摘要gydF4y2Ba
p27Kip1是一种周期蛋白依赖的激酶抑制剂,它负调控G1进程,据报道可调节细胞凋亡。该蛋白的磷酸化被认为是调节其细胞内定位和影响其稳定性。gydF4y2Ba
本研究的目的是调节A549肺腺癌细胞中p27Kip1的表达水平,并研究该蛋白如何影响细胞周期状态和调节生存能力。此外,使用含有p27Kip1 cDNA或磷酸化位点发生突变的突变体的表达载体,研究了p27Kip1磷酸化状态与其细胞内定位之间的关系。gydF4y2Ba
虽然过表达p27Kip1降低了细胞周期进展,但去除它并没有改变细胞周期状态。适度诱导p27Kip1可以挽救腺载体诱导的细胞凋亡,用短干扰RNA去除它会增加细胞的自发死亡。p27Kip1主要定位于细胞质,通过将丝氨酸(S) 10、苏氨酸(T) 157和T198替换为谷氨酸(拟磷),强制表达p27Kip1 cDNA诱导其细胞质定位。gydF4y2Ba
综上所述,在A549肺腺癌细胞中,p27Kip1在生理上的表达主要存在于细胞质中,对细胞周期状态影响不大,对细胞活力有贡献。还推测,p27Kip1的细胞内定位主导其功能,其定位部分由其磷酸化决定。gydF4y2Ba
石井先生是日本科学促进协会的研究员。这项研究得到了科学研究资助(B)(2)(#1355 7054)的资助,并部分得到了日本青年科学家科学促进协会研究奖学金的资助。gydF4y2Ba
p27Kip1是一种周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂(CDKIs),抑制CDKs的活性,调节哺乳动物细胞周期gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.p27Kip1通过与G1周期蛋白- cdk复合物结合,负调控细胞周期从G1期向S期的过渡gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,导致抑制增殖。在许多人类癌症中经常观察到p27kip1浓度水平的损失或降低gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,包括肺癌和降低的p27kip1水平,是与非物质细胞肺癌(NSCLC)的整体存活时间相关的独立预后因子gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.虽然强迫表达p27Kip1可诱导肺腺癌细胞周期阻滞gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,它不是公知的p27Kip1实际上如何调节细胞周期在非小细胞肺癌的生理条件下。gydF4y2Ba
此外,有报道称p27Kip1对细胞凋亡有作用。起初,有报道称过表达p27Kip1可诱导多种细胞系的凋亡gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在肺癌细胞中也是如此gydF4y2Ba4gydF4y2Ba.然而,研究也表明p27Kip1对生长因子剥夺诱导的细胞凋亡具有保护作用gydF4y2Ba7gydF4y2Ba中,在微环境不利的肺小细胞癌gydF4y2Ba8gydF4y2Ba以及对抗化疗药物gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba.因此,p27Kip1是否诱导或减少细胞凋亡,目前仍存在争议。gydF4y2Ba
p27Kip1蛋白的活性通过它的浓度和亚细胞定位调节gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.p27Kip1的浓度被认为主要由泛素-蛋白酶体途径控制,而这种泛素化是由cyclinE-CDK2复合物在苏氨酸187上的磷酸化促进的gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba.丝氨酸10、苏氨酸157和苏氨酸198也被认为是磷酸化的靶点,它们的磷酸化被认为调节了p27Kip1的胞内定位和蛋白稳定性gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba.然而,在NSCLC细胞中调控p27Kip1细胞内定位的机制尚未得到广泛研究。gydF4y2Ba
这项研究的目的是探讨p27Kip1蛋白的表达水平如何影响细胞周期和凋亡的状态,和p27kip1的磷酸化是如何影响人肺腺癌细胞中的亚细胞定位。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
Human lung adenocarcinoma-derived A549 cells, PC‐14 cells and RERF-LC-KJ cells, and human embryo lung fibroblast-derived HFL‐1 cells were obtained from Riken Cell Bank (Tsukuba-city, Japan) and maintained in Dulbecco's modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco, Life Technologies, Inc., New York, NY, USA) containing 10% foetal bovine serum (FBS; Interon Inc., New York, NY, USA), 100 U·mL−1gydF4y2Ba青霉素100µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba链霉素。gydF4y2Ba
