摘要
目前作者以前鉴定了表达癌细胞抗原(CEA)信使核糖核酸(mRNA)的循环细胞,其80%的肺癌患者患有远处转移。目前的研究前瞻性地验证了新型队列的数据,并将研究扩展到由肿瘤细胞表达的其他MRNA。
通过循环细胞中的循环细胞中的逆转录酶 - 聚合酶链反应分析CEA,细胞角蛋白19和20,醛糖酶A和上皮糖蛋白2(EPG2)mRNA,以及在32例肺癌患者24个月监测的32例肺癌患者的活组织检查和血液中.
醛缩酶A和细胞角蛋白19 mRNA均出现在所有对照组的循环细胞中;细胞角蛋白20未在任何肺癌活检组织中表达。EPG2 mRNA在所有活检中均出现,但在患者的循环细胞中未出现。癌胚抗原mRNA在29/32(90.6%)活检和17/32 mRNA肺癌患者循环细胞标本中出现。在这些阳性患者中,12/17在mRNA分析的9个月内发生转移。3例阳性患者死亡,1例随访失败,1例在24个月内没有发生转移。在24个月的随访中,12/15的阴性患者没有发生转移;1例随访失败,1例未表达CEA,另1例发生转移。
与其他肿瘤,细胞角蛋白19和20不同,Aldolasea和上皮糖蛋白2信使核糖核酸对于检测肺癌中的循环癌细胞是不可用的。循环细胞癌核核核酸分析有助于鉴定肺癌患者的转移风险。
意大利部长级部长dell'Università e della Ricerca (MIUR;意大利罗马);来自国家农业研究中心(CNR)的目标项目“生物技术”;感谢来自坎帕尼亚地区(Ricerca Sanitaria Finalizzata和L.R. 41/96)的代表。
肺癌是成人男性中最常见的肿瘤,大约有一半的患者在诊断时有远处转移1,或在几个月的手术中发展转移2.肺癌转移灶的检测影响肺癌的分期、预后和治疗3.那即.具有较高的转移复发风险患者可以从佐剂化疗中受益4..免疫细胞化学已被用于检测血液患者血液中的肿瘤细胞。然而,由于巨噬细胞的非特异性抗原表达,免疫细胞化学是复杂的,难以自动化并给出假阳性结果5..有人建议更敏感6.逆转转录酶 - 聚合酶链反应(RT-PCR)分析由肿瘤细胞表达的信使核糖核酸(mRNA)用于检测血液中血液中的肿瘤细胞作为结肠,胰腺和肺7.,前列腺8.和乳房6..然而,人瘤表达的几种MRNA物种在正常血细胞中非法转录9.那10.,处理后的伪原的存在可能降低RT-PCR分析的特异性9.那11..此外,由于人类肿瘤中的基因表达是不均匀的,单个mRNA标记可能不足以检测循环微转移9..
在回顾性研究,当前的作者发现癌胚抗原(CEA)中循环的肺癌患者与远处转移的> 80%的细胞12..目前的报告研究了CEA mRNA和由人类肿瘤的四种其他MRNA种类,以小说,独立的肺癌患者队列,前瞻性地监测24个月:细胞角蛋白19 mRNA由肺癌和其他肿瘤细胞表达5.那13.,通过RT-PCR从转移性胃肠道患者的循环细胞中检测到细胞角蛋白207.那14.那15.醛缩酶A mRNA,它可以区分肝硬化和肝癌16.上皮糖蛋白2 (EPG2) mRNA已被用于检测结肠癌的循环微转移17..
