文摘
非致命的肺炎球菌肺部感染模型需要调查免疫反应在复苏,和其他疾病之后的交互感染。非致命的肺炎球菌肺部感染的小鼠模型开发和遗传背景对磁化率的影响决定于BALB / c和C57BL / 6小鼠。
细菌侵入肺部和老鼠会产生轻微的临床疾病病理生理学类似于人类支气管肺炎。复苏与免疫细胞涌入,清除细菌,但诱导组织损伤肺炎支气管肺炎的特征。
间隙后,免疫细胞数量恢复正常和组织出现发炎。虽然细菌暴露和间隙相似,免疫细胞涌入和组织损伤的程度显著不同。大量的中性粒细胞和淋巴细胞进入肺组织和受灾地区在BALB / c和C57BL / 6小鼠相比。
炎症基础差异决定了更高层次的吞噬作用和氧化破裂观察BALB / c小鼠。C57BL / 6小鼠清除低剂降低免疫反应;然而,C57BL / 6小鼠更容易受到较大的接种物,它颠覆了免疫系统。这些结果从一个更大的炎症反应在不同的易感性BALB / c和C57BL / 6小鼠相比。
这项工作是由克莱夫&维拉Ramaciotti研究基金会,呼吸大潮基金,约翰亨特医院,和猎人医学研究所,澳大利亚的纽卡斯尔。
链球菌引起的肺炎(肺炎球菌)是最常见的病原体与社区获得性肺炎1尽管抗生素治疗,死亡率高得令人无法接受2- - - - - -4。自抗生素耐药性的快速崛起5有新的工作指向发展中保护antipneumococcal疫苗6和调查肺炎球菌肺感染的免疫反应7- - - - - -12。如果是预防肺炎球菌病的主要免疫反应可以阐明,然后这些反应可以通过适当的疫苗和疗法针对upregulation减少抗生素的必要性。
为了测试这些过程,适当的人类疾病的动物模型是必需的。可用的小鼠模型,代表了致命的人类疾病8,11,13- - - - - -16,老鼠发展与菌血症的严重的大叶性肺炎,通常是致命的。越来越多的道德反对使用致命的模型。此外,这些模型可能不一定反映反应能够成功清楚发生的肺炎球菌感染或更常见,那么严重感染,导致支气管肺炎。因此需要开发和研究肺炎球菌感染恢复模型。
明确的研究在小鼠恢复模型才刚刚开始。初步数据表明,嗜中性粒细胞流入,增加肿瘤坏死因子(TNF)α在支气管肺泡灌洗(BAL)肺炎球菌间隙流体和肺组织是重要的17,18。有越来越多的证据表明,链接的结果传染病在炎症反应的强度变化,取决于宿主基因多态性等特点19- - - - - -21。因此对肺炎球菌支气管肺炎等疾病的易感性可能源于宿主遗传因素和个体的遗传背景可能扮演重要的角色在决定脆弱性。一个模型的利什曼虫主要已经被广泛地用于显示BALB / c小鼠背景有一种倾向,应对一个更大的T辅助细胞(Th)地理类型2反应(产生的白介素(IL)高1β在IL 4,应承担的免疫球蛋白E生产)偏见到给定的微生物感染。这与Th1(干扰素γ应承担的版本)的反应在其他近交品系小鼠,即。C57BL / 6小鼠22,23。显性遗传位点也被卷入赋予自然抵抗,和不同品系的老鼠也显示不同对肺炎球菌感染的易感性18。肺炎球菌感染的遗传变异对复苏的影响是未知的。
本研究的目标是开发一个致命的肺炎球菌肺感染的小鼠模型,反映了theimmunological,组织学和人类肺炎支气管肺炎的病理特征,比较BALB / c和C57BL / 6小鼠免疫和炎症反应的差异从肺炎球菌肺部感染易感性和恢复。
材料和方法
细菌
人类临床分离(3)型肺炎球菌从成人下呼吸道感染获得c·约翰逊,约翰亨特医院、新南威尔士、澳大利亚。mouse-adapted应变(肺炎球菌D39 2型)是获得j·佩顿,儿童医院,南澳大利亚州阿德莱德。一个特征明显量3型肺炎球菌菌株(NC012695 (ACTC6303),民族文化收藏,艾格汉姆,英国)是由j·基德,澳大利亚堪培拉大学。菌株被储存在胰蛋白胨−80°C大豆肉汤(Oxoid、墨尔本,维多利亚,澳大利亚)有5%去纤维蛋白的马血,0.5%葡萄糖和20%甘油。回归曲线确定估计相当数量的细菌细胞。
动物
雌性BALB / c和C57BL / 6小鼠(具体无菌(SPF),年龄6 - 8周)是纽卡斯尔大学的获得和维护在SPF住房里。纽卡斯尔大学的所有程序都是通过动物保健和伦理委员会。
