文摘
外围骨骼肌功能的研究在慢性阻塞性肺病(COPD)患者日益增长的兴趣,但往往需要活检,通常与Bergstrom技术。目前的研究旨在测试一种微创技术的有效性:microbiopsy。
17个COPD患者和四个正常人,两股外侧肌标本采取局部麻醉下经皮,有16-gauge针(microbiopsy)和其他Bergstrom针。柠檬酸合成酶的酶活性(CS)和磷酸果糖激酶(PFK)和肌凝蛋白重链(MyoHC)组成的测量技术。
受试者报告说,没有痛苦或更少microbiopsy而Bergstrom活检。microbiopsy样品重量达到55±17毫克。两种技术显示CS活动和MyoHC成分基本一致。PFK活性技术之间没有统计学差异,但协议是温和的。活检技术之间的协议是稳定的。中位数(范围)内的纤维数量microbiopsy标本是144 (38 - 286)。
总之,目前的研究显示了微创肌肉活检技术的可行性和有效性,更舒适为主题,而Bergstrom技术。
证据是积累,骨骼肌功能障碍是频繁的慢性阻塞性肺病(COPD)患者,导致运动不耐受,贫穷的生活质量,甚至过早死亡1。的研究来阐明肌肉功能障碍的潜在机制从而加强在这一领域2。Bergstrom描述穿刺活检技术3是最常用来评估股外侧肌在细胞水平上,和,事实上,它已经成为生物医学研究的一个重要工具。这种技术,也称为半开的活检,对生化很有用,组织化学和histomorphometric肌肉分析,结果类似于开放肌肉活检4。经皮conchotome活检,也半开的肌肉活检技术使用一个“鳄鱼钳”,是一种替代Bergstrom技术用于活检肌肉,如前胫骨5。最后,开放的股外侧肌活检6,7和三角肌8最近在慢性阻塞性肺病患者在体外收缩性或生化研究。尽管经验丰富的团体报道只罕见的和有限的并发症,这些技术可能是痛苦的,他们需要至少一个5-10-mm皮肤切口。它们相对的侵袭性使得它很难获得几个活检从相同的科目学习,因为,例如,骨骼肌的反应时间进程的干预措施,如运动训练或合成药物补充9。微创半开的肌肉活检的替代品已经被一些作者提出在不同医疗领域工作,如肌肉肿瘤10神经肌肉疾病11,12和心脏衰竭13,14。细针肌肉活检,也称为microbiopsies,被成功用于获得肌肉组织在一些研究中,但是,当前作者的知识,获得的结果与这些技术从未与半开的技术。此外,使用microbiopsy仍局限于少数团体所描述的各种技术,并没有流行起来。呼吸领域特别是,当前作者无法找到任何研究,这些技术被用来骨骼肌活检。几个潜在的缺点可能提出解释:样品的重量有限,可疑标本的质量,不确定性的有效性microbiopsy相比Bergstrom技术。因此,本研究旨在测试的有效性肌肉microbiopsy与Bergstrom技术相比,这被认为是黄金标准。两股外侧肌的经皮活检标本来自相同的主题,一个使用16-gauge一次性针(microbiopsy)和其他使用Bergstrom针。肌肉酶活性和不同的肌球蛋白重链的分布(MyoHCs)两种技术之间的比较。
材料和方法
研究设计
当前作者利用参与COPD患者和健康者,他们要进行穿刺活检的股四头肌为研究目的,以评估microbiopsy过程之间的协议和Bergstrom针吸活组织检查。所有受试者在拉瓦尔医院评估运动生理学实验室(加拿大魁北克)。在一个实验室访问,每个主题经历了从同一地点连续两个经皮活检股外侧肌的大腿水平。切片都是由相同的两个调查员。在局部麻醉下,microbiopsy 16-gauge一次性的针是执行第一,其次是经皮肌肉活检,像Bergstrom所描述的那样3,6毫米切割套管针。研究机构伦理委员会的批准,并且每个主题获得了彻底的解释本协议的基本原理和过程,给他们的知情同意。
本研究是在1年的时间内进行的,在此期间受试者招募了三个连续的阶段。第一阶段允许当前作者评估microbiopsy手术的可行性和安全性,和优化组织准备和分析的后续阶段的研究。因此,本研究设计还允许提供有用的信息关于microbiopsy技术学习过程。
