摘要
成纤维细胞收缩三维胶原蛋白凝胶的能力已被用作一种在体外组织收缩模型的特征是正常修复和纤维化。在其作用中,凝血酶可以激活蛋白酶激活受体(PAR)1,从而刺激炎症和修复。目前的研究评估了凝血酶是否可以通过激活PAR1来刺激成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩,以及其下游信号是否依赖于蛋白激酶C (PKC)的柱一。
人胎肺成纤维细胞(HFL-1)在三维胶原凝胶中培养,并用图像分析仪测量凝胶面积。
凝血酶和选择性PAR1激动剂TFLLR均可刺激HFL-1介导的胶原凝胶收缩。RNA干扰介导的PAR1基因敲低HFL-1后,凝血酶和PAR1激动剂诱导的凝胶收缩均受到部分抑制(分别为22.4±2.2%和17.6±5.6%)。凝血酶刺激的凝胶收缩也被一种非特异性PKC抑制剂和一种不依赖钙的PKC-柱一抑制剂降低。凝血酶和TFLLR均显著提高了PKC- ε的活性,而这种作用被PAR1敲低所阻断。
凝血酶通过激活蛋白酶激活受体1和蛋白激酶C-柱一,至少部分地刺激胶原凝胶收缩,可能有助于炎症性气道和肺部疾病的组织重塑。
这项工作由拉森基金会、内布拉斯加大学医学中心和国家卫生研究院拨款RO1-HL64088资助。
组织结构的改变是许多慢性肺病的特征性特征。在间质性肺病中,成纤维细胞与它们产生的胶原细胞外基质一起聚集。重要的是,这种纤维化改变与正常组织结构的破坏有关。典型的是,纤维化组织收缩,扭曲正常的解剖结构和改变功能1. 类似的组织重塑现在也被认为发生在气道疾病中,它可能是气道狭窄和固定气流限制的主要原因2那3..识别导致这些组织改变的机制是制定改变许多慢性肺疾病自然史策略的主要目标。
虽然导致组织重塑的机制还不完全清楚,但纤维母细胞被认为发挥了关键作用。在这方面,成纤维细胞收缩三维胶原蛋白凝胶的能力被用作一种在体外组织收缩的模型,其特征纤维化4.许多介质,包括血小板衍生生长因子、转化生长因子(TGF)、前列腺素D2溶血磷脂酸和缓激肽可刺激成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩,并被认为具有促纤维化作用5.-9..虽然直接刺激胶原凝胶收缩的信号转导途径还没有完全明确,但几种凝胶收缩的刺激因子似乎是通过蛋白激酶C (PKC)的柱一起作用的7..这种新型的、钙独立的PKC家族成员可以调节细胞骨架重组,调节细胞扩散和粘附10.相反,许多介质,包括白介素-1,肿瘤坏死因子-α,前列腺素E2和一氧化氮,可抑制成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩,可能具有抗纤维化功能11那12. 这些不同介质之间的平衡对于确定组织损伤后组织修复是否不足、过度或有效至关重要。
凝血酶是可能存在于气道炎症环境中的介质之一。凝血酶是由凝血酶原激活的丝氨酸蛋白酶,是凝血级联的一部分。除了切割纤维蛋白原和作为血液凝固的最终效应器,凝血酶对许多细胞类型还有其他作用。特别是,它可以刺激成纤维细胞和其他细胞的一些功能,与促修复功能一致13.此外,据报道,凝血酶在几种慢性炎性疾病中升高,包括肺部疾病,其特征是纤维化组织重塑,如硬皮病和哮喘14那15.
凝血酶能够通过多种机制激活细胞。通过其蛋白水解作用,凝血酶可以产生次级介质。凝血酶还能切割细胞表面的蛋白酶激活受体(PARs)。pars是g蛋白偶联受体,也是蛋白水解裂解的底物。在卵裂时,受体上的一个新位点暴露出来,可以导致受体的自动激活。到目前为止,已经确定了四种类型的PAR,凝血酶激活了至少三种PAR家族成员,包括PAR1、PAR3和PAR4。迄今为止积累的大量证据强调了PAR1作为多种细胞类型的激活物的重要性16那17.
