文摘gydF4y2Ba
本研究的目的是评估hyperosmolarity是否影响粒细胞中介水平诱导痰的哮喘。gydF4y2Ba
总共32轻度到中度哮喘患者,吸入高渗(商品;4.5%氯化钠)或等渗(;15分钟,0.9%氯化钠)解决方案进行了研究。选定的痰是用于分析。嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)、嗜酸性粒细胞蛋白质X (EPX)、髓过氧化物酶(MPO)和免费的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)以痰上层清液。gydF4y2Ba
样品重量,总和微分单元数量,以及可行性和鳞状细胞百分比没有不同的后两个测试。在ECP没有显著差异,EPX、MPO、NE水平观察HS -和诱导痰。两个测试的重复性有利于巨噬细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,ECP, EPX和东北,但不是因为淋巴细胞和MPO。gydF4y2Ba
总之,hyperosmolarity并不影响痰细胞计数和大多数粒细胞脱颗粒的水平标记检查在这项研究中,确认可以可靠地使用高渗和等张解决方案在哮喘患者诱导痰。gydF4y2Ba
高渗盐水(HS)吸入目前用于收集痰从哮喘受试者的航空公司不产生痰自发。然而,在高风险科目,吸入用等渗盐水(是)建议,至少在痰诱导的开始gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。因此,重要的是,痰液样本收集后要么归纳法也有类似的成分。几项研究已经比较痰后获得的细胞组成两个不同的诱导方法,表现出良好的一致性的炎性细胞百分比gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;然而,很少有研究比较了痰上层清液浓度的可溶性介质gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
大量的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究表明,高渗方案修改中介从炎症细胞释放通过扮演一个强大的刺激细胞活化gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,或者,相反,通过抑制白细胞脱粒gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。痰诱导的高渗溶液可能增加气道粘膜液的渗透性,从而影响中介从粒细胞释放吸入或痰处理期间,或两者兼而有之。gydF4y2Ba
因此,本研究的目的是比较的可溶性介质水平来自嗜酸性粒细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)、嗜酸性粒细胞蛋白质X (EPX)、髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE),诱导痰里获得通过海关或者是轻度到中度哮喘吸入科目。此外,总和微分单元数量也评估在相同的痰样本。gydF4y2Ba
对象和方法gydF4y2Ba
主题gydF4y2Ba
共有44轻度到中度哮喘受试者,他们招募了来自作者的哮喘临床检查。被诊断为哮喘的时候第一个考试,根据国际公认的标准gydF4y2Ba10gydF4y2Ba评估后,可逆的气道阻塞和/或非特异性支气管高反应性methacoline。作为额外的评价,除了10学科也进行了皮测试11常见空气中的过敏原(包括屋尘螨、花粉、霉菌、动物皮屑)。所有受试者疾病的检查在一个稳定的时期,至少4周后哮喘恶化或改变在常规药物治疗。gydF4y2Ba
12个受试者无法收集足够的痰样本在其中一个场合,因此,被排除在研究之外。32名患者完成了临床特点的研究如表1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。11个学科曾经抽过烟,19人是不吸烟者和两个吸烟者。久的吸烟者andex-smokers是6.3±2.7。一秒钟用力呼气容积(FEV筛查gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在mostsubjects预测)> 80%。除了五个科目一直定期接受抗炎药和长效吸入βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂。gydF4y2Ba
研究设计gydF4y2Ba
在筛查检查,所有受试者随机接受痰诱导通过海关或吸入的,在两个不同的的日子里,由1周,小时的一天。药物治疗被撤回之前24小时每一感应,除了救援舒喘灵,每个感应撤回前6小时。痰量、细胞生存能力、道达尔和微分细胞计数,以及ECP EPX、MPO和NE浓度在上层清液以获得商品或吸入后痰液样本。gydF4y2Ba
协议是比萨大学伦理委员会批准(比萨、意大利),从每个病人知情同意了。gydF4y2Ba
痰诱导gydF4y2Ba