在初步的尝试表明,18-gauge万能®针太小,提供足够的肌肉组织,第一阶段的研究是进行五个科目使用16-gauge万能®针(1.65毫米直径,万能®针,MN1610;美国巴德,卡温顿,GA)。这五个受试者更令人满意的结果:临床耐受性非常好,总重量的1 - 3 microbiopsy样品从11日至20日毫克不等。在第二和第三阶段的研究中,分别九和八个受试者招募了。决定,基于第一阶段的结果,增加肌肉样品的数量获得三到六microbiopsy过程。这样做是为了增加肌肉组织从microbiopsy获得的数量。只在第二和第三阶段获得的生物数据被用于数据分析。
总共11(八个慢性阻塞性肺病和三个健康受试者)的17个学科研究贡献了两次(他们有两个活组织检查每种类型的两次)。这样做是为了履行的要求他们参与研究协议。不可能直接比较第一和第二microbiopsies的结果,因为他们获得在不同条件(如。后的侧腿,muscle-fatiguing运动)。然而,这也允许当前作者研究之间的协议是否microbiopsy Bergstrom活检坚持随时间和/或在一个不同的状态。
研究对象
总的来说,男性COPD患者(平均±17sd年龄69±5年;一秒钟用力呼气量在34±12%预测;身体质量指数(BMI) 24.8±3.3公斤·m−2)和四个健康男性不吸烟者(年龄27 - 29岁;BMI范围20.8 - -23.7公斤·m−2)进行了研究。慢性阻塞性肺病的诊断是基于以前或现在吸烟史和肺功能测试显示不完全可逆的支气管阻塞15。所有患者临床稳定的研究。没有主题活检手术的禁忌症,如抗凝或已知discrasia血。
活组织检查程序
Microbiopsy设备和针
的执行microbiopsy弹簧和可重用的乐器,万能®活检系统(MG1522;吟游诗人)。这个设备是一个自动活检系统的最新版本,这已被证明有效的细针经皮活检的各种组织,如肝、肾、胰腺、前列腺、子宫、腰肌16和肌肉骨骼肉瘤的诊断10。当前作者也用16-gauge核心一次性活检针(万能®针,MN1610;吟游诗人;抽样切口长度19毫米;22毫米)和一个插入套管(14号注射。导管),它允许多个通过单个皮肤穿刺活检。
Microbiopsy过程
图1⇓说明了microbiopsy过程的连续的步骤。与2毫升2%利多卡因(局部麻醉后利多卡因;图1一个⇓)和位置的活检针活检装置(图1 b⇓),皮肤被刺破的插入套管垂直于肌肉直到筋膜穿(图1 c⇓)。活检针后,然后通过套管插入删除的套管针(图1 d⇓)。肌肉样本获得的激活触发按钮,卸载了春天和激活针收集一块肌肉。活检针然后滑插入套管的而后者是维护,从而避免重复皮肤穿刺。肌肉标本(图1 e⇓)使用无菌手术刀从活检针中删除。样品随后放在纱布垫,迅速重(图1 f⇓),并立即在液态氮冷冻和储存在-80°C进行进一步分析。一些microbiopsy样本暴跌pre-cooled异戊烷为进一步横向cryosection和染色。整个活检过程重复3(第一阶段)6(阶段2和3)次为了获得足够的肌肉组织。权重的总和的3 - 6切片标本获得在整个microbiopsy过程定义术语“microbiopsy样品重量”。
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/25/3/431/F1.medium.gif)
Microbiopsy过程显示万能®活检系统(美国诗人,卡温顿,GA)设备,Microbiopsy的连续步骤,如下:a)区域的局部麻醉;b)放置的活检针活检装置;c)使用插入皮肤穿刺插管;d)活检针的插入;e)切除肌肉标本;和f)称量的样品。
Bergstrom针吸活组织检查
第二个活检microbiopsy后立即执行,根据Bergstrom描述的技术3,不需要进一步的麻醉。简单地说,一个1厘米的皮肤切口后microbiopsy穿刺部位,肌肉样本获得使用一个或两个经过Bergstrom针。这些都是立即在液态氮冷冻和储存在-80°C。
临床耐受性
每个切片过程后,受试者被要求评估相关的疼痛使用修改后的Borg清廉规模:0表示没有痛苦,10表示难以忍受的痛苦17。
肌肉分析
肌肉酶活性