重组运载体gydF4y2Ba
使用Adeno-X表达系统(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA)构建含有p27 cDNA的重组腺病毒(Ad-p27),如下图所示。p27的cDNA(由日本横滨市大学医学院病理科H. Kitamura提供)亚克隆到gydF4y2Ba不gydF4y2Ba我和gydF4y2BaAPAgydF4y2Ba腺病毒穿梭载体pShuttle的多个克隆位点的I位点。这个穿梭载体被I-消化了gydF4y2BaCeugydF4y2Ba我和π-gydF4y2Ba南加州爱迪生公司gydF4y2Ba我和腺x DNA相连。然后用酶切腺嘌呤- x质粒DNAgydF4y2BaPacgydF4y2Ba根据制造商的协议,使用FuGENE 6转染试剂(罗氏诊断公司,曼海姆,德国)将I和HEK293细胞转染。HEK293细胞维持在含10%胎牛血清、100 U·mL的DMEM中gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba青霉素100µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba链霉素,直到患细胞病变的发作。根据制造商的协议,通过P27的免疫印迹证实了所生成的腺病毒的功能,并使用Adeno-X Rapid Titre Kit(Clontech Laboratories)测定TITRE。gydF4y2Ba
细胞以1×10的密度播种gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞·好gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在6孔培养板中加入10%胎牛血清DMEM, 24 h后,用指定浓度的腺载体感染1 h。随后,用含10%胎牛血清的DMEM进行进一步的实验。表达β-半乳糖苷酶(Ad-lacZ)的腺载体作为对照病毒载体。gydF4y2Ba
siRNA的构建及转染gydF4y2Ba
将细胞接种在6孔培养板中,24小时后,根据制造商的方案,使用oligofectamine (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)进行双链(ds) rna转染。转染48小时后进行进一步实验。dsrna对应于p27kip1编码区的470-488核苷酸(CCGACGATTCTTCTACTCA),购自JBioS(日本埼玉)。对照(非沉默)短干扰(si)RNA (Qiagen-Xeragon。(Germantown, MD, USA)作为非相关对照dsRNA。gydF4y2Ba
质粒构建、定点突变、转染gydF4y2Ba
将cDNA插入之间gydF4y2Ba生态gydF4y2Ba国际扶轮和gydF4y2Ba囊gydF4y2BaII质粒载体PIRES2-EGFP(CLONTECH实验室)的基因位点,其携带在内部核糖体进入部位(IRES) - 依赖性的中表达的增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因。根据制造商的协议,通过使用QuickChange部位定向的诱变试剂盒(Stratagen,La Jolla,CA)取代丝氨酸10,苏氨酸157,苏氨酸198,通过用丙氨酸或谷氨酸代替氨基10,苏氨酸157,苏氨酸198来产生P27KIP1突变体。Takara Bio Inc.(otsu-city,日本)证实了p27kip1 cDNA的突变序列。gydF4y2Ba
细胞以3×10的密度播种gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞·好gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在6孔培养板中加入10%胎牛血清的DMEM中,24小时后,根据制造商的协议,使用GeneJammer转染试剂(Stratagene)进行DNA转染。转染48小时后,对细胞进行免疫印迹分析。gydF4y2Ba
流式细胞术gydF4y2Ba
细胞凋亡和坏死的分析如前所述gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba,略微修改。磷脂酰丝氨酸(PS)的表面暴露,被认为是凋亡的早期信号,使用Annexin V的高亲和力结合性能进行PS。使用碘化丙锭(PI)摄取评估表明坏死的膜破坏。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次,并用5μL膜蛋白V-Fluo和5μLPI溶液(Roche Diagnostics GmbH)孵育1×结合缓冲液(10mM Hepes,pH 7.4,140mM NaCl,2.5 mM CaCl2gydF4y2Ba),最后集中在1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·100µLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba溶液15分钟。随后,用流式细胞仪检测荧光标记膜联蛋白V(发射波长518 nm)和PI(发射波长617 nm)的荧光,分别用荧光通道(FL) 1和FL2分析。结合膜联蛋白V和PI对细胞进行双重标记,可以检测和分化膜联蛋白阴性(-)和PI阴性(-)活细胞,膜联蛋白阳性(+)和PI阴性(-)凋亡细胞,以及PI阳性(+)坏死细胞。细胞凋亡和坏死的百分比具体计算如下:gydF4y2Ba细胞周期分析:胰蛋白酶收集细胞,PBS洗涤2次,70%乙醇固定,4℃保存24 h。这些细胞用RNase A (Roche Diagnostics GmbH)处理,用PI (Molecular Probes, Inc.)染色。最终浓度为25µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba.采用FL2流式细胞仪FACScan检测细胞核PI荧光。gydF4y2Ba