因此,目前的研究旨在确定凝血酶是否可以通过激活PAR1受体来刺激成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩。此外,研究还评估了PKC-柱一作为凝血酶下游中介物通过PAR1作用于直接收缩的作用。
材料和方法
材料
如前所述,I型胶原从鼠尾肌腱(RTTC)中提取18那19.简而言之,从大鼠尾部切除肌腱,肌腱护套和其他结缔组织被仔细除去。用Tris缓冲盐水(0.9%NaCl,10mM Tris,pH7.5)反复洗涤,然后用50,75,95和100%乙醇脱水和灭菌。I型胶原蛋白在4℃下在6mM盐酸中萃取24小时。通过以2,000×g离心2小时,在4℃下离心收获上清液。通过从每批胶原溶液中称量冻干等分试样来测定蛋白质浓度。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)常规证明了除I型胶原之外的可检测的蛋白质。将RTTC储存在4°C直至使用。
人血浆凝血酶和EGTA购自Sigma(美国MO圣路易斯)。人PAR1激动剂,TFLLR和TFLLR- nh2, PAR1激动剂阴性对照,RLLFT-NH2,以及人PAR4激动剂GYPGQV,由Genemed Synthesis Inc. (South San Francisco, CA, USA)合成。Calphostin C、BAPTA/AM、Ro-31-8220、Gö6976和TMB-8取自Calbiochem (San Diego, CA, USA)。TGF-β1购自R&D Systems公司(Minneapolis, MN, USA)。组织培养补充剂、FBS和培养基购自GIBCO (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)。
细胞培养
人胎肺成纤维细胞(HFL-1)来自美国型培养收集(Rockville, MD, USA)。细胞培养在100mm2组织培养皿(Falcon; Becton-Dickinson Labware,Franklin Lakes,NJ,美国)在Dulbecco的改良Eagle的媒介(DMEM)补充有10%FCS,50 U·ML-1青霉素、µg·50毫升-1链霉素1µg·mL-1二性霉素b。成纤维细胞每3-5天传代一次。亚融合成纤维细胞胰酶化(胰酶- edta;0.05%胰蛋白酶,0.53 mM EDTA-4Na),用于胶原凝胶培养。在这些实验中使用的成纤维细胞是在细胞传代14到19之间。
胶原凝胶制备及收缩试验
胶原凝胶的制备方法如前所述19简言之,将适量的RTTC与蒸馏水、4×浓缩DMEM和细胞悬浮液混合,使最终混合物的浓度为0.75 mg·mL-1胶原蛋白,3.0×105.细胞·毫升-1和生理离子强度。在制备胶原凝胶的过程中,成纤维细胞通常被添加在最后,以减少损害。将混合物倒入24孔的组织培养板(FALCON;正欲实验室的器具)。室温下凝胶形成时间约为20分钟,凝胶释放后转移至60 mm2组织培养皿,包含5ml无血清DMEM,含或不含凝血酶或PAR激动剂,存在或不存在抑制剂。然后将漂浮的凝胶在37°C的5% CO中孵育2各种时期的气氛。使用图像分析仪(Optomax,Burlington,MA,USA)测量浮凝胶区域。在每个实验中以三份凝胶测量凝胶收缩,对每个独特参数进行不少于三个单独的实验。
PAR1靶向siRNA的制备与转染
根据Elbashir的方法设计了靶向人PAR1的短干扰RNA (Short interfering RNA, siRNA)et al。20..靶向PAR1的siRNA序列位于起始密码子的第一个核苷酸位置(GeneBank登录号)288-308BC002464)21个nt RNA由达尔马孔(美国科罗拉多州拉斐特)化学合成每个siRNA对的序列如下:5′-CAA-AUG-CCA-CCU-UAG-AUC-CdTdT-3′和5′-GGA-UCU-AAG-GUG-GCA-UU-GdTdT-3′。按照制造商的说明进行siRNA退火。简单地说,在退火缓冲液(100 mM KOAc,30岁 mM HEPES-KOH,pH 7.4, 2 毫米MgOAc)用于1 90°C条件下的最小值,然后是1 h,37°C。siRNA双链的最终浓度为20 µM在1×退火缓冲液中。此外,市售PAR1 siRNA SMARTpool和siRNA SMARTpool阴性对照品购自Dharmacon。转染反式如前所述进行IT-TKO (Mirus Corporation, Madison, WI, USA)20..转染24小时后,用Western blot检测基因敲低的效果。按照制造商的说明(Molecular Probe, Eugene, OR, USA),使用LIVE/DEAD试剂盒,用钙黄素AM和乙啶- homodimev-1(双色荧光法)评估细胞活力。