痰是诱导据欧洲呼吸协会工作组的建议188bet官网地址gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,除了没有βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂和预处理管理。HS(氯化钠4.5% w / v)或(氯化钠0.9% w / v)是通过超声波nebulised nebuliser(天狼星;Technomed,佛罗伦萨,意大利),2.8毫升·分钟gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba输出和吸入三5分钟时间长达15分钟。每5分钟,nebulisation开始后,受试者被要求仔细冲洗自己的嘴和喉咙,抛弃唾液,并试图咳嗽痰成一个容器;FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba然后测量。Nebulisation 15分钟或者当FEV后停止gydF4y2Ba1gydF4y2Ba从基线值下降≥20%。Saline-induced支气管收缩被短效β立即松了一口气gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂吸入。gydF4y2Ba
痰液处理gydF4y2Ba
痰液样本处理后1小时内收集和密集的部分都选择通过倒置显微镜。然后,将样品加工之前报道gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。适当的均化后,稀释和离心分离,细胞颗粒在PBS resuspended总细胞数和细胞生存能力评估,通过台盼蓝排斥血球计。上层清液被储存在−80°C进行进一步分析。样品与细胞生存能力< 50%被丢弃。µL整除(70 - 150)的细胞悬液的浓度为0.4 - -0.8×10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba·µLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba然后cytocentrifuged (Cytospin;美国宾夕法尼亚州Shandon科学、Sewickley) 25×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟和cytospin幻灯片沾Diff-Quik(美国百特科技产品、迈阿密、FL)对至少300 nonsquamous微分细胞计数细胞。两个调查员,蒙蔽inter-observer好的主题的代码和可重复性gydF4y2Ba12gydF4y2Ba每个痰幻灯片上,数至少500个细胞,以获得炎性细胞计数和鳞状细胞百分比作为唾液污染的指标。Cytospin幻灯片的鳞状细胞数量,这样300炎症细胞不能becounted被认为是令人不满意的和丢弃。巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞被表示为一个百分比的总炎症细胞,排除鳞状细胞。在当前作者的实验室再现性痰细胞计数,由相同的实验室工作人员参与本研究(Cianchetti和马丁莎娃),已被证明是好,组内相关系数作为评价的巨噬细胞(RI 0.80),中性粒细胞(RI 0.85)和嗜酸性粒细胞(RI 0.87),除淋巴细胞(RI 0.15)gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
生化分析痰上层清液gydF4y2Ba
痰ECP水平gydF4y2Ba
痰ECP水平测量通过UniCAP fluoroenzymeimmunoassay(法玛西亚普强AB,乌普萨拉,瑞典)。intra-assay变异系数为4.5%,inter-assay变异系数为8.2%。测定的检出限为0.5µg·LgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
痰EPX和MPO浓度gydF4y2Ba
痰EPX和MPO含量测定用双抗体放射免疫检定法(法玛西亚普强AB,乌普萨拉,瑞典)。的EPX intra-assay变异系数为5.3%,inter-assay变异系数为10.1%。EPX测定的检出限是3µg·LgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。在MPO intra-assay变异系数为7.6%,inter-assay变异系数为14.5%。MPO的检出限测定是8µg·LgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
痰NE浓度gydF4y2Ba
痰NE浓度测量NE酶活性测定的样品。不活动评估的显色底物特定人类NE (methoxy-succinyl-ala-ala-pro-val-paranitroanilide (MEOSAAPVNA);西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国),根据Fahy稍微修改的技术报告gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。上层清液从PBS-diluted痰样本或纯化NE(σ)孵化(24 h, 25°C) 0.1 4 - 1 - (2-hydroxyethyl)gydF4y2BaNgydF4y2Ba′-piperazine-HEPES, 0.5 M氯化钠,0.1%玻雷吉和2% DMSO, pH值7.5,在特定的底物的存在MEOSAAPVNA(1.5毫米)。活动是通过确定测量吸光度的变化在410 nm标仪(美国弗吉尼亚州麦克林流实验室)和被外推量化标准曲线与增加浓度(0.62 -80亩·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)的纯化NE(具体活动99 U·毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。吸光度的变化被发现线性在48小时的潜伏期在25°C。方法的检出限为6 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。为每个分析单一样本化验一式两份,并在两个不同的场合,为了获得内部和inter-assay系数的变异。平均intra-assay和inter-assay变异系数分别为5.6%和12%,分别。不活动的特异性痰液样本,以及在标准样品,评估通过测量活动30分钟后样本预孵化methoxy-succinyl-ala-ala-pro-val-chloromethyl酮(CMK;σ)或乙二胺四乙酸(EDTA)gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。预培养期结束时,添加特定的底物是和不活动测量如前所述。这个活动几乎完全抑制(> 95%)通过预培养特定抑制剂CMK但不与EDTA。事实上,痰不活动与测量同一样品使用EDTA(ρ= 0.9,p = 0.0001)。gydF4y2Ba
