摘要
慢性阻塞性肺疾病(COPD)中膈肌和股外侧肌适应的时间表尚未研究。这项研究的假设是,在COPD患者中,膈肌比股外侧肌的肌肉变化发生得更早,这一发现表明,在决定肌肉表型表达方面,局部因素比全身因素更重要,至少在轻中度疾病中是这样。
在轻中度COPD患者和肺功能正常的受试者中评估股外侧肌和膈肌的适应性。
在两组中,膈肌的氧化电位和脂褐素包体的数量都高于股外侧肌。与对照组相比,COPD患者的膈肌具有更高的氧化能力和I型纤维的比例,IIA型纤维的比例相反地减少,而膈肌横截面面积、毛细血管化和脂褐素包体没有差异。两组的股外侧肌无显著差异。
总之,这些数据表明,对照组和慢性阻塞性肺疾病患者的膈肌比股外侧肌具有更高的氧化电位,而且在轻中度慢性阻塞性肺疾病患者中,膈肌比股外侧肌更早发生肌肉适应。
这项研究得到了加拿大卫生研究所mopo -53135的资助。R. Debigaré获得了the Fonds de la Recherche en Santé du Québec博士培训奖。F. Maltais是the Fonds de la Recherche en Santé du Québec研究学者。
骨骼肌具有很强的适应各种慢性扰动的能力。在严重慢性阻塞性肺疾病(COPD)中,外周肌肉适应的证据包括I型纤维向II型纤维的转移1.,所有纤维类型的肌肉毛细血管的减少2.氧化酶活性降低3..毫不奇怪,在严重的COPD中也描述了隔膜的适应。该肌肉长期受到呼吸负荷增加和过度膨胀的挑战,过度膨胀使横膈膜处于机械上不利的位置,随着时间的推移构成长期的训练刺激4..膈肌适应的证据大多在晚期COPD患者中报道,在这些患者中,发现纤维从II型转移到I型,同时线粒体密度增加5.–7..从这些研究中得出的一般结论是,股外侧肌和膈肌在重度COPD中以不同的、相反的方式适应。
目前文献的一个局限性是膈肌和股外侧肌样本不是来自同一个人。考虑到纤维型分布和酶活性在个体间的巨大差异,这引起了方法学上的关注8..例如,在一项大型研究中,久坐不动的健康受试者股外侧肌中I型纤维的比例变化为15-85%8..在这种情况下,对来自不同患者中获得的I型纤维比例的差异可能非常难以解释。为了解决这个问题,并排除性别,营养状况差异和先前暴露于皮质类固醇的潜在混淆影响,从本研究中的同一个体获得了夸张的外侧和隔膜样品。最近,Engelen.et al。9据报道,同一COPD患者膈肌中的I型纤维比例高于股外侧肌。然而,肌肉毛细血管化和酶活性,这两个氧化能力的其他重要指标,在本研究中未进行评估。
尽管COPD患者膈肌和股外侧肌发生了重要的变化,但这些变化的时间表尚未被研究;例如,膈肌适应是先于外周肌适应还是紧随其后尚不清楚。这个问题的答案将有助于阐明COPD骨骼肌功能障碍的潜在机制。解决这个问题的理想实验设计将是一项纵向研究,评估给定个体在COPD进展过程中横膈膜和股外侧肌随时间的变化如何适应;然而,出于明显的原因,这将是一项极具挑战性的研究。目前的作者推断,通过研究一组轻到中度疾病的患者,可以获得一些关于慢性阻塞性肺病肌肉适应年表的有趣信息。如果COPD中的骨骼肌适应是由系统性过程(如低级别慢性炎症)启动的,那么可以预期膈肌和股外侧肌也会出现类似的同时发生的适应。相反,有效的假设是,COPD患者的膈肌比股外侧肌发生更早的肌肉变化,这一发现将与局部因素(如。肌肉活化程度)比全身因素(如。至少在轻到中度疾病的早期,在确定肌肉表型表达方面。
因此,本研究的目的是:1)比较同一个体的股外侧肌和膈肌的组织化学、形态学和酶学变化,包括轻到中度COPD患者和肺功能正常的受试者;2)评估轻中度COPD患者膈肌适应的证据是否早于股外侧肌。
方法
主题
28名接受肺切除术的受试者被招募。肺功能正常16例(男13例,女3例),慢性阻塞性肺病12例(男10例,女2例)。COPD的诊断是基于既往吸烟史和肺功能测试显示不可逆的气流阻塞(支气管扩张剂后一秒用力呼气量(FEV)1.) <80%预测和FEV1./强制生命能力<70%)。患有可影响骨骼肌功能的合并症的患者被排除在外:心力衰竭,不受控制的糖尿病,全身性皮质类固醇,低体重(体重指数(BMI)<20kg·m−2.)和营养状况不稳定。在调查肺癌时,用人体测量参数和白蛋白水平评估营养状况。本研究未评估身体成分。该机构的伦理委员会批准了研究方案,每个患者都签署了一份书面知情同意书。
