摘要
吸烟者患慢性阻塞性肺病(COPD)的倾向存在异质性,对COPD发病机制的有限理解阻碍了治疗策略的改进,尤其是与吸烟的影响不同本身.虽然细胞凋亡对组织稳态至关重要,但细胞凋亡的增加可能导致组织损伤和炎症。
本研究探讨了COPD患者气道t淋巴细胞和气道上皮细胞(AEC)凋亡的可能性是否增加,以及这是否与吸烟有关。
流式细胞术检测了COPD前吸烟者、持续吸烟者和非吸烟对照组的支气管套管和支气管肺泡灌洗细胞的凋亡(7-氨基放线菌素D、膜联蛋白、单链DNA和caspase)、Bcl-2、Bax和p53。
COPD患者AEC凋亡平均增加87%,t淋巴细胞凋亡平均增加103%。目前吸烟者和戒烟者COPD AEC细胞凋亡差异无统计学意义。
细胞凋亡可能参与慢性阻塞性肺疾病的发病机制,戒烟后细胞凋亡持续过量可能为治疗干预提供新的靶点。戒烟后细胞凋亡的持续增加是由于多年的有害损伤后肺髓的变化,还是一些人具有细胞凋亡增加的自然倾向和可能发展为慢性阻塞性肺疾病,仍有待确定。
慢性阻塞性肺病(COPD)是由肺部毒性损伤引起的,最常见的原因是吸烟。药理疗法对慢性阻塞性肺病患者长期前景的总体影响充其量是适度的,需要基于对潜在致病机制的更深入了解而采取新的治疗方案。
改进治疗方法的关键在于更好地了解COPD的发病机制,特别是将其与吸烟的影响区别开来本身.解决戒烟后残留的持续异常的疗法将大有裨益。在这方面,细胞凋亡障碍(程序性细胞死亡)越来越被认为在疾病发病机制中具有重要作用。在包括肺气肿在内的几种情况下,与组织损伤相关的凋亡过程紊乱已被发现1- - - - - -3.,肺纤维化4,5囊性纤维化6还有闭塞性细支气管炎7.有限的研究表明COPD中淋巴细胞和内皮细胞凋亡增加1- - - - - -3.,8,提出了不受调控的细胞凋亡可能在该病的发病机制中发挥作用的可能性,但气道上皮细胞凋亡尚未得到系统的研究。
虽然细胞凋亡对于消除过度活化的炎症细胞很重要,但这些细胞和/或气道上皮细胞的过度凋亡可能会产生反效果,导致宿主防御能力减弱。目前的作者先前发现,与健康受试者的细胞相比,COPD患者的外周血t细胞发生凋亡的倾向增加9.因此,作者试图确定这些外周异常是否可能反映在来自肺部的t细胞中,后者的病理意义可能更大。此外,未清除的凋亡细胞可能发生继发性坏死,损伤细胞内容物排出,组织损伤和慢性炎症10.目前的作者先前已经表明,COPD受试者的肺巨噬细胞在吞噬凋亡的气道上皮细胞的能力方面存在缺陷体外化验11,这可能使COPD患者容易在气道中积累凋亡物质12.
