文摘
表面活性剂蛋白(SP)——和SP-D collagen-like糖蛋白合成的远端肺上皮细胞。这项研究调查了老化的影响,长期吸烟SP-A和SP-D肺。可能与肺气肿的发展也被调查。
执行顺序灌洗在年轻和中年或老年不吸烟者和无症状吸烟者各种吸烟史。中年或老年吸烟者进一步分类根据高分辨率计算机断层扫描的肺气肿。SP-A水平和SP-D支气管灌洗(提单)流体和支气管肺泡灌洗(BAL)流体被ELISA量化。
显著降低SP-A被认为随着年龄的增长在提单流体不吸烟者,但不是在BAL液体。中年或老年吸烟者肺气肿较低水平的SP-A提单和BAL液体相比,年轻的学科,并且在提单流体相比,中年或老年吸烟者没有肺气肿。SP-D并未改变随着年龄的增长,然而,这是减少在中年或老年吸烟者相比同龄非吸烟者。
总之,表面活性剂蛋白质a随着年龄的增长可能会减少单独或由于长期吸烟的累积效应和肺气肿的发展,而表面活性剂protein-D减少由于长期吸烟。
这项研究受到了呼吸衰竭研究群卫生部,劳动,日本和福利(m . Nishimura)和科学研究从教育部拨款14570532,日本科学、文化、体育(t . Betsuyaku)。
老年人特别容易受到smoking-associated呼吸道疾病。全世界吸烟者的比例仍然很高的中年或老年人口,他们通常有长期吸烟史。然而,累积老化和长期吸烟对肺的影响防御机制仍有待阐明。上皮是第一道防御吸入有毒物质,如香烟烟雾和微生物在肺部。表面活性剂蛋白(SP)——和SP-D collagen-like属于collectin糖蛋白类c型凝集素,并合成肺泡II型细胞和nonciliated细支气管远端肺上皮细胞1。肺的生理重要性评估collectins在先天免疫最近变得可行的发展转基因实验动物模型2。虽然绑定collectins微生物可以通过聚合促进微生物间隙或其他直接影响micoroorganisms, SP-A SP-D也有能力调节白细胞功能和提高杀死微生物3。令人惊讶的是,老鼠缺乏SP-D,但不是SP-A,与时代发展进步的肺气肿4,从而突出之间的联系缺乏上皮细胞来源的蛋白和弹性蛋白降解通过不必要的活化的肺泡巨噬细胞肺癌、老化可能是一个加速因子。
它已经建立肺泡II型细胞和nonciliated支气管细胞中主要的细胞生产SP-A和SP-D肺5,6。SP-A的分布以及SP-D可能在特定的微环境调控不同的航空公司,因此可以作为标记的地方上皮细胞的功能。因此,当前的研究调查了年龄,是否和/或smoking-associated变化可能发生独立SP-A和SP-D气道和肺泡空间和这些变化是否会有助于解释减少肺宿主防御和/或增加易感性破坏性的老烟民的细胞外基质的变化。在这项研究中,连续灌洗在年轻和中年或老年非吸烟者,和水平的SP-A SP-D评估在支气管灌洗(提单)流体,其中包含从气管组件,和支气管肺泡灌洗(BAL)液体,这是代表组件在肺泡空间。数据被分析在中年或老年吸烟者表现出气性变化对高分辨率ct (HRCT)扫描来评估这些蛋白之间可能的联系和发展的早期肺气肿。
材料和方法
主题
终身不吸烟者由15年轻男性和七个中年或老年男性。吸烟者20年轻男性烟龄< 3岁和62名中年或老年人,包括六个女性,与吸烟的历史> 20岁。前吸烟者被排除在本研究之外。中年或老年吸烟者,HRCT扫描进行为了屏幕气性变化,然后他们被分类的存在与否气性变化如前所述7。简单,三个肺内科医生,他们无视任何个别病人的信息,独立评估气性变化的存在在所有系列水平切片HRCT扫描。我们定义科目肺气肿(+),无论大小或疾病严重程度,协议的基础上,所有的医生。所有其他对象被定义为肺气肿(−)。肺功能测试进行肺活量和在一秒用力呼气量(FEV1所有受试者)。Spirometory和呼气流速测量滚动密封肺活量计(CHESTAC-55V;箱有限公司、日本东京)据美国胸腔学会推荐的标准技术8。三个可接受曲线的最佳值用于分析。所有的受试者呼吸道症状或comorbidties,免费,急性呼吸道感染前2个月。所有的患者报告职业暴露或肺部疾病的历史。书面知情同意是来自每一个主题,北海道大学医学院伦理委员会批准了这项研究协议。大多数的中年或老年吸烟者作为受试者在先前的研究从第一个医学部门,北海道大学医学院9,10。
连续的支气管肺泡灌洗