材料与方法
患者和样品
每位患者都对研究表示知情同意;该研究符合医学院伦理委员会的批准标准(意大利那不勒斯大学" Federico II ")。目前的研究分析了:1)来自19名健康志愿者的血液样本,以排除循环细胞中mRNA物种的非法转录;2) 32例未入选肺癌患者的纤维支气管镜活检(在进行细胞组织学取样时):19例鳞状细胞癌(Ia期:1;Ib阶段:5;IIb阶段:4;阶段iii a: 7;第四阶段:2);13腺癌(Ia期:1;Ib阶段:3; stage IIb: 2; stage IIIa: 6; stage IV: 1); 26 males and 6 females (mean age 61.2 yrs) to verify the expression of each mRNA species by neoplastic cells; the biopsies were divided into two macroscopically homogeneous samples, one for histology and the other for mRNA analysis; and 3) blood samples from the 32 lung cancer patients before treatment. The reference diagnosis for each patient was obtained by histological analysis of fibrobronchoscopic biopsies according to the 1999 modified World Health Organisation Criteria18.,和分段(表1⇓),基于全身计算机断层扫描(CT)和锝99 m骨闪烁成像,以肿瘤-淋巴结转移评分表示19..手术治疗22例,化疗治疗5例,连续24个月,每3个月监测一次CT和骨显像。随访失访2例,3个月内死亡3例。标本采集于乙二胺四乙酸(EDTA)管中,用于常规实验室分析。避免可能表达靶mRNA的皮肤上皮细胞污染20.,血液通过静脉穿刺和EDTA管进行取样。在含硫氰酸胍的管中收集活组织检查,以防止核糖核酸(RNA)降解12..所有样品在2小时内加工用于RNA提取,然后通过RT-PCR分析。
方法
提取RNA,如前所述分析CEA和醛曲酶mRNA12.那16..分析细胞角蛋白19,细胞角蛋白20和EPG2 mRNA如下:RT:25℃持续10分钟;42°C 30分钟;95°C 5分钟;聚合酶链式反应(PCR):94℃5分钟,其次是30次循环(305℃,30s,55℃,30s,72℃,30s,30s,72℃,72℃,5分钟,使用以前描述了引物细胞角蛋白1914.细胞角蛋白2021.和epg2.17..设计这些引物被设计成排除已知的假生素的扩增。此外,两种PCR引物排除了基因组脱氧核糖核酸(DNA)扩增,因为它们杂交的基因的两个连续外显子。使用经典Sanger方法和自动化装置测序从结肠和肺癌组织获得的几种扩增的互氧核酸(cDNA)样品12.以验证RT - PCR反应的特异性。此外,为了验证DNA是否被污染,每个RNA样本被分析两次(即.没有逆转录酶)。
每个分析系列包括两个正和两个负(NO mRNA)控制。为了检查RNA提取和RT-PCR,分析所有样品的甘油醛3-磷酸脱氢酶和超氧化物歧化酶管家mRNA12..为了防止随身携带污染,在不同的房间中制备溶液,DNA提取,RT-PCR和PCR产物的加工6.那22..每个样本通过两个独立的操作员分析了两次,每个样品都没有意识到由另一个的结果获得。
结果
对醛糖酶A,CEA和EPG2的四种肺癌样品进行的序列分析以及用于细胞角蛋白酶19和细胞角蛋白酶20的四种结肠癌样品,证实RT-PCR明确鉴定了正在调查的mRNA物种。来自正常对象的血液样品的初步分析表明,通过循环所有19个正常对象的血细胞表达醛糖酶A和细胞角蛋白19,而CEA,EPG2和细胞角蛋白20 mRNA未通过循环细胞从正常受试者循环。因此,醛糖酶A和细胞角蛋白19被排除在随后的分析之外,因为它们被正常循环细胞产生了两种。
通过肺癌样品验证了细胞角蛋白20,EPG2和CEA mRNA物种的表达。细胞角蛋白20 mRNA未被任何肺癌样品表达,因此被释放出来的分析,因为它不能识别肺部血管瘤的循环肿瘤细胞;EPG2 mRNA被所有27个肺癌活组织检查表达,并在29/32(90.6%);因此,使用这两个mRNA标记继续研究。
随后,在手术前对32例肺癌患者的血液样本进行了分析。29例肺癌患者血液中EPG2 mRNA均缺失。17/32例中检测到CEA mRNA(表1)⇑).这款17例阳性患者的十二例在血液采样的12个月内开发了远处转移,即.2例患者在诊断时发生转移,1例患者在分析后3个月内发生转移,6例患者在分析后6个月内发生转移,2例患者在分析后9个月内发生转移,最后,1例患者在分析后12个月内发生转移。3例阳性患者死亡,1例失访。一名阳性病人(即.不。27)诊断后24个月没有转移。特别是,来自该研究的6/16(37.5%)第I-II阶段I-II肺癌患者对诊断表达CEA的循环细胞是阳性的。其中三个在分析的九个月内发生了三种转移。