感染
细菌接种大豆胰蛋白胨琼脂板上补充血液5%和0.5%葡萄糖和孵化16 h (37°C, 5%的股份有限公司2)。第二天,在无菌磷酸盐殖民地收获(PBS;2毫升)。可行的数字是估计的回归曲线和经电镀系列稀释和计算结果菌落(cfu)。小鼠气管手术暴露后感染气管内的24剂剂量的2×106或2×107在50µL PBS或2×10 cfu4或2×105在30µL cfu PBS。菌株的比较,三为每个培养液浓度被感染小鼠和监控了72 h,然而,这些老鼠变得足够的几个生病需要安乐死结束之前实验(表1⇓)。模型的描述,八组小鼠感染和牺牲在0,4,接种后12、48和72 h。四只老鼠被用来恢复BAL流体和四个用于肺组织的集合。动物是由钠pentobarbitone牺牲(Provet Keysborough,维多利亚,澳大利亚)过量。类似的结果使用非手术的气管内的接种方法15。
症状监测
动物监测每小时10 h后接种,然后每4小时。临床异常指出+或+ +根据严重性。症状包括浅呼吸,增加呼吸努力,弯腰驼背的姿势,粗糙的外套,颤抖,缺乏运动和孤立。动物牺牲如果得分+ +表示为一个以上的异常。
血清收集和细菌复苏
动物牺牲,血液收集和细菌复苏血清测定血清收集的cfu /总量25。
发病机制研究
动物被牺牲和肺灌洗(2×1毫升PBS)。另外,全肺切除无菌和单一化1毫升的PBS使用Heidolph组织匀浆器。细菌复苏灌洗液或匀浆决心从串行稀释10倍。
炎症细胞
Cytospins是准备和苏木精和伊红染色(DiffQuick®;Provet)25。两张幻灯片/样本进行光学显微镜和免疫细胞的识别和量化在复制细胞每100细胞的数量。不同的免疫细胞的数量的变化与数字(0 h也决定。每个类型的免疫细胞的差异然后结合给整体变化与0 h。这提供了一个衡量总免疫细胞变化期间的感染。
组织学
肺被移除,缓冲福尔马林固定在10%,切割并且与苏木精和伊红染色。肺部炎症和损伤评估如前所述8,26。肺组织发炎的比例是由光学显微镜评估在低功率(10×)。发炎区进行高功率(100×)和肺损伤分数据戴维斯系统决定的8。这包括评估大量炎症细胞进入肺组织出血、水肿和组织损伤。整个组织学得分计算肺参与的百分比乘以从戴维斯系统获得的分数26。肺组织的代表被拍了照片。
支气管肺泡巨噬细胞的吞噬作用和氧化破裂化验和外围吞噬细胞
肺炎双球菌(类型3,NC012695)与二乙酸carboxy-fluorescein贴上标签,succinimidyl酯(CFSE)和opsonised孵化与50%混合血清(BALB / c和C57BL / 6)27。外周血细胞和支气管肺泡巨噬细胞与未感染BALB / c和C57BL / 6小鼠27。
吞噬作用和代活性氧中间体CFSE-labelled细菌测定在整个heparinised血液或通过流式细胞术肺灌洗27使用fluorescence-activated细胞分选仪,石中剑(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)流式细胞分析仪。控制包括血液、血液与肺炎双球菌、血液与dihydroethidium(σ,城堡山、新南威尔士、澳大利亚),结果读与肺炎双球菌和dihydroethidium的血液样本。
统计分析
使用Mann-Whitney测试执行统计分析两组的比较和克鲁斯卡尔-沃利斯检验比较三个或更多的团体。一个p值< 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
比较肺炎球菌菌株感染后的症状和入侵
结果气管内的接种BALB / c小鼠不同接种物的三个肺炎球菌菌株如表1所示⇑。小鼠接种人类临床分离并没有被感染,保持无症状。所有小鼠感染类型检测2株D39发达菌血症和实验结束之前被牺牲掉了。小鼠感染了高剂量的地理类型3株NC012695牺牲结束之前的实验。动物感染2×105cfu·30µL−1变得不活跃(后4 - 6小时);然而,这种效果只持续了几个小时。老鼠恢复,24小时后表现一般。所有的老鼠感染2×104cfu·30µL−1显示任何临床感染的迹象。NC012695菌株用于后续研究。
