·高倍场检测−1)和240分钟后L‐PAF(40.3(38.2-43.5)细胞·高功率场−1)和拥堵。与PAF相比,后者明显受到抑制。数据表示为减去阴性对照细胞迁移后,每个高倍场的单个迁移中性粒细胞(横杠表示中值)。¶: p < 0.008。
讨论
本研究最新的发现是增强了表达MAC-1和LFA-14的中性粒细胞的募集 h在轻度哮喘患者气道内暴露PAF后,这种增强的招募似乎是由LTB产生增加驱动的4,一种有效的中性粒细胞趋化剂。研究还表明,所有这些事件都与PAF后立即血液中性粒细胞下降和4小时后诱导痰中性粒细胞百分比增加有关。
这些发现为paf诱导轻度哮喘患者短暂性中性粒细胞肺隔离机制提供了进一步的证据15- - - - - -17和哮喘患者18. 据目前作者所知,这是第一项针对轻度哮喘的研究,表明暴露于PAF后气道中的中性粒细胞募集是LTB水平升高引起的化学触觉效应的最终结果4表达选择性粘附分子的中性粒细胞,如MAC‐1和LFA‐1。后者对于调节肺毛细血管内的中性粒细胞隔离及其随后穿越内皮性肺血管屏障的转运至关重要。隔离发生在对几种血管内炎症介质的反应中,至少需要两个连续步骤。第一,迅速将中性粒细胞隔离入肺循环,在30秒内导致中性粒细胞减少17,发生在不需要CD11/CD18的整个过程中,被认为涉及刺激诱导的中性粒细胞变形能力的下降11. 其次,这些毛细血管内中性粒细胞的长时间隔离超过几分钟,需要CD11/CD18介导的与内皮细胞的相互作用11.中性粒细胞在肺血管中的迁移受到中性粒细胞和内皮细胞黏附分子的紧密调控,例如在炎症部位32, ICAM‐1在活化的内皮细胞上高表达。因此,中性粒细胞可继续粘附通过直接β2量整合素ICAM-1识别33.在最近的一次体外学习34研究表明,暴露于PAF可增加中性粒细胞表面MAC‐1的表达。
目前的研究结果表明,哮喘患者PAF诱导的痰中通过MAC-1和LFA-1募集中性粒细胞的表达增加,可能在白细胞粘附和迁移穿过支气管和肺血管内皮的能力增加中起关键作用。这可能允许中性粒细胞在内皮细胞交叉处停止滚动,同时在LFA-1中建立快速粘附33,35.随后,MAC‐1可能促进中性粒细胞持续粘附到内皮细胞,这是中性粒细胞隔离到支气管和肺毛细血管并随后转移到肺组织的先决条件。PAF激发可能在中性粒细胞招募中发挥关键作用,这一事实也从中性粒细胞在PB和痰中性粒细胞中表达MAC‐1和LFA‐1的百分比的动力学中得到了提示。事实上,与基线和L‐PAF相比,尽管PAF后痰中性粒细胞在总细胞中表达MAC‐1和LFA‐1的比例显著增加,外周血静脉中性粒细胞在总细胞中的比例在更早的阶段下降(即。5. 因此,该数据表明,MAC-1和LFA-1在PAF后的中性粒细胞募集中起作用,并且是中性粒细胞穿过内皮屏障迁移的先决条件。这进一步得到了以下结论的支持:体外证据表明,PAF增加中性粒细胞的MAC‐1表达,导致整合素依赖的细胞粘附和外渗26,34.
尽管如此,β2量整合蛋白本身,虽然重要,但似乎并不是增强中性粒细胞在肺内积聚所需的单一机制。事实上,白细胞迁移是一个相当复杂的过程,粘附分子的表达只是其中的一个步骤。事实上,白血球要在肺实质内转移,就必须建立一个趋化梯度,以便白血球从支气管血流和肺血流分别募集到气道和肺间质。在各种能够促进气道中性粒细胞趋化的因素中,LTB可能发挥了核心作用412.本研究结果表明,无论是PAF刺激还是PAF刺激均能释放LTB4在哮喘患者的气道内或LTB4由PAF招募和激活的中性粒细胞释放,或两者都释放。此外,还发现LTB增加4与PAF后气道招募的痰中性粒细胞数量升高显著相关,提示LTB4可能与阻塞性气道疾病患者气道内的中性粒细胞募集有关36. 这一假设得到了理论的进一步支持体外这些实验显示,与基线或L - PAF后相比,PAF后获得的痰标本能够显著增强中性粒细胞趋化性。研究还表明,PAF诱导的哮喘患者痰液的趋化活性明显大于基线或L - PAF后获得的痰上清液的趋化活性。此外,这些数据表明痰中LTB有重要作用4在中性粒细胞募集过程中,由于LTB4受体拮抗剂可抑制PAF激发后痰液的中性粒细胞趋化活性。中性粒细胞的痰趋化活性与其LTB无关4浓度,可能提示痰样本中的其他介质,如IL‐8和肿瘤坏死因子‐α,可能参与了这个过程。
本研究选择哮喘患者而不是正常人,有两个原因。首先,以前已经发现,哮喘患者对灌注不平衡的通气反应程度比健康人更大,导致哮喘患者出现更大程度的低氧血症15,18其次,先前的研究表明中性粒细胞可能在哮喘中发挥重要作用,特别是在更严重的哮喘中1- - - - - -5.因此,作者想要证实这些观察结果,如果是这样,就检查这些整合素在中性粒细胞积累中的作用,因此,当前的研究旨在解决,至少部分地,中性粒细胞在哮喘中的转运问题。
所有的数据都表明白三烯B的增加4气道中的释放和随后的中性粒细胞募集增强可能是由于血小板活化因子刺激哮喘患者气道细胞中5-脂氧合酶活性的能力所致。先前的一项研究进一步证实了这一假说,该研究表明,暴露于血小板活化因子后,哮喘患者支气管肺泡液中分离的中性粒细胞和巨噬细胞释放出大量白三烯B4与健康人相比25,37.总之,两者都是β2在轻度哮喘患者中,‐整合素、巨噬细胞‐1抗原和淋巴细胞功能相关抗原‐1参与血小板活化因子诱导的中性粒细胞肺隔离,这一过程可能由白三烯B调节4在空中释放。此外,目前实验室诱导的肺内中性粒细胞转运模型可能有助于进一步探讨中性粒细胞动力学机制及其在慢性阻塞性气道疾病中不同干预措施的调节作用。
致谢
作者要感谢M.T. Carrión和C. Agustí提供的技术建议。
- 收到了2002年的10月25日。
- 接受二○○三年三月四日。
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