文摘
toll样受体2 (TLR2), toll样受体家族的一员,在识别中扮演一个重要的角色,和随后的免疫反应激活,分枝杆菌。TLR2的遗传多态性(精氨酸谷氨酸盐置换渣753 (Arg753Gln))与负面影响有关TLR2功能,这可能,反过来,确定分枝杆菌的天生的宿主反应。本研究的目的是探讨Arg753Gln TLR2基因的单核苷酸多态性在结核病(TB)患者与健康对照组相比。
回顾/控制进行了研究。的Arg753Gln TLR2基因多态性的研究在151年比116年结核病患者健康对照组种族和年龄。
TLR2多态性(腺嘌呤(A)等位基因)在7.7%和17.9的结核病患者和控制,分别。当这三个基因型的比例两组之间的比较,AA基因型被发现更重要的是与结核病有关。等位基因频率对鸟嘌呤(G)和被发现是对照组的0.95和0.05和0.86和0.14结核病病人组,分别。患结核病的风险增加6.04和1.60折的运营商应承担应承担的AA和GA基因型,分别。
总之,目前的数据表明,谷氨酰胺取代的精氨酸残753 toll样受体2基因多态性影响患肺结核的风险。
这项研究是在Akdeniz大学研究基金会的支持下,土耳其安塔利亚Akdeniz大学(2002.01.0103.008)。
结核病仍然是一个主要的死亡原因在全世界范围内,和疾病的发病率据报道,自1980年代初以来一直在增加。近三分之一的世界人口是感染结核分枝杆菌,而只有5 - 15%的人在他们的一生中患临床结核病感染1,2。确切的原因,为什么只有一些个人接触结核分枝杆菌发展不受控制的疾病和其他消除或限制疾病仍然是未知的。有证据表明,遗传因素可能是进步的疾病易感性增加发展的重要决定因素3- - - - - -7。疾病的免疫发病机制包括免疫系统的几个组件,特别是包括巨噬细胞、T淋巴细胞,应承担的肿瘤坏死因子α应承担(肿瘤坏死因子α应承担)和干扰素γ,在防御机制中发挥重要作用在这种微生物。多个组件的分枝杆菌刺激巨噬细胞,导致肿瘤坏死因子α应承担的产量的增加,这反过来,进一步激活巨噬细胞,导致肉芽肿形成8。最近的数据表明,多个组件的分枝杆菌也激活巨噬细胞,主要通过toll样受体(TLR) 2 (TLR2)8- - - - - -15。
通常包括一个家庭的哺乳动物细胞表面蛋白刺激促炎细胞因子基因转录,以应对各种微生物的配体。微生物通常调解细胞反应,但不是必需的吞噬作用。哺乳动物的TLR家族成员与巨噬细胞的激活了各种化学产品不同的细菌9,16。TLR2参与各种细菌脂蛋白的识别,如肽来源于包柔氏螺旋体,支原体和密螺旋体属,以及结核分枝杆菌13,17。阻止这种受体也取消了巨噬细胞的感知和响应能力分枝杆菌肽。通过激活巨噬细胞分枝杆菌的存在感TLR2(一线防御),引发免疫反应的激活(肿瘤坏死因子α应承担、白介素1应承担的生产、抗原加工、激活的T淋巴细胞,应承担的干扰素γ生产,等。)在以后的事件。在体外研究表明,TLR2激活直接导致细胞内杀害结核分枝杆菌由肺泡巨噬细胞18。
单核苷酸多态性(snp)是脱氧核糖核酸(DNA)序列变异发生在当一个单核苷酸(腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G))基因组序列的改变。许多单核苷酸多态性对细胞的功能没有影响,但是一些snp,特别是如果他们影响基因的功能,可以使人容易生病或影响他们对药物的反应19。洛伦兹et al。17报道一种新型TLR2基因的多态性(精氨酸谷氨酸盐置换渣753 (Arg753Gln)),导致细菌肽降低巨噬细胞反应,导致主机的减毒免疫反应。
本研究的目的是探讨发生Arg753Gln TLR2基因多态性的结核病患者与健康对照组相比。
Materıals和方法
研究对象
研究人口由151名新诊断结核病患者接受结核病治疗胸部医学部门,Akdeniz大学医学院,和国家结核病控制中心(安塔利亚,土耳其)在2002年3月- 2003年3月。