患者和健康志愿者接受连续落下帷幕,详细在其他地方,为了分别收集材料和外围大航空公司10。短暂,右边中间叶或左边对应的每个主题和50毫升灌洗能整除(总量:200毫升)的无菌0.9%生理盐水在室温下通过楔形柔性支气管镜(奥林巴斯BF-B3R、东京、日本)。液体复苏后第一个50毫升整除作为提单流体包含细胞与材料的大型航空公司。其余灌洗液是汇集和用作BAL液体。恢复提单流体和BAL流体分别几层纱布过滤,以去除多余粘液和碎片,然后是在1500转离心5分钟在4°C的上层清液分离细胞。整除的上层清液(1毫升)立即冷冻和储存在试验前−70°C。细胞颗粒被计入haematocytometer, Wright-Giemsa染色涂片cytospin后确定微分资料准备。微分项进行通过检查≥200个细胞使用标准光学显微镜如前所述7。白蛋白在unconcentrated BAL液上层清液是由激光测量浊度测定法对所有受试者如前所述7。
ELISA对表面活性剂蛋白质a在支气管灌洗和支气管肺泡灌洗液体
SP-A水平unconcentrated灌洗液体使用固相单克隆抗体ELISA测定PC6和HRP-conjugated单克隆抗体PE10如前所述11。之间的反应能够检测2.0 ng·-200毫升−1SP-A。相当于整除灌洗液的用于ELISA。试验是在重复执行和数据表示的意思是重复的样本。样本混合大力测量之前,为了避免沉淀聚合SP-A灌洗液体12。
ELISA对表面活性剂protein-D支气管灌洗和支气管肺泡灌洗液
SP-D水平unconcentrated灌洗液体被使用单克隆抗体夹心ELISA测定7 c6 HRP-conjugated单克隆抗体6 b2如前所述13。这个试验的敏感性为3.1 ng·毫升−1。相当于整除灌洗液的用于ELISA。试验是在重复执行和数据表示的意思是重复的样本。
西方墨点法
Unconcentrated BAL流体(10µL)变性andreduced 2-mercaptoethanol的存在,和wasthen电泳10% sodium-dodecylsulphate-polyacrylamide凝胶使用pre-stained分子量标记(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。蛋白质被转移到PVDF膜(美国微孔,贝德福德,MA),用半干转移细胞(ae - 6677,阿,东京,日本)。非特异性结合位点被封锁与Tris-buffered saline-containing 0.1%渐变20 (TBS-T)和5%脱脂奶粉1 h在室温下。膜与单克隆抗体对孵化SP-A (PC6) 5µg·毫升−1或单克隆抗体SP-Dµg·毫升10点(6 b2)−1一夜之间在4°C。与TBS-T三洗后,膜被孵化辣根peroxidase-conjugated anti-mouse免疫球蛋白或anti-rabbit免疫球蛋白1:10,000稀释(DAKO)。抗体绑定的网站视觉效果使用ECL +®免疫印迹检测系统(英国Amersham,艾尔斯伯里)。
统计分析
所有的值被表示为±扫描电镜,除非另有说明。统计分析中使用单因素方差分析进行五组之后,费舍尔的测试。提单和BAL流体之间的比较,数据被配对t检验分析。斯皮尔曼等级相关的计算评估数据之间的相关性。在所有的测试中,p值< 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
研究对象的特点
临床特点及肺功能的数据列于表1⇓。年轻的主题范围从18岁至29岁的年龄,和中年或老年人从41 - 77岁不等。没有明显的差异之间的吸烟年龄或pack-yrs中年或老年吸烟者有或没有气性变化HRCT扫描。数据显示,FEV肺功能1/用力肺活量略,但显著降低组与肺气肿组没有肺气肿(p < 0.05)。拜尔港结果如表2所示⇓。总回收率为中年或老年吸烟者与肺气肿是比别人更明显降低(p < 0.05,分别),它也降低中年或老年吸烟者没有肺气肿与中青年和老年人不吸烟者(分别p < 0.05)。没有差异,白蛋白的浓度平衡液中五组。巨噬细胞和中性粒细胞的百分比BAL流体当前吸烟者的三组之间没有差别。
表面活性剂蛋白质a在支气管灌洗和支气管肺泡灌洗液体