西方墨点法
用PBS洗涤细胞两次,用含有35 mM Tris-HCl、pH 7.4、0.4 mM EGTA、10 mM MgCl的溶解缓冲液裂解细胞2, 0.1% Triton X-100和蛋白酶抑制剂(3µg·mL-1抑肽蛋白,1μm苯基甲磺酰氟化物和10μg·mL-1亮抑酶肽)。然后轻轻刮拭细胞,将裂解液转移到微离心管中。超声后,4℃,10,000×g离心10 min。测定上清液的蛋白质含量,并在10%聚丙烯酰胺凝胶中用SDS-PAGE分析每个样品的10µg。通过电泳分离后,将蛋白转移到聚乙烯醇二氟化膜(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)。在PBS-Tween中,在室温下用5%脱脂牛奶阻断膜1小时,然后用抗par1、抗par2、抗par3和抗par4抗体进行检测(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)。随后使用辣根过氧化物酶结合的第二抗体结合增强化学发光检测系统(ECL;Amersham Biosciences UK Ltd, Little Chalfont, UK)。然后用剥离缓冲液(100 mM 2-巯基乙醇,2% SDS, 62.5 mM Tris-Cl, pH 6.7)在50°C下剥离30分钟,从膜上剥离抗par1及其第二抗体。采用抗Vimentin mAb (DAKO Corporation, Carpinteria, CA, USA)检测Vimentin表达。
PKC-ϵ活性测定
PKC-ϵ活性是在粗全细胞组分中测定的。所采用的测定方法是对先前所述程序的修改21,使用900 µM PKC-ϵ特异性底物肽(Calbiochem),8 µM磷脂酰-L.-丝氨酸,24 微克·毫升-1PMA,30毫米二硫醇,150μmatp,45 mm mg(c2H3.O.2)2和10µCi·毫升-1[γ-32P] ATP在Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)。将样品(20µL)加入上述反应混合物的40µL中,在30℃下孵育15 min。将每个样品取50µL滴在P-81磷酸纤维素纸上(Whatman),终止培养。论文were then washed five times for 5 min each in phosphoric acid (75 mM), washed once in ethanol, dried and counted in non-aqueous scintillant, as previously described22.以pmol·min计算细胞总蛋白与激酶活性的关系-1·米格-1.所有样品均为3个重复,每个实验至少重复3个不同的场合。
统计分析
单独的实验包括在一个实验或所有实验条件下的三个重复凝胶。结果总是通过在不同的场合重复至少三次实验来证实。所有实验均进行统计学比较,包括组内和组间方差。在所有实验中,与对照组和未处理的细胞相比,PKC-柱一的活化表现为fold change。组数据采用单因素方差分析。Tukey的测试纠正了一系列数据之间统计上的差异。A <0.05被认为是显著的。
结果
凝血酶对胶原凝胶收缩的影响
在对照条件下,HFL-1在5天的培养期间逐渐收缩胶原凝胶。在整个5天的潜伏期中,凝血酶增强了胶原凝胶的收缩(图1)⇓).第1天,分别用凝胶蛋白(2,10和50nm)处理的凝胶的尺寸分别为42.9±2.1,35.1±1.6和32.3±1.5%(P <0.01,与对照凝胶相比78.0±2.8相比%)。培养5天后,分别用凝血酶(2,10和50mm)处理的凝胶的尺寸分别为29.3±3.9,8.6±0.4,5.9±0.4%(P <0.01,与对照凝胶46.4±相比2.8%)。
蛋白水解活性对凝血酶诱导的胶原凝胶收缩的影响
为了检查凝血酶的蛋白水解活性是否需要凝血酶诱导的胶原凝胶收缩,使用了凝血酶抑制剂水蛭素。水蛭素本身对胶原凝胶收缩没有影响。相反,凝血酶对胶原凝胶收缩的刺激作用被水蛭素完全阻断(图2)⇓).