评价
骨骼肌与数据分析
对于每个受试者,选取三个相邻的肌肉切片,用于测定纤维分型、毛细血管化和脂褐素含量(图1)⇓).所有技术已在前面详细描述2.在不知道临床数据或样本来自哪块肌肉的情况下进行。
纤维分型和横截面积(CSA)的测定
根据单步乙醇修饰技术,对一块肌肉切片进行肌原纤维atp酶活性的组织化学染色18.肌纤维按染色强度分为I型(未染色)、IIA型(浅染色)和IIB型(深染色)。所有肌肉切片都被放大,并转移到图像分析系统(Windows上的image Pro Plus 4.1;媒体控制论,银泉医学博士,美国)。对所有纤维进行计数和分类,以获得每个受试者的纤维类型组成。每一种纤维的横截面面积(CSA)是根据随机选取的40种每一种纤维计算的19.组织化学优于免疫组化,因为在人体中很难获得可靠的抗体对II型纤维进行亚分类。在一项验证研究中,发现两种方法18非常一致;从每种方法获得的II型纤维的比例强烈相关(斜率= 0.96,r = 0.83,p <0.001)。
肌肉capillarisation
用α-淀粉酶-周期酸移法对肌肉切片进行染色,观察毛细血管化2..肌肉毛细血管化的两个指标是:1)毛细血管对纤维的比例,用相应肌肉切片上的毛细血管总数除以纤维总数;2)毛细管接触量/纤维CSA比值,用毛细管接触量除以每种纤维的平均CSA得到。这是对每种类型随机选择的20种纤维进行的2..
统计分析
结果表示为平均值±sd,根据数据的正常性。采用非配对t检验或Mann-Whitney u检验比较两组受试者的特征和肺功能指数。用糖酵解与柠檬酸循环和脂肪酸β氧化的酶活性比来比较肌肉酶活性。这些有区别的比率提供了有关肌肉中优先酶途径的有用指示21. 交叉嵌套方差分析用于比较个体内和个体之间的横膈膜和股外侧肌。为了进行分析,使用了具有复合对称结构的模型,该结构在测量值之间具有恒定方差和恒定协方差。正态性假设通过Shapiro-Wilk检验得到验证。Levene检验统计量的Brown和Forsythe变异用于验证方差的同质性。结果被认为是显著的,p值<0.05。
结果
受试者特征
受试者特征及肺功能数据如表1所示⇓.COPD患者平均出现轻度至中度气流阻塞,平均FEV1.根据2003年加拿大慢性阻塞性肺病指南,预测为65±8%2212名患者中有9名患有轻度COPD(FEV)1.其余3例COPD患者为中度疾病(FEV)1.50 - 60% pred)。气流阻塞与气体滞留和恶性通货膨胀有关。两组之间的BMI和白蛋白水平相似。根据术前评估,28名受试者中21人被认为是可切除的肺癌,其余受试者为良性肿瘤(n=6)或独特的肺转移(n=1)。5例患者在手术时发现有不可切除的肺癌:恶性胸腔积液(T4.纵膈镜阴性患者的同侧淋巴结转移(n2.淋巴结转移2例)和肺内转移1例。这些患者在两组中平均分布(COPD组n=3;对照组n=2),术前BMI和临床状态与完全手术切除组无差异。COPD组中只有1例患者接受了2个周期的新辅助化疗2.疾病辅助诊断粘黏肠阻塞。该患者的临床数据与COPD组的其他患者相似,从分析中删除她的数据并没有改变结果。因此,他们决定将这个课题保留在研究中。
对照组与COPD患者膈肌的比较
组织化学和形态学特征
两组患者膈肌的组织化学和形态学特征如图4所示⇓.与对照组相比,COPD患者的膈肌中I型纤维的比例更大,而IIA型纤维的比例则相反。纤维CSA在两组之间没有显著差异。对照组毛细血管纤维比(1.73±0.59)与两组COPD患者(1.69±0.29)和所有纤维类型的毛细血管接触/纤维CSA相似。
肌肉酶活性
除了LDH之外,与对照受试者相比,COPD的活性降低,酶活性在两组中的隔膜之间可比。然而,在考虑鉴别酶活性比率时,COPD患者中的隔膜与对照受试者的隔膜相比表现出增强的氧化潜力(图4E⇑)COPD患者膈肌与对照组之间的脂褐素积累无统计学显著差异:2.23±0.66与1.81±0.90.