标准曲线的介质gydF4y2Ba
标准项目、EPX MPO和不被稀释在海关或解决方案,并在分析缓冲区(控制标准);标准曲线的浓度增加的中介和执行每个标准在海关或计算比例的控制标准。gydF4y2Ba
强化恢复介质的痰样本gydF4y2Ba
为了评估ECP的飙升复苏,EPX, MPO和HS - NE引起痰液,添加了一个已知量的纯化中介不同整除的痰样本(ECP n = 12;MPO n = 13 EPX n = 14日,东北n = 21)。预期的浓度上升的中介,假设100%恢复,中叶的标准曲线。计算每个中介的飙升复苏预期值的百分比,这是飙升纯化中介和中介浓度之和在最初的痰样本。gydF4y2Ba
同渗重摩gydF4y2Ba
同渗重摩是评估gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba冰点萧条方法使用一个ARKRAY Osmostat OM6030-cryogenic渗压计(Menarini,佛罗伦萨,意大利)的冰点降低样本转化为渗透浓度。gydF4y2Ba
痰上层清液中钠含量gydF4y2Ba
钠浓度使用电位法测定痰上层清液在体外950/950分析器(邻位的临床诊断,新泽西,新泽西,美国)。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
痰量、细胞生存能力,总细胞数、细胞百分比和生化介质都表示为中值(范围)。筛选FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,FEV的下降gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(ΔFEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba%)后吸入生理盐水和吸入生理盐水的持续时间都表示为±gydF4y2BasdgydF4y2Ba。Wilcoxon签署等级测试是用来比较痰细胞百分比和生化中介HS和诱导痰。用于比较ΔFEV配对t检验gydF4y2Ba1gydF4y2Ba%和持续时间的商品或痰诱导后吸入生理盐水。和合痰细胞百分比和可溶性中介水平之间的两个测试是由组内相关系数评价;RI值≥0.70被认为是令人满意的gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。中介的水平差异的两个测试显示图形,通过绘制每一对观测值之间的差异对均值相同的观测gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。斯皮尔曼等级相关的计算评估之间的关系绝对数字或百分比的炎症细胞和生化介质。意义是接受95%的水平。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
痰诱导gydF4y2Ba
FEV没有显著区别gydF4y2Ba1gydF4y2Ba测量前HS和吸入(FEV之前gydF4y2Ba1gydF4y2Ba%;分别为90.6±13.4,88.3±16.9)。FEV的下降gydF4y2Ba1gydF4y2Ba后痰诱导大,测试的持续时间较短的商品比后吸入(ΔFEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba%;−9.7±9.9%(−32-5)在海关和−2±6.6%(−21-7)后,p = 0.003;持续时间12.6±3.7分钟后HS和15±0分钟后;p = 0.028)。gydF4y2Ba
痰液重量,道达尔和微分细胞计数gydF4y2Ba
痰液样本获得不足四个科目是吸入后,在两个主题商品都吸入后吸入和六个科目。因此,32名受试者评估在这个研究。gydF4y2Ba
之间无显著差异观察样本权重,总细胞数、细胞生存能力,鳞状细胞百分比或炎症细胞测量两个测试后所有的比较(p > 0.17)(表1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
两种方法之间的组内相关系数高的巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(> 0.7)(图。1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。嗜酸性粒细胞的再现性是最好的,因为证实了重复性系数的置信区间。细胞计数表示为绝对数字时,组内相关系数较低炎症细胞(RI < 0.3)。gydF4y2Ba
痰液可溶性介质gydF4y2Ba