PAR1在凝血酶诱导胶原凝胶收缩中的作用
采用两种不同的方法来评估PAR1在介导凝血酶诱导的胶原凝胶收缩中的作用。首先,使用par1选择性激动剂模拟凝血酶的作用。其次,利用RNA干扰(RNAi)技术降低培养成纤维细胞PAR1的表达。
为了确定PAR1激活是否参与凝血酶诱导的胶原凝胶收缩,我们测量了选择性PAR1激动剂TFLLR的作用。TFLLR浓度为600µM时,在5天的培养期间,胶原凝胶收缩显著增强(图3a)⇓p<0.01)。在观察到的所有时间点,TFLLR增强了成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩。在第1天,在TFLLR存在的情况下,凝胶大小为初始凝胶大小的58.5±1.7%与对照组为81.6±1.2% (p<0.01)。5天后,这种差异维持(46.5±2.0)与62.3±2.7%,p < 0.01)。PAR4激动剂GYPGQV在600 μ M时对凝胶收缩没有影响。PAR1激动剂(TFLLR-NH)的酰胺修饰2),以提高药效而闻名,和它的混乱的阴性对照(RLLFT-NH2)也进行了测试(图。 3b⇓).TFLLR-NH2(100 - 1000µM)显著刺激凝胶收缩(p<0.01)。RLLFT-NH对凝胶收缩无影响2在较低浓度下。RLLFT-NH2在800和1000µM时也刺激凝胶收缩,尽管其效力远低于TFLLR-NH2(p<0.01)。
证实PAR1在介导凝血酶刺激的三维胶原凝胶成纤维细胞收缩中的作用的第二种方法是使用RNAi特异性抑制培养的HFL-1中的PAR1表达。转染PAR1特异性单siRNA后,Western blotting证实PAR1表达受到抑制,而波形蛋白表达没有改变(图4a)⇓).用PAR1 sirna混合物(SMARTpool)转染细胞后,PAR1的表达也减少。对PAR2、PAR3和PAR4表达无抑制作用。siRNA SMARTpool阴性对照对PARs的表达没有影响(图4b)⇓).转染不影响细胞活力(数据未显示)。然后将转染或未转染PAR1 siRNA的细胞铸入三维胶原凝胶中,并评估凝血酶增强胶原凝胶收缩的能力。转染试剂单独对成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩没有影响。相反,用PAR1单个siRNA转染(图5a)⇓)或PAR1 siRNA SMARTpool(图5b⇓)显着抑制血小板和PAR1激动剂诱导的增强收缩。相反,siRNA对PAR1对TGF-β1引起的收缩没有影响。
PKC和钙抑制剂对凝血酶诱导的胶原凝胶收缩的影响