对照组与COPD患者股外侧肌的比较
对照组与COPD患者股外侧肌在组织化学、形态学特征、肌酶活性及脂褐素积累方面无显著差异。
讨论
以前的研究表明,隔膜和夸张的侧面在严重的COPD中经历了重要的适应6..目前的研究提供了在COPD或正常肺功能的同一个体中这两种肌肉的详细形态计量和代谢比较。这使得在比较两块肌肉时,可以控制潜在的混杂变量,如年龄、营养状况和皮质激素的使用。此外,我们还对轻中度COPD患者进行了研究,以便对COPD肌肉适应的时间序列进行一些推断。目前研究的主要发现与以前的出版物一致,表明膈肌比股外侧肌更具有氧化性。在轻中度COPD中,膈肌中发现肌肉适应的证据,而股外侧肌没有。这种差异适应与一种假设是一致的,即在疾病较温和的阶段,局部因素(如。在解释copd诱导的肌肉适应方面,肌肉激活水平)可能比全身因素更重要。
肌肉酶活性和形态特征
具有正常肺功能的受试者的本数据与众多报道一致,表明隔膜更加氧化25与夸张的侧面相比。COPD患者甚至更加明显这种趋势。实际上,在该基团(Cs和哈希)中上调氧化酶活性,其导致与综合侧面相比,在隔膜中的鉴别酶酶比较低。这表明COPD中的隔膜大大依赖于其氧化机械,依赖于厌氧糖酵解。与夸张侧面相比,更好的膈肌毛细管接触/纤维CSA的趋势也符合该观察。
最近评估了晚期COPD患者的膈肌适应5..与对照横膈膜相比,II型纤维向I型纤维的明显转移,快肌球蛋白重链相对于慢肌球蛋白重链的比例平行减少,线粒体容量和效率增加7.在晚期慢性阻塞性肺病患者的膈肌中5.本研究是为数不多的评估轻度至中度COPD患者膈肌形态和酶活性的研究之一27. 虽然先前的研究者没有报告轻度COPD患者的纤维类型改变,但目前的结果表明,在纤维类型比例方面,纤维类型的改变方向相同,但幅度小于重度COPD患者5..与对照组相比,COPD患者膈肌中区分酶比率(LDH/CS和LDH/HADH)的下降与前者向更多氧化纤维的纤维型转换相一致。这些结果与以前的研究之间存在差异的可能原因可能在于所选择的患者群体的特征和规模。总而言之,在COPD患者的膈肌中发现的适应似乎与耐力训练计划的预期相似28,除了在COPD中没有发现肌毛细血管化方面的膈肌适应的证据。考虑到增加的氧化电位和毛细血管供应之间的联系,这有点令人惊讶26.在严重的COPD中,膈肌通过增加线粒体和毛细血管密度来适应30.,提示毛细血管增生是适应的后期过程。
与膈水平相比,轻中度COPD患者的股外侧肌与对照组没有差异。因此,轻度慢性阻塞性肺疾病的情况与严重慢性阻塞性肺疾病的情况不同,严重慢性阻塞性肺疾病的股外侧肌发生深刻的变化,并伴有氧化电位的降低,已多次被报道1.总之,在膈肌和股外侧肌上收集的数据强烈表明COPD诱导的细胞适应首先发生在膈肌,然后发生在股外侧肌。
目前建议稳定COPD中的隔膜是一种适应良好的肌肉,也许是因为它受到慢性激活状态的保护。COPD中膈纤维萎缩的一致发现5.因此,出乎意料,因为运动训练通常与纤维肥大有关。在目前的研究中,与股外侧肌相比,对照组和患者横膈膜的纤维CSA更小。有趣的是,在多年的纯耐力训练后,肌肉纤维萎缩已经被报道32.这一观察的意义和机制,可能代表着试图增加每个纤维CSA的毛细血管数量和减少扩散距离,只能推测。
氧化应激的标记