模型的描述和决心的遗传背景对细菌清除率的影响和组织损伤
感染的迹象
所有BALB / c和C57BL / 6小鼠感染2×105cfu 30µL应变NC012695显示活动4 - 6 h后接种与未感染的老鼠相比,但动物24小时内恢复。
细菌的间隙
落下帷幕流体减少细菌数量从最初的培养液水平为零后48 h(图。1⇓在12 h)和有显著降低(p < 0.025)的细菌数量BAL流体C57BL / 6 6 h而BALB / c小鼠。前6 h,细菌的数量从肺组织发生增加细菌生长,并在BALB / c和C57BL / 6小鼠相比,虽然不显著。细菌数量之后下跌12 h, 48小时没有可衡量的肺炎双球菌肺组织从鼠标应变。没有动物显示可衡量的细菌在任何时间点血清。之间的细菌清除了24 - 48 h(结果未显示)。
细菌检测支气管肺泡灌洗液(○)和肺组织(▪)后气管内的接种BALB / c和b)的C57BL / 6小鼠2×105克隆形成单位(cfu)链球菌引起的肺炎在30µL NC012695无菌磷酸盐。值表示为均值±sem cfu /双肺。每个时间点n = 4。*:p < 0.05在48和72 h postinoculation与初始剂相比,在48 h与12 h;#:p < 0.05 BALB / c和C57BL / 6之间在12 h postinoculation。
炎症细胞涌入
感染后,中性粒细胞和淋巴细胞肺组织招募了但决议后的恢复正常老鼠菌株(图2所示⇓和表2⇓)。在整个时间进程,中性粒细胞涌入与肺炎球菌数量(表2的变化⇓、无花果1和2⇑⇓)。中性粒细胞的比例显著增加4 h,达到12 h,仍在48小时明显升高,降低在72 h。4 h,在淋巴细胞有显著增加,从而显著降低在12 h,然后回到pre-infection的水平吗h。整体的所有免疫细胞数量的变化weredetected在4 h,由12 h和达到最大水平逐渐恢复到原来的水平在未来60 h(图2所示⇓和表2⇓)。BAL流体从BALB / c小鼠包含更多的中性粒细胞在4,12比C57BL / 6小鼠和48 h(表2⇓)。
免疫细胞涌入到支气管肺泡灌洗液)BALB / c和b)的C57BL / 6小鼠气管内的接种后2×105菌落链球菌引起的肺炎在30µL NC012695无菌磷酸盐。均值±sem巨噬细胞(○),淋巴细胞(□)和中性粒细胞(▵)细胞数量每100个细胞。▪:免疫细胞数的总偏差从水平0 h。每个时间点n = 4。显著差异见表2⇓。
组织学
接种(12到24小时)后,有证据awidespread实质炎症反应多病灶的血管周围和支气管旁聚集中性粒细胞和淋巴细胞,但如果任何肺泡渗出物或肺整合(结果未显示)。这种模式是一致的与支气管肺炎(小叶性肺炎),尽管没有证据表明脓。炎症细胞涌入成为可见4 h,达到最大水平12 h在BALB / c和C57BL / 6小鼠48 h,升高到72 h。肺出血被红细胞的存在表明,只有在肺泡空间BALB / c小鼠的肺组织。这是温和的,只有在发生4 h(图3所示⇓和表3⇓)。
![图3. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/23/2/224/F3.medium.gif)
肺组织病理学变化的照片BALB / c (a e)和C57BL / 6 (f j)小鼠接种后2×105菌落链球菌引起的肺炎在30µL NC012695无菌磷酸盐。肺癌部分是与苏木精和伊红染色在0 (f), 4 (b、g), 12 (c和h), 48 (d和i)和72年(e和j)接种后h。酒吧= 12.5µm规模。