为了检查PKC途径对凝血酶诱导的胶原凝胶收缩的潜在作用,在存在或不存在PKC抑制剂中,胶原凝胶与凝血酶一起刺激。一种非特异性的PKC抑制剂,葫芦蛋白C,部分地阻断了凝血酶对胶原凝胶收缩的刺激作用。常规PKC同工酶抑制剂Gö6976没有观察到抑制效果(图6⇓).相比之下,PKC-柱一抑制剂Ro-31-8220部分但显著降低了凝血酶增强的胶原凝胶收缩。由于新型PKC同工酶不依赖于钙,我们还测定了三种钙抑制剂对凝血酶诱导的胶原凝胶收缩的影响。细胞内钙螯合剂(BAPTA/AM)、EGTA和细胞内钙动员抑制剂(TMB8)对凝血酶增强的胶原凝胶收缩没有影响(数据未显示)。
通过测定凝血酶和TFLLR刺激PKC-柱一活性的能力,以及确定靶向PAR1的siRNA是否能阻断PKC-柱一的活性,进一步评估了PKC-柱一的作用(图7)⇓)凝血酶和TFLLR均显著刺激直接在HFL-1中测得的PKC-ϵ活性。然而,在存在靶向PAR1的siRNA的情况下,凝血酶和PAR1激动剂均未刺激PKC-ϵ活性。
讨论
目前的研究表明,PAR1部分介导了凝血酶增强的三维胶原凝胶收缩。凝血酶和PAR1激动剂都增强了收缩,而当PAR1的表达被RNAi抑制时,这部分被抑制。凝胶收缩的增强似乎取决于PKC-柱一的活性,因为凝血酶和TFLLR都会导致PKC-柱一的活化增强,而这也会被RNAi阻断。此外,抑制PKC-柱一能够部分抑制凝血酶增强的收缩,表明PKC-柱一是该途径的下游介质。最后,凝血酶增强胶原凝胶收缩的能力需要凝血酶的蛋白水解活性。
血液凝血系统的激活和凝血酶的生成在组织损伤、炎症和修复过程中是常见的。凝血酶除了在止血和血栓形成中发挥重要作用外,还介导多种其他细胞功能。这包括刺激各种细胞类型的增殖23-25.此外,凝血酶可以通过促进平滑肌细胞和成纤维细胞产生前胶原蛋白,激活血管平滑肌细胞产生的基质金属蛋白酶-2来影响细胞外基质的沉积和降解26那27.凝血酶可通过其他几种方法参与组织重塑。据报道凝血酶可刺激成纤维细胞介导的三维基质收缩28,一个在体外组织收缩的模型,其特征纤维化4..目前的研究支持凝血酶通过刺激胶原凝胶收缩作为组织重塑的中介物的作用。
PARs属于g蛋白偶联受体家族。它们被一个独特的过程激活:丝氨酸蛋白酶裂解细胞外的NH2终端扩展。生成一个新的NH2末端,作为一种聚醚配体,可以在分子内相互作用并结合到被切割的受体上诱导激活。目前已知PAR家族有4个成员(PAR1、PAR2、PAR3和PAR4)。PAR1, PAR3和PAR4被凝血酶激活。然而,虽然par诱导的细胞活性的全谱仍有待确定,但在许多系统中的研究表明,PAR1在介导凝血酶诱导的许多效应中发挥了关键作用16那17那29.
一些方法被用来探索特定PAR受体的作用。与栓系配体相对应的肽已经发展起来。在这种情况下,TFLLR被认为是激活PAR1的最具选择性和必要的肽30.那31在许多研究中已被用于帮助定义PAR1的角色31-33.然而,这个肽与相对低的结合亲和力相互作用,因此,需要相对高的浓度。大概的在活的有机体内栓系配体由于被保留在受体附近,即使具有相对较低的结合亲和力也可以有效。在目前的研究中,TFLLR和TFLLR-NH2被使用。两者都对胶原凝胶收缩有刺激作用,TFLLR-NH更有效2.