12个阴性患者的十二名诊断后24个月不含转移;一个消极患者失去了随访,诊断后3个月死亡。在一个消极的患者中(即.不。28),肺癌标本未表达CEA。特别是3/13 IIIa期肺癌患者诊断时,cea表达的血细胞呈阴性。术后24个月没有发生转移。
所有检测的RNA样本(血细胞和肺组织)超氧化物歧化酶和甘油醛3-磷酸脱氢酶管家基因均呈阳性。在所有实验中,两个阴性对照和两个阳性对照样本都给出了预期的结果。两名独立的操作人员获得的结果是一致的,除了三份来自肺癌活检的RNA样本,其中一份在两项实验中CEA为阴性,另一份为阳性。对这三个样本又进行了两次分析,结果呈阳性。最后,不含逆转录酶的样本均为阴性,排除了RNA样本的DNA污染。
讨论
目前的数据表明,细胞角蛋白19在正常受试者的血细胞中表达(即使使用了排除假基因扩增的引物),因此不能用于检测人类肿瘤中的循环微转移。因此,目前的作者证实了之前报道的正常循环细胞中细胞角蛋白19 mRNA的非法转录5.那9.那14.那23..类似地,在来自健康受试者的循环细胞中检测到aldolaseA mRNA,其限制其用于识别血液微转移的病例。通过这项研究,当前作者提供了关于醛溶酶A mRNA中的RT-PCR分析的第一个数据。Aldolase A涉及糖酵解途径,因此正常白细胞表达该mRNA种类并不令人惊讶。Cytokeratin 20,CEA和EPG2不是通过从正常对象的细胞循环细胞来表达,至少在使用本作者技术的敏感度(即.1在100,000个细胞中,12.).大多数研究都排除了正常血细胞中细胞角蛋白20、CEA和EPG2的非法表达,与作者的数据一致7.那9.那11.那17.那21.,尽管由于非法转录或假阳性,但常见的嵌套PCR通过正常血细胞显示CEA表达,但由于非法转录或误报10.那12.,20%的肺腺癌可以异常表达CK2015..因此,分析,以检测微转移循环之前,目前的作者建议了一些来自正常受试者的血液样品的,以便排除非法的转录所使用的RT-PCR程序进行测试。此外,必须在没有逆转录酶的情况下分析每个mRNA样品以检查DNA污染,并且必须通过用靶基因的两个连续外显子杂交来选择引物进行cDNA扩增,以排除基因组DNA的扩增10.那11..肺癌样品没有表达细胞角蛋白20;因此,该标记不能用于检测肺癌患者中的循环微量酶。通过RT-PCR在结肠,胰腺和胃癌中证明了细胞角蛋白20表达7.那20..可以想象,不同的肿瘤表达不同水平的细胞角蛋白20,而肺癌表达的水平无法通过RT - PCR检测到。目前作者的数据证实了EPG2在肺癌样本中表达17..然而,在所有被研究的肺癌患者的循环细胞中都没有检测到它;很可能,每个肿瘤细胞的mRNA表达量非常低,低于该程序的检测水平。因此,EPG2似乎不是肺癌中微转移循环细胞的敏感标记物。
本研究证实,大多数肺癌表达CEA mRNA。RT-PCR分析未能检测到CEA10.在目前和前一项研究中只有5/56肺癌活检12.;在这些情况下,可行用于分子分析的活组织检查不包括肿瘤细胞。在任何情况下,应检查在血液中mRNA分析mRNA之前的靶mRNA物种的表达诊断。循环细胞中的CEA表达似乎与本研究中大多数肺癌患者的远端转移的发展有关,他监测了24个月。该测试似乎特别有用于鉴定阶段I-II肺癌患者,其在目前研究中的三个案例中均衡的远离手术中较少的远处转移患者。类似于当前结果,牧民等等。2据报道,15%的第I-II患者在手术后12个月内开发转移,从而接受了徒劳的手术2.此外,可以选择肺癌患者,用于佐剂化疗,可选择辅助化疗,在手术后没有改善未选择的肺癌患者的存活4.那24..寻找表达CEA的循环细胞可能与仪器分期程序相关,以选择适合手术的III期肺癌患者;事实上,在目前的研究中,有3例III期肺癌患者在随访期间没有发生转移。在诊断时,他们在循环细胞中CEA mRNA的RT - PCR分析中为阴性。
总之,这项前瞻性研究了一种新型肺癌患者群群体支持,并扩展了癌细胞抗原信使核糖核酸核糖核酸分析循环细胞的概念是鉴定具有高转移扩散风险的肺癌患者的有用援助。其他信使核糖核酸物种似乎并不是有用的标记,至少对于肺癌:细胞角粉19和醛糖酶A不是瘤形成的特异性信号,也通过正常循环细胞表达;细胞角蛋白20不是由肺癌活组织检查表达的,因此不是肺部血管肿瘤细胞的标志物;上皮糖蛋白2未通过来自肿瘤癌的细胞循环细胞的明显水平表达。
致谢
作者感谢J.A.用于编辑文本的Gilder。
- 收到2002年11月29日。
- 接受2003年4月15日。
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