肺组织肿胀明显,4 h,仍然是重要的两株72 h。组织损伤评估,评估的程度的修改和杂乱无章的肺组织肺泡结构。组织损伤明显在BALB / c 4 h C57BL / 6,但是直到12 h,直到72年目前h两株。肺组织参与炎症和重塑的比例在所有时间点较低的C57BL / 6与BALB / c小鼠相比,明显之后12 (p < 0.025), 48 (p < 0.05)。在这两个菌株的比例组织参与与控制水平相比显著增加5%,4 h, 20 - 30%在12 h和33 - 40%在48 h,但到72年下降到30% h肺组织开始恢复(表3所示⇑)。
总结
细菌感染的结果的摘要和间隙,循环免疫细胞涌入和组织学的变化如图4所示⇓。组织学变化遵循的涌入在应对细菌感染和免疫细胞间隙。感染完全被清除和免疫细胞分布和组织学评分被72 h回到preinfection水平。
总结复苏的描述模型,小鼠肺炎球菌肺炎(n = 4)。细菌复苏肺组织(▪)和组织病理学变化(○)随着时间的肺部)BALB / c和b) C57BL / 6小鼠感染2×105菌落的链球菌引起的肺炎在30µL应变NC12695无菌磷酸盐。相对的免疫细胞数量的变化百分比BAL流体在同一时期也显示c) BALB / c和d) C57BL / 6小鼠。
功能差异
大大增强支气管肺泡巨噬细胞吞噬活动和外围吞噬细胞,观察支气管肺泡巨噬细胞的氧化破裂BALB / c和C57BL / 6小鼠(p < 0.05;图5⇓)。
吞噬作用的链球菌引起的肺炎和活性氧中间体的生产)支气管肺泡巨噬细胞和b)整个heparinised血液从天真的雌性BALB / c(□)和C57BL / 6(└)小鼠(9 - 16 n =)。*:p < 0.05。
讨论
本研究报告可再生的复苏模型的肺炎小鼠的肺部感染人类疾病有相似之处,并比较不同遗传背景的老鼠的易感性。量3型肺炎球菌菌株NC012695培养液浓度的2×105在30µL cfu引起轻微的临床疾病,没有菌血症,老鼠恢复。
细菌数量在肺组织增加前4 h细菌最初坚持和殖民的肺部组织和增长,表明感染发生,但随后通过诱导免疫反应在48 h。炎症反应的特征是中性粒细胞涌入到落下帷幕,肺组织,达到12 h,然后下降,细菌数量减少。肺组织的组织病理学检查显示,肺损伤增加感染后48 h。这个时候,免疫反应已经清除所有可行的细菌细胞和炎症细胞的数量也相应减少。这些结果说明肺炎球菌的复苏模型建立了肺部感染的老鼠最初被感染,细菌是通过诱导免疫反应和老鼠从感染中恢复过来。
遗传背景的影响在这个模型中进行了调查,发现BALB / c有更强烈的中性粒细胞涌入和更严重比C57BL / 6小鼠肺损伤。这些结果表明定量免疫反应在两个菌株之间的差异。
非致命的模型描述人类疾病有许多相似之处。被感染的动物从临床疾病中恢复和可检测菌血症发生在只有一小部分的情况。模型的病理总值与支气管肺炎是相一致的28。尽管其他老鼠模型中观察到的大叶性肺炎疾病在年轻的成年人通常认可的模式,非典型形式越来越认可。肺炎球菌支气管肺炎更常见的非常年轻,老年人和免疫功能不全的。组织学变化的时间过程也相似,早反应涉及组织水肿和红细胞在肺泡空间的存在,其次是中性粒细胞涌入,正逐渐被巨噬细胞所取代(图2所示⇑)。在人类疾病的康复期间,中性粒细胞逐渐衰落,取而代之的是巨噬细胞浸润淋巴细胞29日,30.。
这种非致命的模型不同于致命模型定量细菌清除配置文件和组织损伤的程度,尤其是肺出血。在致命的模型中,细菌数量下降了16 h但是然后增加大量(> 108cfu·g−196 h后保持在这一水平,直到死亡8,11。目前的模型显示48小时完成清除细菌。组织损伤是致命的不同模型,增加红细胞外渗在整个时间进程96 h和非常丰富的72 - 96 h后,红细胞在球液变得可见8。在恢复期间,肺出血只是指出在BALB / c小鼠4 h,温和,与轻度肺炎球菌肺部感染的临床症状和体征。炎症细胞轮廓是定性相似的致命和恢复模型。相关巨噬细胞和中性粒细胞减少号码增加12 h达到最大水平24 h。落下帷幕,在多形核中性粒细胞(中性粒细胞)数量居高不下,而在肺组织中性粒细胞数量下降,取而代之的是单核细胞和淋巴细胞之间72 - 96 h8,10,11。