存在结核病的诊断标准被定义为至少一个的存在以下几点:1)临床和放射学结果符合结核病和积极的痰涂片抗酸的细菌在至少两个不同场合;2)文化积极痰、支气管灌洗和/或胸膜液以及样本以外的器官系统肺(尿液、精液、脑脊液、等。)结核分枝杆菌;和3)病理活检中结核病的证据材料(淋巴结、肺、等。)
病人没有提供确凿证据对结核病的诊断疾病或有额外的获得性免疫缺陷综合症等疾病,营养不良和/或糖尿病被排除在研究,以及那些来自不同的种族背景。
对照组由116无关的主题从胸部医学门诊的部门和肾移植捐赠者移植中心(Akdeniz大学医学院)被调查和被发现是健康的。对照组的入选标准是急性或慢性肺病的缺席对结核病和消极的历史。所有的控制都是来自同一种族和地理起源,住在同一个城市的结核病例。
人口数据,包括性别,年龄,和临床数据,包括结核病本地化,结核病的诊断方法,痰液检查结果,如果可用,复发肺结核诊断记录。
这项研究是经当地伦理委员会批准的Akdeniz大学医学院和书面知情同意了所有的病人和对照组。
TLR2的Arg753Gln多态性是研究结核病患者和控制在中央Akdeniz大学医学院的研究实验室。
基因分型的精氨酸谷氨酸盐置换渣753 toll样受体2的多态性
从边缘全血基因组DNA分离使用基因组DNA净化设备(MBI Fermentas,圣Leon-Rot德国)。从TLR2编码序列引物组设计(基因库加入88878号)用TLR2多态性检测放大耐火突变系统聚合酶链反应(PCR)在2258开放阅读框的位置20.。这多态性的结果在一个精氨酸(CGG)谷氨酰胺(CAG)替换和由此产生的基因型,因此,精氨酸/精氨酸(GG)、谷氨酰胺/谷氨酰胺(AA)和精氨酸/谷氨酰胺(AG)。
核苷酸序列的引物用于表1中列出了本研究⇓。与120 ng中提取DNA, PCR进行DNA扩增1 UTaqDNA聚合酶(MBI Fermentas), 8毫米脱氧核苷三磷酸腺苷(MBI Fermentas)和20 pmol每个引物。常见等位基因(G)的反应,与TLR2高F TLR2高R和TLR2 G的反应然后罕见的等位基因(A),与TLR2高F TLR2的R和TLR2量(TIB的MOLBIOL,柏林,德国),进行最后一卷50µL在下列条件:4分钟的初始变性在94°C,紧随其后的是35周期的变性1分钟在94°C,退火1分钟在62°C和扩展的1分钟吗°C,退火温度的变化。最后扩展进行了4分钟在72°C。放大在天才进行PCR系统(Techne,剑桥,英国)。
PCR产品受到在2%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色。470碱基对(bp)应承担的PCR产品放大使用TLR2的F和TLR2高R和328年英国石油公司应承担的产品使用地理TLR2和TLR2 F, G或者TLR2和TLR2 F。
一个p值< 0.05被认为是重要的。卡方测试被用于等位基因和基因型分布的比较研究。哈迪温伯格平衡评估使用霍尔丹的准确测试21。
结果
151年研究的患者52例(34.4%)是女性和99名男性(65.6%)。±sd他们的平均年龄为35.4±13.5岁。所有的病人和控制被种族的土耳其裔和生活在安塔利亚城市和省份。在第一个三个月,121例(80.1%)病例从国家结核病控制中心采样,而其余的患者样本收集部门的胸部医学Akdeniz大学医学院,在整个研究期间。
129年被诊断为肺结核(85.4%)情况下,结核病淋巴腺炎8(5.3%)和胸膜结核10例(6.6%)。一个病人(0.7%)有结核感染的骨头和另一个(0.7%)肾结核。两个病人(1.3%)有肺结核和结核淋巴腺炎(表2⇓)。
结核病诊断是由痰或支气管灌洗涂片积极性在20(13.2%)的情况下,由痰、支气管灌洗或胸膜液体文化积极111年(73.5%)例经病理检查和活检材料在22个(14.5%)例。两例肺结核和淋巴腺炎是由痰培养积极性和活检。复发的诊断结核病是由七个病例(4.6%)。
对照组由53个(45.7%)的男性和63名女性(54.3%)均值±sd年龄为35.9±14.8岁。25(21.5%)控制受试者的胸部医学门诊的部门,而其余的是健康的器官捐赠者移植的移植中心。血液样本没有来自不止一个个人从每个家庭。