对于某些介质,测量的数量低于32岁,因为上层清液量不足。在项目没有明显差异,EPX和NE水平引起的痰样本商品或吸入(p > 0.05)(表2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。RI值高了ECP, EPX和NE水平(图。2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),从而展示良好的再现性痰诱导的两种方法。相比之下,国际扶轮MPO很穷(图。2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),尽管缺乏区别MPO水平以痰后归纳的方法。证实了良好重现性较低的重复性系数的置信区间获得这些介质,MPO除外。gydF4y2Ba
只有受试者没有区别商品的持续时间和地吸入和所有介质(n = 16)被认为是衡量,国际扶轮类似获得在所有科目(ECP 0.79 EPX 0.83, MPO 0.53, 0.74)。当细胞百分比在同一组受试者认为,RI值仍高,巨噬细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞(RI 0.72、0.71和0.84,分别)和可怜的淋巴细胞(RI 0.12)。再一次,细胞计数表示为绝对数字时,组内相关系数较低炎症细胞(RI < 0.25)。gydF4y2Ba
ECP和EPX值显著相关与嗜酸性粒细胞的绝对数量在两次测试(HS: ECPρ= 0.65,p < 0.01, EPXρ= 0.55,p < 0.05, n = 24;ECPρ= 0.50,p < 0.05, EPXρ= 0.50,p < 0.05, n = 24)。此外,ECP水平被发现后与EPX高度相关的海关和吸入(ρ= 0.8,p < 0.001, n = 22)。NE水平有显著相关性和中性粒细胞绝对值HS(ρ= 0.51,p < 0.01, n = 23)和吸入(ρ= 0.47,p < 0.05, n = 23);相比之下,MPO水平测量后(ρ= 0.43,p < 0.05, n = 23)但不是海关后吸入(ρ= 0.28,p > 0.05, n = 23)与中性粒细胞绝对数显著相关。MPO后与NE水平显著相关(ρ= 0.43,p < 0.05, n = 23)但不是海关后吸入(ρ= 0.20,p > 0.05, n = 22)。这些相关性被证实当细胞百分比只被认为是当受试者与所有介质测量(n = 19)包括用于分析。gydF4y2Ba
同渗重摩痰上层清液样本明显高于商品比样品(283.5 (250 - 324)gydF4y2Ba与gydF4y2Ba(150 - 309)271 mOsm·公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,p = 0.01),以及钠浓度(153 (135 - 176)gydF4y2Ba与gydF4y2Ba(107 - 164)146毫克当量·LgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,p = 0.01)。gydF4y2Ba
ECP的标准曲线,EPX MPO和测定不受NE在海关或稀释的标准解决方案;复苏不同浓度的标准在海关或解决方案是> 94%为介质进行了研究。复苏HS诱导痰ECP(90 - 104)为96%,EPX(96 - 113)为102%,95% (89 - 100)MPO和NE(100 - 108)为101%,引起的痰是98% (93 - 110)ECP, EPX(91 - 101)为99%,97% (95 - 105)MPO和99%为NE (90 - 100)。gydF4y2Ba
飙升的实验显示良好的复苏为所有介质HS -和诱导痰(表3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。尽管MPO复苏后痰HS吸入低于后,这种差异不显著。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
这项研究表明,可溶性介质由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞(ECP, EPX和NE)可衡量的上层清液中痰收集从哮喘的近端航空主题,和他们的浓度不受盐溶液的类型(HS)用于诱导痰。因此,HS和吸入可以可靠地用于收集痰液上层清液并测量可溶性粒细胞激活的标志。gydF4y2Ba
胞质嗜酸性和中性颗粒含有毒性蛋白,包括ECP, EPX, NE、MPO、释放到细胞外的细胞激活和脱粒后的空间;这些标记以诱导痰的哮喘gydF4y2Ba18gydF4y2Ba其中一些与哮喘的严重程度gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。溶性之间的正相关性的标记细胞的激活和中性粒细胞和嗜酸性粒细胞计数痰中观察到的一些研究gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。细胞计数和可溶性标记之间的关系可能会受到多种因素的影响,包括非特异性细胞渗透性的增加引起的脱粒痰在HS吸入浮层。一些作者报道,海关也可以直接影响一些白细胞功能和中介通过假设的嗅觉感受器,触发特定的信号在中性粒细胞gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。因此,重要的是要知道hyperosmolarity诱导痰可以人为调节浓度的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞激活的可溶性的标记。gydF4y2Ba
这项研究表明,ECP EPX和NE浓度在痰是相似的上层清液得到HS和吸入后,由于一致性指数> 0.7和重复性的置信区间为可溶性介质系数很低。此外,ECP和EPX相互关联以及与嗜酸性粒细胞、NE和中性粒细胞在HS -和诱导痰。gydF4y2Ba