据目前作者所知,还没有从支气管肺泡灌洗(BAL)和支气管刷刷获得的异质细胞群中分离细胞类型的凋亡研究,特别是关于吸烟状态的可能影响。在目前的研究中,评估了特征明确的COPD受试者(包括戒烟者和持续吸烟者)和不吸烟的正常对照组中的细胞凋亡。
材料与方法
免疫试剂
使用了以下单克隆抗体(单克隆抗体)和试剂:CD45(PE- cy5), CD3(PE- cy5) (Immunotech/Coulter,马赛,法国),CD3(PE), p53(PE) (BD Biosciences, CA,美国),Bcl-2(FITC) (Dako, Glostrup,丹麦),Bax(未结合)(Oncogene Science, NY,美国),兔抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G (RAM, PE;BD Biosciences), IgG1(PE)(作为阴性对照;BD Biosciences), Annexin V(FITC) (BD Biosciences), 7-氨基放线菌素D (7-AAD) (Sigma, Sydney, Australia), CaspACE FITC- vad - fmk (Promega, WI, USA),单链DNA (ssDNA)非偶联抗体(MAB3299 (F7-26);Chemicon, CA, USA)和山羊抗小鼠IgM(FITC) (Rockland, PA, USA)。
人口问题
为了诊断目的而接受纤维支气管镜检查的COPD患者(主要是因为胸片上的病变疑似癌)被邀请参加研究,并获得了完全知情的同意。参与研究前6周无COPD加重。获得澳大利亚阿德莱德皇家阿德莱德医院的伦理批准。中度慢性阻塞性肺病的诊断是根据全球慢性阻塞性肺病倡议的标准确定的13有关病史和支气管扩张剂后一秒用力呼气量(FEV)1)预测和FEV的30-80%1/用力肺活量<70%。
收集29例COPD患者(刷牙组)的支气管刷片(表1)⇓).16例为前吸烟者(> ~ 1年戒烟),13例为目前吸烟者。
BAL收集自20例COPD患者(BAL组)(由于不适合或无法获得偶尔的BAL或支气管刷牙标本,该组与刷牙组之间有重叠)(表1)⇑).共有13例患者是前吸烟者(>1年戒烟)和7例目前吸烟者。
样本也从20名不吸烟的志愿者(表1⇑).这些对照组中,总共有10人健康,招募的志愿者没有呼吸道疾病史,10人因其他临床指征原因正在接受支气管镜检查。通常,这些患者患有慢性咳嗽,这被证明与胃食管反流或鼻窦疾病有关,或有轻微的可能咯血,但没有发现肺部原因。这些受试者使研究的力量得以提高,并达到了正常对照的标准(肺功能正常,无任何肺部疾病的证据,无哮喘或过敏史,不吸烟,支气管镜检查正常)。大多数对照组都包括在BAL和刷牙研究中,除了少数受试者由于技术原因BAL或刷子都不够用。重要的是,在本研究中调查的任何参数,这两组对照组之间没有显著差异。该研究的第一阶段研究了刷刷衍生的上皮细胞和bal衍生的t细胞中的凋亡。在这一阶段的研究中,两个对照组被合并为一个对照组。
支气管镜检查过程
如前所述进行纤维支气管镜检查11.在左侧气道取样时,除非该区域有其他病理,否则从右侧气道获得刷片和BAL。特别注意在气道中使用最小量的木素卡因(100毫克),考虑到它对细胞活力的不利影响14.
的制备体外样品
按照前面描述的方法制备细胞11,15重新暂停到4×10的细胞计数5细胞·毫升−1与RPMI 1640媒体。1 h内观察气道t细胞和上皮细胞凋亡情况。为了通过BAL来源的t细胞研究Bcl-2、Bax和p53,如先前报道的那样,BAL样本被植物血凝素刺激18小时9.
测定BAL中乳酸脱氢酶水平
当一个组织的细胞受损或坏死时,其内容物泄漏到细胞外液中。因此,可以通过BAL中乳酸脱氢酶(LDH)的存在推断气道中存在继发性坏死。使用Beckman Synchron CX测量了10名志愿者对照组和10名COPD受试者(5名吸烟者,5名戒烟者)BAL中的乳酸脱氢酶水平R系统(Beckman Instruments Brea, CA, USA),按照试剂盒提供的说明进行。
细胞类型鉴定