所有FACS数据使用CellQuest软件(Becton Dickinson, CA, USA)和ModFit LT软件(Becton Dickinson)进行分析。gydF4y2Ba
免疫印迹gydF4y2Ba
PBS温和洗涤后,根据制造商的方案,用RIPA缓冲液(50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Nonidet P‐40,0.5%脱氧胆酸钠,0.1% SDS)和Complete Mini蛋白酶抑制剂鸡尾酒原液(Roche Diagnostics GmbH)裂解细胞层。裂解液离心(20000 ×)gydF4y2BaggydF4y2Ba, 30分钟,4°C),上清液保存于−80°C。这些裂解物(100µg)与2×sample缓冲液(0.1 M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 6% β-巯醇,20%甘油,0.004%溴酚蓝)混合,在100℃煮沸10分钟,立即进行SDS- page与ECL蛋白分子量标记(Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ, USA)。使用预制的10%凝胶,并在恒定的200 V下进行电泳。SDS-PAGE后,将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,并与适当的抗人p27 (C-19;Santa Cruz Biotechnology, California, CA, USA), lamin B (Ab‐1;Oncogene, San Diego, CA, USA)和小鼠抗α微管蛋白(Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA)。采用ECL Western印迹分析系统(Amersham Biosciences Corp.)进行免疫印迹检测,使用FAS-1000 Lumino成像分析仪(Toyobo Biochemicals, Tokyo, Japan)进行免疫印迹检测。用于SDS-PAGE和免疫印迹的凝胶、膜和仪器购自ATTO公司(东京,日本)。以重组蛋白p27Kip1 (Santa Cruz Biotechnology)作为阳性对照。gydF4y2Ba
亚细胞分离gydF4y2Ba
根据制造商的协议,使用亚细胞分级,每核和细胞质提取试剂(Pierce,Rockford,IL,USA)。通过免疫印刷蛋白质的定位分别通过免疫印刷(作为核部分)和抗微管蛋白(作为细胞质部分)抗体来证实蛋白质。gydF4y2Ba
统计方法gydF4y2Ba
数据显示为平均值±SD。在适当时使用未配对的T检验或ANOVA进行比较。P值<0.05被认为是表示统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
p27Kip1适度负调控细胞周期进程gydF4y2Ba
首先,检测A549细胞以确定其p27Kip1表达是否是NSCLC细胞系的合适代表。免疫印迹法检测A549、PC‐14和RERF-LC-KJ三种NSCLC细胞系中p27Kip1的表达水平。如图1a所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,与其他NSCLC细胞系相比,所有这些细胞系均在增殖状态下表达p27Kip1,而A549细胞表达了中等水平的p27Kip1。因此,以下实验主要使用A549细胞。gydF4y2Ba
A549细胞中p27Kip1表达水平通过腺载体上调,通过siRNA下调。如图免疫印迹图1b所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)、p27Kip1在Ad-p27和Ad-T187A感染的细胞中过表达,且与Ad-lacZ感染的细胞相比,p27Kip1在Ad-T187A转导的细胞中表达量高于Ad-p27转导的细胞。相反,在模拟细胞中检测到p27Kip1的siRNA下调内源性p27Kip1。免疫印迹也证实了这一点(图1c)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
检查p27Kip1基因对细胞周期的影响。用Ad-p27蛋白或Ad-T187A的p27Kip1的强制表达抑制细胞周期进程,并增加了细胞的G0 / G1比例。广告-T187A有比广告-P27更强的效果,这是与以前的研究结果一致gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba.然而,转染p27Kip1的siRNA下调p27Kip1,在转染后的第2天和第5天没有影响细胞周期状态。这一发现出乎意料(图2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
p27kip1从细胞凋亡中垄断了细胞gydF4y2Ba