选择脂褐素作为氧化应激的标志是基于多项观察。虽然脂褐素是不同物质的混合物,脂质过氧化,一个公认的氧化应激的后果,是必不可少的形成33. 当自由基负荷增加时,脂褐素积累35组织抗氧化剂水平与脂褐素水平呈负相关36. 脂褐素的一个独特特征是细胞对其清除能力差34.因此,它被用作肌肉纤维内累积氧化损伤的标记。脂褐素在肌膜下区域的细胞内位置(图1c)⇑)是一个富含线粒体的区域,线粒体是活性氧生成的重要来源,也与氧化应激和脂褐素的关系一致。一个方法论考虑当量化氧化应激通过计算脂褐质包裹体的数量是他们的表面积可以从一个包含到下一个变化,这样更大的脂褐质积累(夹杂物的数量的产品表面)可能会有所不同,尽管同样数量的夹杂物。为了解决这一问题,我们对5名对照组和5名COPD患者随机选择的40例膈肌和股外侧肌纤维中所有脂褐素包体的表面进行了测量。虽然在大小上有一些差异,但脂褐素包涵体的平均表面积在两组肌肉之间没有显著差异。
因为它的高氧化特性7.以及它的慢性收缩活动38,隔膜产生大量的氧化剂,因此可以更容易受到氧化应激的影响38与股外侧肌相比,横膈膜中脂褐素的积累更大,这表明在对照组和COPD患者中都是如此。脂褐素在I型和II型横膈膜纤维中都有增加,可能是因为这两种纤维比股外侧肌相应的纤维具有更大的氧化电位6.. 虽然氧化性肌肉也比氧化性较弱的肌肉具有更大的抗氧化能力39,可以想象,膈肌的抗氧化能力不足以匹配其更大的氧化负荷。最近在COPD患者中进行的研究表明,股四头肌的局部运动可能诱发该肌肉内的氧化应激,这可能与肌肉耐力降低有关40.在某种程度上,这些发现也适用于膈肌,在轻到中度COPD中,氧化应激的慢性积累可能会增加疾病后期膈肌功能障碍的可能性。相反,氧化应激并不一定会损害肌肉;事实上,这可能是触发肌肉适应的必要条件41. 膈肌氧化应激对膈肌有益还是有害的问题超出了本研究的范围,值得进一步评估。
方法论的注意事项
在人类受试者中,研究其细胞对疾病的适应性所需的横膈膜样本只能在计划进行外科手术的患者身上获得。大多数参与研究的受试者肺肿瘤的存在可能会影响肌肉功能,其本身或通过癌症相关的恶病质。然而,在此基础上,对照组和COPD患者之间的差异不太可能得到解释,因为两组之间的癌症分期和营养状况(BMI和白蛋白水平)相似。一些受试者在手术前住院,增加了活动水平降低可能导致股外侧肌酶活性减少的可能性,部分解释了所观察到的膈肌和股外侧肌之间的差异。术前住院最重要的理由是完成远离医院地区患者的医疗评估。这些患者在住院期间仍然可以活动,并受益于一般物理治疗。还应注意的是,当仅考虑那些在分析中手术当天入院的患者时,膈肌和股外侧肌之间的酶活性差异仍然存在。给定与活性降低相关的纤维型剖面变化的时间过程42,在COPD患者中观察到的膈肌和股外侧肌之间的纤维型分布变化不太可能以术前住院几天为基础加以解释。
结论
目前的研究结果表明,肌肉对慢性阻塞性肺疾病的适应发生在膈肌早于股外侧肌。这一发现支持了以下观点:在轻中度慢性阻塞性肺疾病中,局部因素(如肌肉激活水平)可能比全身因素(如炎症)与肌肉适应更相关。
致谢
作者感谢A. Michaud的技术援助,S. Simard的统计援助,以及M. Bélanger, M-J的贡献。感谢布列东、Jean、Simard和Faucher对这项研究的帮助。
- 已收到2004年4月16日。
- 认可的2004年7月30日。
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