如前所述,使用流式细胞仪进行表面染色以识别细胞类型16,17如图1所示⇓和2⇓.白细胞被CD45明亮染色排除在气道上皮细胞分析中(图1b⇓).基于已知的CD3 PC5染色特征对t细胞进行门控与侧散射(图2b⇓).由于7-AAD和PC5都在荧光通道3 (FL3)中荧光,CD3 PE (FL2)与7-AAD染色前采用侧散射法对t细胞进行鉴定。
流式细胞术对气道上皮细胞的门控策略。a)根据前向散射(FSC)和侧向散射特征,从区域(R)1中剔除红细胞和碎片。所有后续的分析都是在这个区域的细胞上进行的。b)用CD45亮染色鉴定的污染白细胞,并在R2中排除气道上皮细胞。所有后续分析都在R1和R2的细胞上进行。c和d)凋亡刷刷源性气道上皮细胞的7-AAD染色。显示FSC的代表性点图与7-AAD染色区分存活的(7-AAD阴性染色)和凋亡的(7-AAD亮染色)上皮细胞。对照组:14%凋亡(c);慢性阻塞性肺疾病受试者:32%凋亡(d)。
细支气管灌洗液来源t细胞的流式细胞术门控策略。a)根据前向散射(FSC)和侧向散射特征,从区域(R)1中剔除红细胞和碎片。所有后续分析都是在该区域的细胞上进行的。b)基于CD3亮染色和低侧散射,在R2中选择t细胞。所有后续分析都在R1和R2的细胞上进行。(CD45 PE也用于确认浇注(数据未显示))。c和d)凋亡刷刷源性气道上皮细胞的7-AAD染色。显示FSC的代表性点图与7-AAD染色区分存活的(7-AAD阴性染色)和凋亡的(7-AAD亮染色)上皮细胞。对照组:5%凋亡细胞(c);慢性阻塞性肺疾病受试者:18%细胞凋亡(d)。
bal源性白细胞和刷刷源性气道上皮细胞的凋亡
7-AAD染色
如前所述,用7-AAD染色定量细胞凋亡18.计算7-AAD阳性细胞的绝对数量,然后根据COPD组和对照组淋巴细胞或气道上皮细胞数量的差异进行调整。
用单克隆抗体对ssDNA染色凋亡细胞
为了研究在支气管镜检查过程中,从基底膜移除气道上皮细胞导致膜损伤的可能性,建立不依赖于细胞膜变化的替代方法来评估细胞凋亡是很重要的。抗体MAB3299与ssDNA特异性反应(即.不识别双链构象的DNA)。按照制造商的说明进行染色。
凋亡细胞中活性半胱天冬酶的染色
caspases的序列激活在诱导细胞凋亡中起着关键作用。CaspACE FITC-VAD-FMK是细胞渗透性caspase抑制剂VAD-FMK的fitc偶联物。这种结构允许抑制剂进入细胞,在那里它与caspase结合,作为细胞凋亡的标志。用100 μL、10 μM CaspACE FITC-VAD-FMK染色细胞,再用表面标记物染色,进行细胞类型鉴定。
糖皮质激素对气道来源t细胞和上皮细胞凋亡的影响
糖皮质激素(GCS)可诱导气道上皮细胞和t细胞凋亡19,20..为了初步研究这种可能性,根据GCS或支气管扩张剂治疗对肺功能相似的COPD患者进行分组(刷牙组:13名GCS治疗组和16名仅使用支气管扩张剂药物组;BAL组:11例gcs治疗,9例仅使用支气管扩张剂)。细胞凋亡评估如上所述,并比较两组的结果。然而,受试者在使用的吸入类固醇的类型和剂量方面是不同的,而且不能保证他们对药物的依从性。因此,GCS对COPD细胞凋亡影响的更明确分析有待进一步研究。
年龄对气道源性t细胞和上皮细胞凋亡的影响
有一些关于外周血t细胞凋亡随着年龄增长而增加的报道21.为了研究这种可能性,对照组被分为两个年龄组,年龄<50岁和年龄55-70岁。按上述方法计算细胞凋亡,并对两组结果进行比较。
吸烟对气道源性t细胞和上皮细胞凋亡的影响
肺功能相似的COPD患者根据吸烟状况进行分组(图1)⇑),气道上皮细胞和t细胞凋亡情况如上文所述,并比较两组结果。
Bax, Bcl-2和p53在COPD气道来源t细胞和上皮细胞中的表达
如上所述进行细胞类型鉴定的染色。Bax、Bcl-2和p53采用直接流式细胞染色技术进行染色。1×10的等分6用无钙、无镁PBS和200 μL膜透液(0.5% Triton X-100 (Sigma), 0.2 μg·mL)清洗细胞−1Na2EDTA, 2H2O (APS Chemicals, NSW, Australia), 1% BSA in PBS)加入细胞颗粒15分钟。分别用单克隆抗体对Bax (5 μL)、Bcl-2 (10 μL)和p53 (5 μL)进行染色。阴性对照采用相同同型的不相关抗体。对于Bcl-2和p53,立即用流式细胞仪对未清洗、未固定的细胞进行分析。对于Bax,进一步用5 μL pe偶联大鼠-抗小鼠单抗对细胞进行染色,用流式细胞仪清洗和分析(图1)⇑).