用腺病毒载体使A549细胞过表达p27Kip1,观察其诱导凋亡的能力。免疫印迹法证实,在感染Ad-p27和Ad-T187A后的第2天和第5天,p27Kip1的野生型和突变型蛋白过表达(图1b)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).Ad-Lacz以时间和剂量依赖的方式诱导A549细胞中的细胞凋亡和坏死(图3A和B.gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),推测是由于腺病毒载体的细胞毒性作用gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba.在第2天和第5天,Ad-p27均显著降低细胞凋亡和坏死的比例。虽然Ad-T187A降低了细胞的死亡,但其作用似乎不如Ad-p27,这可能提示极高长表达的p27Kip1可诱导细胞凋亡,与之前的报道一致gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
此外,我们还研究了p27Kip1的去除对细胞活力的影响。免疫印迹法证实,转染siRNA-p27Kip1后第2天和第5天,p27Kip1的表达均减少(图1c)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).siRNA-P27KIP1增加了A549细胞中凋亡或坏死细胞的比例(图4AgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),人肺成纤维细胞hfl-1(图4BgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba) and two other cell lines of human lung adenocarcinoma (PC‐14 (fig. 4c⇓gydF4y2Ba)和RERF-LC-KJ)。因此,我们认为p27Kip1在生理表达中有助于细胞活力的提高。gydF4y2Ba
由于在A549细胞中p27Kip1的减少并不影响细胞周期状态,而是诱导细胞死亡,因此推测p27Kip1作为CDKI在细胞核中很少存在,而主要存在于细胞质中,以防止细胞死亡。为了验证这种可能性,我们研究了增殖状态下p27Kip1的细胞内定位(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).p27Kip1存在于细胞质中多于细胞核。这些现象也在另一个肺源性细胞系HFL‐1中进行了研究。尽管p27Kip1不在细胞核中,但它仍然存在于HFL‐1细胞的细胞质中(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).因此,可以想象细胞质p27Kip1可能在减少细胞死亡方面发挥作用。gydF4y2Ba
p27Kip1蛋白的磷酸化状态会影响亚细胞定位gydF4y2Ba
通过上述观察,我们认为p27Kip1主要存在于增殖状态的细胞质中,在生理表达中有助于细胞活力,几乎不影响细胞周期状态。同时,p27Kip1作为一种CDKI的强制表达减少了细胞周期的进展,这种CDKI被认为在细胞核中起作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.因此,p27Kip1可能在细胞核和细胞质中分别具有独特的作用,研究p27Kip1对细胞内定位的调控具有重要意义。gydF4y2Ba
由于丝氨酸10、苏氨酸157和苏氨酸198被认为调控p27Kip1的细胞内定位和蛋白稳定性gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba,这些残基的磷酸化状态和p27kip1的细胞内定位之间的关联在A549细胞进行了研究。p27Kip1蛋白cDNA的诱变进行,并且,作为结果,丝氨酸10(S10),苏氨酸157(T157)和苏氨酸198(T198)所取代谷氨酸(E)(磷酸模拟物)或丙氨酸(A)(以耐磷酸化),分别。这些载体转染到A549细胞研究p27Kip1蛋白的亚细胞定位与免疫印迹。gydF4y2Ba
连续的免疫印迹如图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba(拟磷突变体(E)和抗磷酸化突变体(A))。与过表达的野生型蛋白相比,S10E、T157E和T198E蛋白均定位于细胞质中。相比之下,用丙氨酸代替这些氨基酸似乎并没有改变这种蛋白质的亚细胞定位。综上所述,p27Kip1较好地定位于细胞质中,其定位可受S10、T157和T198的磷酸化调控,这在A549细胞中也是可能的。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
p27Kip1是CDKIs之一,通过与G1周期蛋白- cdk复合物结合负调控细胞周期进程gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.在许多人类癌症中经常观察到p27kip1浓度的损失或降低gydF4y2Ba2gydF4y2Ba据报道,p27Kip1水平的降低是与非小细胞肺癌总生存时间相关的独立预后因素gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.虽然乳腺癌也报道了P27KIP1的细胞质位移及其与预后不良的关联gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,这细胞质定位也见于几个恶性组织gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,这种现象及其重要性尚未在肺癌中检查。因此,本研究的目的是探讨P27KIP1的一般特征,其作用与细胞内定位之间的关系,以及其在A549肺腺癌细胞中定位的调节。gydF4y2Ba