只有MPO显示一致性差,可能是因为不同的因素。与其他介质相比,MPO浓度大大影响该方法用于检测或痰液样本处理gydF4y2Ba24gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26gydF4y2Ba已报告,痰MPO含量是非常变量在不同的研究中,有一个很大的标准差gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。在样品在这项研究中,一个可接受的interassay MPO的变异系数和一个相当不错的恢复被发现,,然而,被海关比低痰诱导痰引起吸入。gydF4y2Ba
在这项研究中,影响NE和释放MPO hyperosmolarity似乎不同;MPO确实低,即使不显著,引起的痰样本吸入,引起的商品比在NE水平不同的两个测试和显示高组内相关系数;此外,东北与中性粒细胞诱导痰HS和吸入后,虽然MPO与中性粒细胞和NE后但不是HS吸入。虽然不能和MPO中包含的主要颗粒中性粒细胞,中性粒细胞酶显示与亚种群的主要不同密度颗粒分离的分泌的控制之下gydF4y2Ba28gydF4y2Ba;此外,不同的刺激或离子浓度可能修改颗粒动员gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
在这项研究中,没有与β预处理gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂吸入生理盐水之前,为了说明一个可能的病理生理机制的高渗吸入气道炎症细胞。考虑到βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba炎症细胞的受体激动剂可能影响脱粒,证明了gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,认为这种效应可能掩盖了HS和可能的区别是中介发布的解决方案。自gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究已经证明,海关解决方案可以激活炎症细胞gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,没有演示gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究MPO、EPX和NE水平相似的HS -和诱导痰上层清液gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂预处理是避免在当下比较商品,诱导痰。然而,这一事实并不相关的在实践中,因为指南建议βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba预处理前HS和吸入gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
缺乏βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂预处理可能以不同的方式影响吸入生理盐水的持续时间,从而影响可溶性介质的水平gydF4y2Ba33gydF4y2Ba。然而,当对象与相同时间的HS和吸入被认为,两种方法之间的协议被确认为细胞和介质。gydF4y2Ba
药物治疗被撤回每个挑战前24小时,以避免长效β的直接影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂和白三烯拮抗剂中介从痰释放炎性细胞。吸入型皮质类固醇激素的影响的持续时间是很难评估,只有长期撤军(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba1个月)可能保证不干扰中介发布。这漫长的撤军期限可能是不道德的,不容易在这些中度哮喘受试者可行。gydF4y2Ba
这项研究是第一个评价高渗影响粒细胞诱导痰的可溶性介质在选定的插头。虽然它已被广泛证明总紧张性和微分单元数量不受影响的生理盐水的解决方案gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba中,只有一项研究报告了dataconcerning白蛋白的浓度,ECP和pro-matrix metalloproteinase-9活动以获得商品或吸入后痰液样本gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。这项工作提供了额外的信息前面的观察和结果扩展到更多的哮喘。考虑到国际指导方针gydF4y2Ba1gydF4y2Ba建议使用第一个感应严重患者或在恶化,最终通过HS吸入,目前的研究表明,使用两种不同的盐解决方案不会引起不同的诱导痰细胞和介质组成。gydF4y2Ba
总之,分析痰诱导高渗或等渗盐水吸入表明hyperosmolarity没有影响痰细胞计数和粒细胞脱颗粒。因此,这项研究证实了高渗和等渗盐水可以可靠地用于诱导痰在哮喘受试者,至少在评价炎症细胞和粒细胞的可溶性介质。只有髓过氧物酶表现出一致性差,可能是因为一个变量干扰一些痰组件在高离子浓度。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2003年12月17日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba8月2日,2004年。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba
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