统计分析
数据分析采用Mann-Whitney u检验。p值<0.05为显著。
结果
bal源性白细胞和刷刷源性气道上皮细胞的凋亡
正如之前报道的外周血t细胞和中性粒细胞9,18Annexin V染色与7-AAD染色检测刷刷源性上皮细胞凋亡具有良好的相关性(R2= 0.8)。
典型的正向散射模式与7-AAD如图1所示⇑典型直方图如图3所示⇓.COPD患者的气道上皮细胞凋亡百分比明显高于对照组(表2)⇓).在所有技术中,细胞凋亡的平均增加为87%(计算为(copd对照)/对照)。与百分比变化分析的结果一致,COPD患者气道上皮细胞凋亡的绝对数量显著增加(对照:0.06×109·L−1与慢性阻塞性肺病:0.10×109·L−1;p = 0.03)。
不同技术对气道刷刷源性上皮细胞凋亡的测定。具有代表性的直方图显示:a)细胞膜磷脂酰丝氨酸Annexin V染色(20.0%凋亡);b)无功能膜泵作用导致7-AAD染色(22.3%凋亡);c)早期凋亡中核内单株DNA染色(27.3%凋亡);d)凋亡早期细胞内caspase活化染色(37.6%凋亡)。
上皮细胞从基底膜的破坏已被报道诱导凋亡22.此外,据报道,局部麻醉剂木素卡因会降低上皮细胞的活力,在体外14.膜联蛋白V和7-AAD染色依赖于细胞膜的变化,但认为由于技术问题引起的任何混杂因素都会同样影响COPD组和对照组。然而,为了调查在支气管镜检查过程中细胞移除或使用木素卡因(最小剂量,100 mg)是否会导致人工膜损伤,进一步应用技术特异性检测细胞凋亡,基于不涉及细胞膜的变化(ssDNA和caspase)(图3)⇑).这些结果再次证实了COPD细胞凋亡率较高。
与COPD患者外周血来源t细胞的结果一致9, bal来源的t细胞凋亡增加,使用的技术平均增加103%(表2)⇑).在COPD患者中,凋亡t细胞的绝对数量(经总淋巴细胞数量调整)显著增加(对照:0.003×109·L−1与慢性阻塞性肺病:0.02×109·L−1;p = 0.01)。
年龄对气道源性t细胞和上皮细胞凋亡的影响
随着年龄的增长,气道上皮细胞或bal来源的t细胞凋亡无明显变化(上皮细胞:对照组年龄<50岁,7-AAD为20.0±11.6%(平均±11.6%)sd)与对照组55 ~ 75岁,20.0±14.6%;t细胞:对照组年龄<50岁,7-AAD 19.9±11.6%与对照组55 ~ 75岁17.2±12.6%)。膜联蛋白V染色支持这些结果(数据未显示)。
吸烟对气道源性t细胞和上皮细胞凋亡的影响
吸烟和不吸烟COPD患者气道上皮细胞或bal来源的t细胞凋亡无显著差异(图4)⇓).
![图4 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/25/3/447/F4.medium.gif)
通过7-AAD染色和流式细胞术检测a)支气管肺泡灌洗液来源的t细胞和b)刷刷来源的气道上皮细胞在对照组、慢性阻塞性肺疾病(COPD)受试者(总组)以及吸烟者和戒烟者COPD中的凋亡情况。*: COPD组与对照组差异有统计学意义p≤0.05;#:吸烟者与戒烟者COPD差异无统计学意义。
Bax, Bcl-2和p53在COPD气道来源t细胞和上皮细胞中的表达
流式细胞仪检测Bax、Bcl-2、p53的表达。与对照组相比,COPD患者气道上皮细胞或t细胞表达Bcl-2或Bax的百分比无明显变化(表3)⇓).同样,染色的中位荧光强度没有显著差异(数据未显示)。与对照组相比,COPD患者bal来源的CD3+ t细胞和刷刷来源的气道上皮细胞中P53的表达显著增加(表3)⇓).