肌肉活检标本没有知识的编码和分析临床资料。酶活性从∼5-10-mg样品(相同数量的肌肉microbiopsy和Bergstrom活检)测定25°C和表达μmol·g−1·敏−1湿重的肌肉。柠檬酸合成酶的活动(CS;酶的分类(EC) 4.1.3.7)和磷酸果糖激酶(PFK;EC 2.7.1.11)测量使用光谱光度测量的技术如前所述18,19。媒体用来测量酶活动的反应tris-HCl 150毫米(pH值8.0)包含5、5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic酸)0.16毫米,乙酰辅酶a和CS的草酰乙酸钠0.38毫米,1.235毫米,包含MgCl tris-HCl 50毫米(pH值8.2)2氯化钾250毫米,6毫米ATP 1毫米,AMP 0.17毫米,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简化型)0.17毫米,KCN 1毫米,fructose-6-phosphate 3毫米,glycerol-3-phosphate脱氢酶10 U,醛缩酶0.9 U和磷酸丙糖异构酶为PFK 9.6 U。每个试验都在重复执行和报告两个值的平均值。
骨骼肌肌球蛋白重链同种型表达式
样品制备的钠dodecylsulphate-poly-acrylamide凝胶电泳
肌肉活检样本(∼5 - 10毫克)看在冰用纸巾磨床,在缓冲溶液(蔗糖210毫米,消息灵通的30毫米,EGTA 2毫米,氯化钠40毫米和EDTA 5毫米,pH值7.4)包含1%的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ,奥克维尔,加拿大)。样本离心机,小球resuspended在第二个缓冲区包含氯化钾175毫米,EDTA 5毫米,三20毫米和特里同x - 100 0.5%, pH值6.8,溶解膜结合组件。剩下的球然后resuspended两次在第三缓冲含有氯化钾150毫米,EDTA 5毫米和三20毫米,pH值7.0。蛋白质浓度测定根据布拉德福德的方法20.。整除的肌原纤维溶解在钠dodecylsulphate gel-loading缓冲区和冻结在−80°C。
肌肉样本染色
是尝试确定纤维的数量microbiopsy标本,尽管这并不是当前的研究的主要目的。足够的组织可用的时候,一部分为进一步cryosection活检标本的保存。在这些情况下,肌肉样本从针与手术刀快速嵌入在最佳切削温度®(美国樱花Finetek托兰斯,CA),然后陷入pre-cooled异戊烷和存储在-80°C。横向cryosections在-20°C(10-μm厚)随后与苏木精和伊红染色或肌球蛋白atp酶。光学显微镜下观察的部分(200×放大),和整个表面被拍到与数码相机和重组。纤维的数量然后使用个人电脑统计。
结果
临床耐受性
很少或没有与microbiopsy相关疼痛,疼痛评分范围0 - 1,虽然范围4 - 6 Bergstrom活检。患者还被询问以下的问题:“如果另一个肌肉活检是必要的,哪一个(microbiopsy或Bergstrom活检)你会喜欢吗?“所有科目选择了microbiopsy。
Microbiopsy样品重量
均值±sdmicrobiopsy样品重量从15增加±3毫克为第一阶段27±9毫克(范围9-45毫克)和55±17毫克(范围32 - 90毫克)的第二和第三阶段,分别。总样本的权重Bergstrom活检是218±75毫克,145±64和217±89研究的三个阶段,分别。没有显著的慢性阻塞性肺病患者的体重指数之间的关系,这可能反映了肌肉萎缩,microbiopsy样本权重。
协议研究
为了执行这三个验证测量(CS, PFK MyoHC同种型表达式),30毫克的肌肉是必要的。如此大量的肌肉组织可以获得与microbiopsy过程中的11个17阶段2和3的主题。因此,由于组织数量减少剂量的过程,两者之间的协议活检程序可以在17日评估患者CS,但只在14和八个科目PFK和MyoHC同种型表达式,分别。
柠檬酸合成酶活动的协议