SP-A在洗胃液体的浓度比在五组(图1所示⇓)。显著降低SP-A被认为随着年龄的增长在提单流体从非吸烟者,但没有减少BAL流体。显著降低SP-A在提单流体和BAL流体在中年吸烟者与肺气肿相比,从年轻的不吸烟者和提单流体从年轻的吸烟者。此外,在提单SP-A流体的水平明显不同的两组之间的中年或老年吸烟者有或没有肺气肿。
表面活性剂protein-D支气管灌洗和支气管肺泡灌洗液体
SP-A相比,吸烟习惯多样化影响清洗液体的SP-D水平随着年龄的增长(图2所示⇓)。两组的中年或老年吸烟者,无论肺气肿的存在,在提单SP-D的含量明显低于液体相比,年轻和中年或老年非吸烟者,以及年轻的吸烟者。类似的差异也在BAL流体。然而,没有观察到显著差异的水平SP-D在提单或BAL流体之间的两个年轻组。没有明显差异的水平SP-D在提单或BAL流体之间的中年或老年吸烟者有或没有肺气肿。
表面活性剂分子状态的蛋白质a和表面活性剂protein-D支气管肺泡灌洗液
分子SP-A和SP-D BAL流体之间减少条件下比较年轻的中年或老年吸烟者与不吸烟者和肺气肿。落下帷幕的液体从年轻不吸烟者(图4⇓通道1 - 4)一个沉重的乐队在∼36 kDa,额外∼62 kDa乐队使用单克隆抗体PC6检测。落下帷幕的液体从中年或老年吸烟者肺气肿(图4⇓道5 - 8)∼36 kDa乐队也在场,但更突出BAL流体从年轻的吸烟者,∼62 kDa乐队已经很少见了。单克隆抗体6 b2发现SP-D乐队在∼43 kDa(单体的子单元)和50∼kDa除了一个主题(巷1)减少条件下(图4 b⇓)。落下帷幕的液体从中年或老年吸烟者与肺气肿SP-D减少这两种形式相比,BAL流体从年轻的非吸烟者。
讨论
最好的作者的知识,这是第一次研究证明吸烟对肺collectins老化和长期的影响在提单和落下帷幕的液体,并确认这些分子之间的关联和肺气肿。
尽管许多研究已经发表的水平SP-A灌洗液体从健康受试者和肺部疾病的患者,平均浓度的SP-A灌洗液体显示巨大的变化14。不一致的结果也已报告关于吸烟的影响在洗胃液体SP-A水平,减少15,稍微增加16,或者保持不变17。然而,没有观察到变化在大鼠暴露于香烟烟雾18。除了SP-A使用不同抗体的免疫化学计量的差异和标准19,大的变异和不一致的结果从不同的调查人员可能部分是由于pre-analytical灌洗样品的处理。因为SP-A紧密地绑定到磷脂calcium-dependent的方式,它的浓度在洗胃液体明显不同测量表面活性剂phospholipid-rich颗粒或上层清液的液体。Kurokiet al。12显示,99.1%的SP-A isassociated原油浮在表面的颗粒和剩下的0.9%存在于上层清液。在这项研究中,每个样本进行有力的涡流为了避免技术错误造成聚合和降水SP-A灌洗液体外。肺巨噬细胞被绑定,合并,降低SP-A20.,这种能力取决于激活的状态21。增加的数量和/或激活状态在肺巨噬细胞可能是一个因素导致上皮衬里SP-A水平降低流体在活的有机体内除了改变合成和分泌的SP-A肺上皮细胞。
据报道SP-D水平低BAL流体的吸烟者15,虽然年龄因素没有很好地记录,然后这是猜测,相对缺乏SP-D吸烟者可能会导致增加数量的凋亡细胞在气道,从而导致肺气肿的发展22。SP-D替代疗法促进减少过剩的凋亡细胞,减少炎症小鼠肺气肿发展23。尽管作者预期的相对缺乏SP-D吸烟者发展肺气肿的子群的基础上,发现SP-D缺乏发展进步的领空在老鼠身上随着年龄的增大4,没有显著减少的水平SP-D在提单和BAL观察流体与肺气肿的HRCT扫描。从目前的研究结果突出的困难获得推断数据在人类疾病动物模型,至少在某种程度上,因为终端进行航空公司的体系结构显示了特有的变化除了高度多样化的上皮细胞组成24。然而,应该注意的是,肺气肿严重程度划分为低,分布异构对象在当前的研究中。因此不能排除SP-A和SP-D水平可能会降低个人的更高级的肺气肿。无关地,它可能会推测SP-A下降和/或SP-D下呼吸道,可能导致肺受损宿主防御,特别是如果认为SP-A和SP-D在先天免疫中发挥重要作用2。