另一种评估该受体的方法是使用par1基因缺陷(敲除)小鼠25那34. 目前的研究使用了人类细胞,通过利用RNAi技术,使用了一种类似的抑制PAR1的方法35那36.通过这种方法,可以显着抑制PAR1表达,这与抑制凝血酶和选择性PAR1激动剂TFLL / TFLL-NH的抑制相关2. 然而,无论是单个PAR1 siRNA还是PAR1 siRNA SMARTpool都不能完全有效地阻断凝血酶或PAR1激动剂的作用。这可能是由于PAR1表达的不完全抑制,这通常是通过RNAi方法观察到的。或者,不能排除凝血酶或PAR1激动剂对PAR1以外受体(包括其他PAR)的作用。然而,目前的研究清楚地表明,PAR1至少在一定程度上与凝血酶的作用有关。
与大多数介质一样,凝血酶可以通过多种信号转导途径发挥作用。其中包括维和行动计划13那16那37.特别是PKC- ε是新型PKC亚家族的一员,是一种钙独立的丝氨酸/苏氨酸激酶,表达于肺成纤维细胞、人类气道平滑肌细胞和许多其他细胞类型和组织10那38那39.柱一已被证明参与与细胞粘附和运动有关的细胞骨架重组的调控。PKC-柱一在整合素β1介导的细胞扩散中必不可少,并且似乎负责调节HeLa细胞与细胞外基质的粘附40那41.前列腺素D2诱导胶原凝胶收缩已显示通过PKC-ε活化介导7..目前的研究支持PKC-ε的这种作用,并证明通过凝血酶通过PAR1受体激活PKC-ε。它还表明凝血酶通过可能是促进胶原凝胶收缩的常见途径,IE。PKC -ϵ。此外,本研究的数据表明,凝血酶诱导的凝胶收缩与钙动员无关,这与它通过一种新型PKC同工酶的作用一致。
本研究表明,凝血酶增强的胶原凝胶收缩至少部分是通过PAR1介导的。然而,其他的信号通路也有可能起作用。在这方面,siRNA实验只是部分阻断了凝血酶作用。尚不可能确定这是由于PAR1表达的不完全抑制,还是由于促进凝血酶作用的替代途径。此外,本研究使用的是HFL-1细胞株42.该菌株的正常人肺成纤维细胞已广泛用于评估成纤维细胞生物学。然而,成纤维细胞是异质性的,不同的信号通路在多大程度上参与了其他类型的成纤维细胞仍有待确定。其他途径可能也有贡献,这提出了一种有趣的可能性,即对其他机制的抑制可能与PAR1途径的抑制剂协同作用。
随着纤维化的积累,结构性组织的重塑是许多间质性肺疾病的特征。类似的过程也发生在呼吸道疾病,如哮喘和慢性阻塞性肺病1-3..这种气道重塑是导致气道狭窄和固定气流限制的主要原因。在这种情况下,在包括哮喘和硬皮病在内的肺部疾病中观察到凝血酶水平升高14那15.目前的研究支持凝血酶可能参与多种肺部疾病纤维化改变的发病机制的概念。然而,除了凝血酶,其他的蛋白酶也可以切割PARs43那44.这些蛋白酶在par调节的组织重塑中可能发挥的作用尚不清楚。然而,各种蛋白酶和蛋白酶抑制剂可以通过这种信号机制相互作用,这为协调控制重塑过程提出了有趣的可能性。
综上所述,凝血酶能够刺激成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩。这一作用可能有助于调节炎症和损伤后凝血酶激活引起的组织修复和重塑反应。凝血酶的这种作用是由蛋白酶激活受体1介导的,并通过蛋白激酶C-柱一起作用。确定凝血酶及其信号通路的这种作用可能有助于确定哮喘和慢性阻塞性肺病等疾病中组织重塑的机制,并可能有助于确定这些疾病的新疗法。
致谢
作者致谢了L. Richards的优秀秘书支持。
- 收到了2004年1月15日。
- 公认2004年8月22日。
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