基因型分布的结核病患者在表2中给出⇑。的TLR2 Arg753Gln多态性的等位基因发生在27(17.9%)151结核病患者(无花果。1⇓),而纯合子/一个等位基因携带者的多态性由14(9.3%)的结核病患者。的TLR2 Arg753Gln等位基因发生在9(7.7%)受试者在对照组,而两个(1.7%)是纯合子运营商的多态性。这项研究和对照组没有在哈迪温伯格平衡。哈迪温伯格精确检验p值分别为0.000和0.017的研究和控制组织,分别。对照组的偏差可能包含一个额外的AA有关的话题,因为那里是没有偏差这种基因型的一个而不是两个主题,即。偏差最小。卡方测试进行评估时的差异,两组之间的比率的三个基因型,AA基因型与结核病相关被发现更重要的是比GA和GG基因型(p = 0.022)(表3所示⇓)。G等位基因频率和被发现是对照组的0.95和0.05和0.86和0.14在病人组,分别。AA和GA基因型的优势比诱发结核病被发现是6.04(95%可信区间(CI) 2.01 - -20.08)和1.60(1.01 - -2.55),分别在病人。
![图1. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/23/2/219/F1.medium.gif)
典型的放大耐火突变系统聚合酶链反应(PCR)分析结果:a) GA(杂合的多态性的载体);b) AA(纯合子多态性的载体);和c) GG基因型(正常)。地理上乐队代表了470碱基对内部控制PCR片段和较低的乐队G(巷1)和(巷2)等位基因。
之间没有显著相关性检测TLR2多态性和结核病本地化(p > 0.05)。然而,两种情况之一的肺结核加淋巴腺炎是罕见的变异纯合子的载体(如表2⇑)。此外,在四个与结核病复发7例,一个是纯合子和三个杂合的TLR2携带者的多态性。
因为每个形式的结核病可能也被认为是一个不同的表型,进一步分析了只有在肺结核患者。肺结核组由88(68.2%)的男性和41个(31.8%)的女性平均±sd年龄为35.6±13.6岁。是17.8的等位基因频率(n = 23)与7.7% (n = 9)肺结核患者和健康对照组,分别,而纯合子(AA)基因型检测11例(8.5%)肺结核病人和两个(1.7%)控制。卡方测试执行时forevaluation比率的三个基因型的差异在两组之间,AA基因型与结核病相关被发现更重要的是比GA和GG基因型(p = 0.019)(表3所示⇑)。G等位基因频率和被发现是0.87和0.13肺结核组和对照组的0.95和0.05,分别。AA和GA基因型的优势比诱发结核病分别为5.55 (95% CI 1.68 - -18.34)和1.73(1.07 - -2.80)肺结核组,分别。
讨论
在目前的报告之间的显著差异被发现结核病患者和健康对照组TLR2 Arg753Gln多态性基因型和等位基因的分布。此外,它发现的等位基因频率TLR2 Arg753Gln多态性基因(等位基因)为4.7%(1.7%的纯合子和6%的杂合的)健康土耳其控制。洛伦兹et al。17这种突变在3%的人口。还需要进一步的数据来确定多态TLR2基因显示了一个民族不同的分布。
目前的数据清楚地表明,在病人组,纯合子的AA基因型的频率显著高于健康对照组,和这种差异仍然重要即使肺结核患者仅考虑在内(表3所示⇑)。目前的数据还表明,患结核病的风险与AA科目和GA的TLR2基因型多态性是6.04和1.60倍,比GG基因型携带者的分别。目前作者的知识,这是第一个报告显示TLR2基因多态性与结核病的发生。
它曾被证明了TLR2多态性导致减少巨噬细胞的能力应对一些细菌的肽17。康和崔22替换研究不同,精氨酸色胺酸在677年残渣,TLR2基因多态性的麻风病患者,发现一个强大的协会之间的多态性和麻风结节的但不是结核样的麻风病。这一发现表明TLR2基因及其多态性在疾病的易感性,可能通过一线防御机制受损。