虽然没有病理相关性表现在当前的研究中,可能的减少SP-A和SP-D在提单和BAL液体在呼吸道上皮转换有关。杯状细胞的增加和鳞状上皮化生是一种行之有效的模式在吸烟者呼吸细支气管,导致一个稀疏的细支气管纤毛密度和nonciliated细胞25在协会壁炎症和纤维化26。因此,减少表面活性剂蛋白质在提单和BAL液体可能反映了居民细胞表型变化或变化类型的细胞位于这些解剖区域。SP-A的蛋白水解降解和/或SP-D可能是另一种解释水平下降的液体灌洗,因为使用的夹心ELISA系统在本研究中只检测到完整SP-A或SP-D,可能形成低聚物。千叶et al。27证明了单克隆抗体的抗原决定基PC6和PE10 Thr184-Gly194位于collagen-like域的区域内(CRD)。ForSP-D ELISA, alsorecognise共同使用的两种单克隆抗体地区CRD (y Kuroki未发表的数据)。因此,使用这些单克隆抗体的ELISA SP-A或SP-D,只能检测到低聚物,因为可能的两个抗体之间的竞争。梅森et al。28直接证明III型胶原酶消化SP-D并产生碎片。然而,dodecamers SP-D可以选择性地增强metalloroteinase活动在体外29日。当前作者之前报道,间质胶原酶明显升高BAL流体从中年或老年吸烟者早期肺气肿10中,蛋白水解降解SP-A和/或SP-D可能发生。为了评估SP-A的分子质量和SP-D,因此,西方墨点法。没有SP-A和/或SP-D的小片段,这可能已经经历了各种分歧,BAL流体中发现,尽管在SP-A和SP-D减少尺寸被确认在中年或老年吸烟者与肺气肿。62 kDa群SP-A BAL的存在流体报道减少条件5。的相对损失这62 kDa乐队在中年或老年吸烟者是有趣的;然而,机制还不清楚。还需要进一步的研究来阐明不同形式的SP-A灌洗液体使用凝胶过滤或电子显微镜与阴影技术。50 kDa-form SP-D据说是糖化变体出现在BAL流体;然而,这种形式的临床相关性还有待阐明28。受试者之间没有明显的临床差异和没有50 kDa-form SP-D免疫印迹。
抽样的上皮衬里流体通过支气管肺泡灌洗是一种常见的手段研究肺上皮细胞分泌的蛋白质,在肺部疾病调查这些蛋白质的变化14。当前作者表现顺序支气管肺泡灌洗在无症状志愿者一系列研究各种吸烟史第一医学部门,北海道大学医学院9,10。之前它已经表明,连续灌洗液的整除采样时,最初的整除代表近端航空公司后来整除代表肺泡和远端气道液体,细胞数量变化根据网站呼吸道的起源30.。支气管和远端样本分离,表现在这项研究中,往往强调这些变化,这可能发生在整个气道多样化。在这个研究中,有更高水平的SP-A和SP-D提单比BAL流体流体。当所有受试者一起分析,在提单SP-D液的浓度密切相关与BAL液体,在一个贫穷的关系获得SP-A在那些液体,因此建议SP-A上皮衬里流体可能以不同的方式管理沿着呼吸道或部分与微分与炎症细胞损失。由于缺乏适当的标记的稀释液体灌洗对变量恢复上皮衬里流体31日,当前作者决定不正常化SP-A的数据和SP-D白蛋白或尿素,和数据被表示为灌洗液的浓度,其他的研究9,15。在最近的研究中,灌洗液的复苏是低得多在中年或老年吸烟者,尽管没有差别的白蛋白水平平衡液中组。这可能影响比较年轻和中年或老年吸烟者和吸烟者和非吸烟者的中年或老年群体。
总之,目前的研究表明,长期吸烟明显降低表面活性剂protein-D浓度下呼吸道上皮衬里流体,不管肺气肿的存在,而老龄化单独或长期吸烟和肺气肿的联合效应可能导致一个明显的减少表面活性剂蛋白质a。应该注意的是,水平的降低表面活性剂的临床后果蛋白质a和表面活性剂protein-D沿着气道和肺泡上皮衬里液体空间仍然不确定在活的有机体内。从目前的研究结果支持这样一个概念,即获得性表面活性剂protein-D缺陷由于吸烟可能导致肺气肿在人类中,表明表面活性剂protein-D补充可能是有益的。多方面的性格化的中年或老年吸烟者与长期吸烟史,与最近的年轻的吸烟者,可能部分解释的肺部受损宿主防御和倾向破坏性的肺部疾病,肺气肿等可能发生在以后的生活中。
确认
.高级和作者要感谢。克劳奇的华盛顿大学医学院的有用的评论,和y铃木进行免疫印迹技术援助,和技术支持人员测量SP-A SRL公司。
- 收到了2004年6月1日。
- 接受2004年8月6日。
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