它仍然是未知的,然而,是否精确恢复模型中诱导免疫反应,导致细菌间隙,是致命的相同模型。特定的免疫因素在经济复苏模型的角色正在阐明。在小鼠模型中,细胞因子反应涉及并与肺炎球菌细胞的间隙从肺部感染和恢复包括肿瘤坏死因子α应承担、IL高1β在IL 6和IL 10和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子7,17,18,31日。人类遗传易感性的研究最近才开始但IL 10应承担的多态性与肺炎球菌感染性休克的风险增加32。这些免疫反应受到基因控制的,在本研究遗传背景的影响康复和肺炎球菌感染的炎症反应是检查。重要的是,这些结果表明,尽管细菌接种,两者之间的间隙和肺部暴露相似鼠标菌株,免疫细胞涌入的程度和组织损伤明显不同。这表明炎症改变鼠标strain-dependent而不是肺炎球菌产生的剂量或毒性。
BALB / c小鼠表现出临床症状,免疫细胞涌入显著增加,更多的免疫损伤的肺出血和一个更大的程度比C57BL / 6小鼠肺组织损伤。显著增加在支气管肺泡巨噬细胞吞噬活性和氧化破裂和氧化的外围吞噬细胞对BALB / c和C57BL / 6小鼠相比也被观察到。其他人也表明重要的功能性差异支气管肺泡巨噬细胞从BALB / c和C57BL / 6小鼠33。从C57BL / 6小鼠支气管肺泡巨噬细胞的吞噬能力更高,表现出更高层次的巨噬细胞与胶原受体的表达结构和增加一氧化氮的生成与BALB / c小鼠33。然而,在这些研究unopsonised粒子而不是肺炎双球菌,这表明这两个鼠标菌株对不同的炎症刺激的反应不同。
目前的观测表明,在感染,减少免疫和炎症反应是引起C57BL / 6与BALB / c小鼠相比,免疫,炎症和细胞基础的差异。这些结果扩展晶刚的观察et al。18他表明BALB / c小鼠能幸存的感染1×10吗6cfu mouse-adapted应变D39, C57BL / 6小鼠而∼60%在72 h或之前去世。在接种物水平较低(本研究和那些通常在自然界中遇到),小得多的免疫细胞和局部炎症反应诱导C57BL / 6比BALB / c小鼠。这些反应是充分清除感染最小损害肺组织造成宿主免疫反应。然而,当小鼠暴露于更大的毒性更强的接种物,C57BL / 6小鼠免疫反应不能够清除细菌,被免疫系统,导致菌血症和死亡。相反,放大了免疫反应的BALB / c小鼠能够清除接种物更强,这使复苏。
其他因素可能影响免疫反应的水平包括气管内的感染会导致不同类型的比鼻内感染34,或者不同菌株的小鼠有不同的敏感性不同的肺炎球菌菌株不同毒力的因素。目前的结果,这些晶刚et al。18表明,小鼠Th2背景比老鼠更容易感染肺炎球菌Th1背景,尽管48 h内的观察到细菌清除不包括自适应的参与T细胞复苏。机制尚不清楚,但可能涉及潜在的小鼠免疫反应之间的相互作用主要是Th2背景与先天免疫反应,如toll样受体和树突细胞分化。肺炎球菌pneumolysin多样性35,表面活性剂的差异蛋白质的活动36或未知的因素也可能扮演一个角色在微分磁化率。这个模型是有用的在考试中先天免疫功能不同的基因环境的识别重要的差异提供了进一步解剖免疫反应与复苏的可能性从肺炎球菌感染,这可能是被操纵的治疗优势。
肺炎球菌的复苏模型建立了小鼠的肺部感染,是人类支气管肺炎的代表。这个模型被用来表明C57BL / 6小鼠,显著降低免疫和炎症反应引发剂剂量的肺炎球菌菌株NC012695低于BALB / c小鼠。这将导致更少的inflammatory-associated损害但C57BL / 6小鼠的反应是被更高的更致命的肺炎球菌菌株接种物18。差异很小但可再生的和可能代表轻度感染和恢复之间的区别,或严重疾病的发病,以应对一些个人的接种物或免疫状态。这个模型比致命伦理上可接受的模型,可以用来研究支气管肺炎,抗生素、疫苗和治疗性试验、发病机制和免疫反应的研究。重要的是该模型适用于研究与可能发生的疾病或随后的肺炎球菌肺部感染和恢复如慢性阻塞性肺疾病和哮喘。
确认
作者要感谢p·福斯特和c·布莱克威尔对你的帮助在这个手稿的准备和r·库马尔援助与组织学的解释。
- 收到了2003年7月14日。
- 接受2003年9月16日。
- ©人期刊有限公司