Bochudet al。23表明TLR2基因的多态性引起巨噬细胞反应的严重障碍麻风杆菌、结核分枝杆菌。也表明,突变老鼠TLR2 (TLR2 P681H应承担)作为主导的负面抑制剂TLR2信号、和表达这种突变的原始细胞株抑制肿瘤坏死因子诱导毒性和无毒的反应结核分枝杆菌22。Reilinget al。10研究抗空气传播感染结核分枝杆菌TLR2, TLR4和CD14基因敲除小鼠和控制组织,发现TLR2基因敲除小鼠显示减少抗结核病高剂量暴露,但没有区别自然感染低剂量的机载条件下观察组。这些数据表明,携带有缺陷的TLR2基因可以增加进步结核病易感性疾病的诱发因素。然而,没有直接证据表明这种多态性导致特别免疫反应降低结核分枝杆菌。尽管患者和健康对照组之间的意义,TLR2多态性存在只在一小部分(17.9%)的结核病患者。因此,TLR2基因多态性可能影响疾病易感性的因素之一,和其他因素或缺陷在不同步骤的免疫反应(甚至其他多态性TLR2或其他通常也负责无法防止结核病感染疾病的进展。它已经表明,这些患者干扰素γ受体,IL 12或者IL 12应承担的受体转录缺乏或胰岛素信号传感器和催化剂1突变显示对分枝杆菌感染的易感性增加7,24- - - - - -26。数据从其他研究表明,单核苷酸多态性的自然resistance-associated巨噬细胞蛋白1(溶质载体家庭11,成员1)和维生素D受体基因有助于人对结核病的易感性27- - - - - -29日。
在目前的研究中,连续的结核病病例都包括在内,但绝大多数肺结核患者。不可能展示所涉及的系统之间的关联和TLR2多态性。然而,例肺外结核病的缺乏限制了统计分析这些数据的器官偏好和主机TLR2等位基因之间可能存在的相关性(表2所示⇑)。的注意,然而,GA(3例)和AA(1例)基因型出现在四个七复发病例,而纯合子的AA基因型中检测出一个肺结核患者和淋巴腺炎。因此,本作者认为需要较大的系列检测TLR2基因多态性之间可能存在的相关性和器官偏好,以及临床疾病严重程度。
土耳其是一个温和的结核发病率的国家,每100000人口1999年达到33.7和26.3在2000年每100000人30.,31日。在这种情况下,所有的孩子都经常接种卡介苗(BCG)疫苗在土耳其出生后不久。BCG疫苗接种政策,由四个政府(2个月,5、12和17岁)到1998年,已经被更改为三个政府(在2个月和5和12岁)。结核菌素皮肤试验(TST),因此,具有很高的积极性率在土耳其和积极的结核菌素不区分最终之间由于接触或卡介苗接种疫苗。在土耳其人口的机会获得一个对照组与消极TST几乎是不可能的,因此,结核菌素并不表现在对照组排除结核病。
偏离哈迪温伯格平衡在组会造成真正的遗传关联。考虑可能的原因偏离哈迪温伯格平衡遇到在对照组,因为病人和对照组受试者同时进行同样的实验室技术员在同一实验室,它认为基因分型错误率最小。在研究小组的形成,包括每个家庭只有一个主题,以避免包括近亲的可能性。然而,它是不可能评估的发生在家庭婚姻中科目。近亲婚姻仍然是非常常见的在土耳其和总血亲率是35.2%,28.3%和39.6,农村和城市地区,1989年分别在安塔利亚32。因此,近亲繁殖可能导致轻微偏离哈迪温伯格平衡观测的控制人口。自控制和案例的数量都是选择从同一来源的人口,它是认为观察到的SNP与结核病可能涉及到的直接功能效应多态性与另一个功能变体或连锁不平衡。
总之,精氨酸谷氨酸盐置换渣753 toll样受体2基因的多态性是另一个候选基因可能影响易感性增加肺结核疾病和进一步的发展和严重性和需要更大规模的研究来阐明这个问题。
确认
作者想要感谢h . Gulkesen统计分析和F。Gunseren建设性的批评。作者也感谢n .美力克g . Bilginer e . Yegin z Savcı和g . tan(国家结核病控制中心、海滨城市安塔利亚、土耳其)提供肺结核病人和大肠Toprak技术援助。
- 收到了2003年6月2日。
- 接受2003年8月28日。
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