图2一个⇓显示两个活检技术的平均值没有统计学差异。图2 b⇓显示了这两种技术之间的个体差异对相应的平均值,绘制根据平淡和奥特曼的方法。平均差很低(-0.99μmol·分钟−1·g−1),协议的限制是紧,3.77 - -5.75μmol·分钟不等−1·g−1,这是接近重复结果。这个数字说明了这两个活检技术之间的协议。之间没有关系被发现慢性阻塞性肺病患者的BMI和CS的不同活动之间的两个活检技术。换句话说,一个低BMI并没有引起两种技术之间的差异。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/25/3/431/F2.medium.gif)
柠檬酸合成酶(CS)的活动microbiopsy和Bergstrom活检样本。意味着±)比较sdmicrobiopsy和Bergstrom活检样本之间的值。b)平淡和奥特曼CS活动获得的图形表示两种技术在第一次活检17个主题(- - - - -:意思是;- - - - - -:±1.96sd)。
协议磷酸果糖激酶活性
比较的PFK microbiopsy之间的酶活性和Bergstrom技术提供了图3⇓。没有显著区别两种技术(图3⇓)。图3 b⇓显示了这两种技术之间的个体差异策划针对相应的平均值。两种技术之间的平均差在第一次活检很小(-3.7μmol·分钟−1·g−1),但协议的范围宽(40.0 - -47.4μmol·分钟不等−1·g−1),表明适度的协议。再说一遍,没有发现关系之间的BMI, PFK活性的差异在COPD患者活检技术。
![图3 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/25/3/431/F3.medium.gif)
磷酸果糖激酶(PFK) microbiopsy活动和Bergstrom活检样本。意味着±)比较sdmicrobiopsy和Bergstrom活检样本之间的值。b)平淡和奥特曼的图示PFK活动获得的两种技术在第一次活检在14个科目(——:意思是;- - - - - -:±1.96sd)。
肌凝蛋白重链电泳
图4一⇓显示了不同的迁移率MyoHC类型的我,花絮和IIx microbiopsy和Bergstrom样本两个代表性的主题。这个数字也比较MyoHC表达式之间的两种技术。没有统计上的显著差异MyoHC类型的相关内容,活动花絮,IIx技术(图4 b⇓)。图4 c⇓显示了平淡和奥特曼图形表示不同MyoHC类型池时,0.02%的平均差和限制的协议的15.65 - -15.62%,可以认为是优秀的。
![图4 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/25/3/431/F4.medium.gif)
肌球蛋白重链(MyoHC)表达式。MyoHC类型的)不同的迁移率,花絮和IIx microbiopsy Bergstrom样本的两个代表性的主题。b)比较MyoHC类型的我、活动花絮和IIx microbiopsy之间的表达式(□)和Bergstrom技术(
)。c)平淡和奥特曼不同的图示MyoHC亚型获得两个活检技术(- - -:意思是;- - - - - -:±1.96sd)。
协议两个活检技术在重复
第二条测量CS, PFK MyoHC终于可以在10年内获得。四和四个科目,分别,两双活组织检查(两个microbiopsies和两个Bergstrom活检)。图5⇓说明了两者之间的协议活检技术在这些科目。可以看到,第二个切片数据同样分布在初始群体的平均差,在其协议的局限性。这表明microbiopsy提供类似级别的协议作为Bergstrom活检在同一主题反复活检时在另一个时间和条件。
讨论
目前的研究显示使用微创技术的可行性的股外侧肌活检COPD患者和健康志愿者。此外,当与Bergstrom活检技术相比,目前的黄金标准,提供优秀的协议CS和microbiopsy MyoHC组成。PFK,协议只是温和,也许是因为更大的可变性的表达这种酶在人类骨骼肌。两者之间的协议活检技术坚持当两个独立的每种类型的活检获得相同的主题。一些microbiopsy标本也有用的微观分析。因此,microbiopsy似乎是一个有效的技术来研究慢性阻塞性肺病患者的周围的肌肉。
骨骼肌活检技术和组织样本的质量