我们观察到p27Kip1的强制表达抑制了细胞周期进程,T187A突变体的作用强于p27野生型,这与之前的报道结果一致gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba.然而,出乎意料的是,使用siRNA方法下调p27Kip1并没有影响细胞周期状态。p27Kip1的生理表达(该表达被免疫印迹证实(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba))不能以这种量的细胞周期进展的负调控作出了贡献。gydF4y2Ba
接下来,研究了P27KIP1和细胞活力之间的关联。据报道,P27KIP1的过表达诱导各种细胞系中的细胞凋亡gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在肺癌细胞中也是如此gydF4y2Ba4gydF4y2Ba.但这种诱导凋亡的作用尚未得到证实,相反,p27Kip1通过减少病毒细胞毒性导致的细胞凋亡或坏死以及细胞自发死亡而具有保护作用。最近有报道称p27Kip1对生长因子剥夺诱导的细胞凋亡具有保护作用gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,在剥夺异亮氨酸gydF4y2Ba8gydF4y2Ba以及对抗化疗药物gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba.因此,p27Kip1在一些不利条件下对细胞死亡具有保护作用。在本研究中,p27Kip1可能由于观察时间较短(5天)而不能诱导细胞凋亡,这可能不足以使视网膜母细胞瘤基因产物(Rb)去磷酸化,而Rb在细胞凋亡过程中是必需的gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
这项研究的作者推测,p27Kip1的,生理上表达时,几乎不影响细胞周期状态,但有利于细胞活力,他们也认为,这可能是由于在此生理状态的细胞内定位。事实上,已经观察到的p27Kip1存在更多在细胞质中比在A549细胞中细胞核,并且p27Kip1的是不存在于细胞核中,尽管它仍然存在于HFL-1细胞的细胞质中。因此,细胞质p27Kip1的可能在减少细胞死亡的作用。Eymin和同事gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba之前的研究表明,p27Kip1通过阻止细胞色素上游的凋亡来诱导耐药gydF4y2BacgydF4y2Ba释放在细胞质中。因为已经报道的p27Kip1的细胞质位移与乳腺癌预后差gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba人们已经认识到,p27Kip1在各种情况下都定位于细胞质中gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,细胞质p27不被认为等同于CDKI功能的丧失,而是在恶性细胞中具有抗凋亡的另一作用gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba.这与另一种CDK Cip/Kip蛋白p21Cip1类似,它也迁移到细胞质中gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba对细胞凋亡有抵抗作用gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
此外,为了通过亚定位调控p27Kip1的特征,我们研究了p27Kip1的S10、T157和T198磷酸化状态与细胞内定位的关系。与野生型蛋白相比,在S10、T157和T198位点的p27Kip1拟磷突变体的最终产物更多地定位于细胞质。公园gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba研究表明,Ad-T187A由于其抗降解,在细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡方面有更大的作用,因此有潜力成为一种新的、强大的基因治疗工具gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,并显示Ad-p27抑制已建立的肺癌异种移植瘤的生长。与细胞内定位相关的氨基酸的突变也可以通过p27Kip1的亚定位改变其功能,这可能导致更有前景的治疗。gydF4y2Ba
综上所述,在A549肺腺癌细胞中,p27Kip1在生理上的表达主要存在于细胞质中,对细胞周期状态影响不大,对细胞活力有贡献。我们还观察到p27Kip1的强制表达减少了细胞周期的进展并挽救了腺载体诱导的细胞凋亡。此外,推测p27Kip1的细胞内定位固定了其功能,其定位部分取决于其在该非小细胞癌细胞系中的磷酸化状态。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2003年8月22日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2004年1月20日。gydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司gydF4y2Ba