用经皮microbiopsy,目的是减少针大小来改善病人接受和宽容,同时确保足够的肌肉同时样本大小。这项技术通常用于评估COPD患者的股外侧肌或其它慢性病是Bergstrom半开的活检,通常与6毫米套管针,需要0.5 1厘米的皮肤切口。在这些患者手术活检也可行6,7,但比Bergstrom更多侵入性技术。这两种方法的优点为可靠的生化提供丰富的肌肉组织,组织化学和histomorphometric分析24,但其主要缺点是有限的病人接受和获取的难度连续切片在给定的主题。使用17-gauge针和一个不同的自动化设备比当前的作者,Vescovo等。13,14显示,可以确定MyoHC腓肠肌肌肉的组成在慢性心力衰竭患者microbiopsy过程。然而,他们的标本重量只有50 - 200μg,是酶活性或组织学研究太少。使用16-gauge针和万能®活检系统(诗人),肌肉标本充足的意思是总重量(从15毫克的开始研究55毫克年底)获得,同时确保病人舒适。虽然是一个学习的过程使用microbiopsy,肌肉组织的数量与一些经验可以很容易地增加到60 - 90毫克。这可能足以执行几个目的所需的生化和细胞分析慢性阻塞性肺病患者25和神经肌肉疾病患者12。此外,营养状况似乎并未microbiopsy技术的限制。
的一些部分microbiopsy标本光学显微镜下观察和质量好,中位数为144细胞数在一个部分。当前结果低于两次报告中使用类似的自动化设备。象牙海岸等。11每节报道纤维计数范围200 - 500,和独立等。12能够达到1000活检标本的肌肉纤维。然而,它应该被强调,在两个研究中,大针比从当前研究(14或15-gauge)使用。自一个精确的组织学诊断病人至关重要,这些作者使用立体显微镜,以确保良好的样本取向,并协助下一位有经验的病理学家。在当前的研究中,这些措施可能会改善microbiopsy部分的质量和增加细胞的数量统计。然而,我们可以看到在图6⇑,大幅改善逐渐获得组织质量的研究与当前作者获得的经验与技术。因此,目前的结果是令人鼓舞的。既然microbiopsy技术的可行性和有效性已确认,进一步的工作需要建立microbiopsy细胞学方法的实用性,histomorphometric和免疫染色分析。然而,其他研究人员报道有趣的数据各种蜂窝技术的适用性在小活检样本12。因此,当前的作者的方法也可能是有用的为其他生物技术。
临床耐受性
microbiopsy非常良好的耐受性,因为主题报道很少或没有痛苦(远低于Bergstrom活检),所有说他们肯定会喜欢microbiopsy在未来。随着microbiopsy立即紧随其后Bergstrom活检,晚发不适的时间进程由于microbiopsy无法评估。单独使用14号针98年成人涉嫌神经肌肉疾病,象牙海岸等。11奇怪的疼痛综合征的一个案例报道,持续了几个星期。类似的针头,独立等。12公布一些病人冲的感觉持续4天。
在最近的研究中,一个或两个是用Bergstrom针,这是目前作者的惯例和足以获得足够的组织。microbiopsy,原来的程序开发,没有早些时候细针活检研究中使用10- - - - - -12。的主要修改是使用一个插入套管(14号注射。导管)获得一些通过单个皮肤穿刺活检样本,因而无需多刺。microbiopsy针时滑出套管,后者是维护在的地方没有任何疼痛或不适的科目。该系统避免了重复皮肤穿刺当几个抽样是必须的,因为它很容易直接引入microbiopsy针活检网站没有接触切口或肌肉筋膜。这是与Bergstrom方法相比,对整个针需要删除,然后重新通过皮肤切口,另一个样品是必要的,这一过程通常被认为是造成不舒服的感觉。这两种方法的另一个区别在于Bergstrom活检的需要创建吸入为了捕获和减少肌肉样本4。这通常是最痛苦的一部分Bergstrom技术。相比之下,microbiopsy技术不需要吸入,因此,即使六树苗,主题通常是完全放松的。在目前的研究中,受试者的一致选择microbiopsy技术进一步活检离开毫无疑问,这种技术的更大的安慰。
血肿是最常报道的并发症后肌肉活检,但仍然是罕见的。独立等。12只观察到两个血肿220细针活检比在当前的研究中使用一个更大的尺寸,没有后遗症。通过避免microbiopsies患者抗凝或血液discrasia microbiopsy并发症的风险可以减少更多。总之,microbiopsy可以被认为是一个非常安全的程序。
microbiopsy过程的另一个优点是,它可以执行没有皮肤切口,从而促进病人接受的过程,尤其是当重复活检是必要的。因此,microbiopsy技术报告都对自己有利伦理和化妆品的论据。
生物比较microbiopsy Bergstrom技术
CS的酶的活动和确定PFK∼5-10-mg microbiopsy和Bergstrom活检样本,与优秀的协议的重复测量酶(数据未显示),与以前的报告突显出高水平的再现性的重复化验来自同一个匀浆24。
优秀的协议被发现之间的两个活检技术对CS活动和MyoHC成分,但只对PFK温和的协议。在一起,目前的结果是按照Simoneau等。24没有发现明显的变化在fibre-type分布或平均活动的几个酶从两个独立的在同一股外侧肌活检获得正常的话题,当左右两边比较在相同的主题。然而,在目前的研究中,观察到Simoneau等。24发现intra-subject类型或酶活性变化,尤其是PFK活动,相关系数的范围从0.71 0.63比较相同的肌肉比较双方的。这种可变性的PFK归因于可能肌肉取样的深度的差异,从生化的变化结果可能存在于肌肉样本1厘米24。在这项研究中,当前作者试图执行microbiopsy和Bergstrom活检在同一网站,但是很有可能,这两个样本来自不同的肌肉。变化也可能是由于匀浆的组成上的差异,在肌肉或nonmuscle组织方面,或不同的实验室技术程序24。在这方面,被小心地最小化技术错误通过测量肌肉酶活性的两个活检样本同时每个主题。可能一些microbiopsy或Bergstrom活检标本中含有少量的脂肪组织(可能从皮下组织),这可能表示PFK大于CS活动,不能排除在外。
目前的研究表明,这两者之间的协议中坚持学科活检技术谁得到了每种类型的两个活检,尽管实验条件是不同的。自从两对活检没有在相同的条件下,获得的可重复性microbiopsy不能直接评估。先前的研究显示15 - 25%的酶活性的变化重复Bergstrom股外侧肌活检24,它是不可能的可重复性microbiopsy会更好。然而,当前观测主张一个重复性的microbiopsy当然可比与Bergstrom技术,不仅随着时间的推移,而且在不同的实验条件。在这方面,使用microbiopsies可以设想的评估与信心,例如,一些干预措施后,生物的影响值假设不同,如肺康复9。
视角的microbiopsy
在研究的开始,现在作者旨在调和两种不同要求骨骼肌功能障碍的临床研究慢性阻塞性肺病患者。第一个必然要求是肌肉活检,因为在细胞水平上研究是至关重要的9,26- - - - - -28。第二个要求,然而,是追求研究的目标尽可能早在这些病人29日,这迫使当前作者寻找一个可以接受的替代Bergstrom技术。相信本研究提出了一种有前途的工具,可靠和无创评估COPD患者的骨骼肌。然而,当前的潜在应用作者的技术可能是更广泛的比他们最初的目标。它现在应该容易重复microbiopsies在同一主题没有不适,为了研究,例如,反应随着时间的推移,各种代谢途径的治疗干预。技术需要有限的设备,很容易学习,和并发症率低,microbiopsy可以用于更大范围的门诊病人。这将促进多中心研究与大量的病人可以在肌肉评估水平。另一个优势是,其他几个外围肌肉可以用这种技术检查12,所以几个网站在同一病人可能是采样以最小的不适。最后,这种技术也可能感兴趣的许多慢性疾病或生理研究正常人。
总之,这项研究显示了一种微创技术的可行性和有效性的股外侧肌活检:microbiopsy。与当前的黄金标准相比,Bergstrom技术,microbiopsy提供优秀的结果对于柠檬酸合成酶活性和肌凝蛋白重链组成的分布。众多的应用这种技术可以设想,特别是在周边肌肉功能障碍的调查和它的底层机制,不仅在慢性阻塞性肺疾病患者中,而且在许多其他慢性病患者。
确认
作者感谢m . Belanger m j。布列塔尼人,b . Jean为他们的热情帮助,j]。Meullenet协作。
- 收到了2004年5月5日。
- 接受2004年11月8日。
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