COPD患者BAL中LDH水平
为了确定气道来源细胞的继发性坏死是否明显,我们测量了10名正常志愿者和10名COPD患者(5名吸烟者和5名戒烟者)BAL中的乳酸脱氢酶水平。COPD患者BAL中LDH水平明显高于对照组(1.9±2.9 IU·L)−1与0.1±0.3 IU·L−1;p = 0.040)。
讨论
COPD患者bal源性淋巴细胞和刷刷源性气道上皮细胞凋亡明显增加。COPD患者气道上皮细胞凋亡不受年龄增长或吸烟状况的影响。通过使用一些独立的细胞凋亡检测方法,目前的作者确信,细胞凋亡的所有阶段都被检测到,并且结果不会因包含坏死细胞而混淆。据目前作者所知,从COPD患者肺部获得的异质细胞群的离散白细胞亚群中,细胞凋亡此前尚未被量化。然而,一些研究报道了COPD患者支气管活检中肺泡或支气管上皮细胞和淋巴细胞凋亡增加3.,8,23.重要的是,这些研究表明,细胞凋亡可能至少部分解释肺气肿中肺泡壁结构的丧失和大泡的形成。
COPD的肺损伤包括近端和远端气道以及肺泡。BAL是一种有用的技术,它对最远端气道和肺泡的炎症环境进行采样,因此比小活检提供更广泛区域的理想细胞样本。除了BAL外,还从直径为2-4毫米的气道中获得支气管刷。在这两种情况下,当前研究中使用的流式细胞术技术的高灵敏度允许从存在的几个细胞亚群中获取有意义的数据,即使存在任何一种特定细胞类型的高优势(如。BAL中的巨噬细胞)。虽然涉及到整个气道树,但这些气道在很大程度上导致了气流阻塞,这是COPD的生理特征。
吸烟已被证明可诱导气道上皮细胞凋亡20..然而,在本研究中,戒烟并不能阻止COPD细胞凋亡率的增加。这可能反映了COPD在戒烟后仍存在持续的异常,而不是吸烟的影响本身.一些研究表明,COPD患者的气道黏膜炎症即使在戒烟后也会持续存在24- - - - - -27.此外,戒烟对肺泡破坏、肺气肿增大、渗透系数和肺动脉压没有影响28,29.结合目前作者的研究结果,这些数据表明,随着戒烟,肺功能的自然衰退趋于正常化30.,31可能不能准确反映COPD气道中持续紊乱的细胞凋亡和炎症。
尽管停止吸烟,但细胞凋亡仍在增加,这表明一旦确定了COPD疾病,除吸烟外的其他因素肯定起了作用。在这方面,与COPD慢性炎症反应持续相关的因素也可能导致气道细胞凋亡的增加。这些包括由于中性粒细胞、细胞毒性t细胞数量增加而增加的氧化应激和蛋白水解酶的释放,Fas、肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β途径的激活,以及细菌在气道定植的炎症反应4,12,20.,32.有报道称GCS可诱导气道上皮细胞凋亡在体外19,20..然而,在本研究的限制下,吸入性GCS治疗的COPD受试者组未观察到额外的上皮细胞凋亡,尽管GCS组中bal来源的T细胞凋亡有升高的趋势。为了充分研究GCS与细胞凋亡之间的关系,需要对更多患者进行进一步的研究,以确定类固醇制剂和剂量。
正常情况下,凋亡后是凋亡细胞的快速吞噬。目前的作者先前报道,COPD受试者的肺泡巨噬细胞缺乏吞噬凋亡的气道上皮细胞的能力11.目前的研究显示,气道上皮细胞凋亡率增加。这可能会超过肺泡巨噬细胞的吞噬能力,导致凋亡细胞的清除缺陷和堆积,导致继发性坏死,释放毒性细胞内容物,组织损伤和慢性炎症12,导致COPD病理过程的进展。BAL中乳酸脱氢酶水平升高证实COPD气道中存在继发性坏死。这种增加是显著的,甚至可能低估了继发性坏死的总量,因为一些坏死细胞可能在LDH完全释放到腔内之前就被吞噬了。
细胞凋亡伴随着各种死亡途径的激活,包括线粒体介导的途径。该途径受促凋亡蛋白Bcl家族的调控(如.p53, Bax),以及一些蛋白质(如.Bcl2)可以抑制细胞凋亡33- - - - - -35.为了进一步研究COPD细胞凋亡增加的原因,作者研究了Bcl、Bax、p53和caspases在气道来源的t细胞和上皮细胞中的表达。先前的研究表明,Western blot(金标准)与流式细胞术检测这些凋亡相关蛋白具有良好的相关性36.使用流式细胞仪是因为其独特的能力,以确定特定的细胞类型表达这些蛋白质。在外周血中,目前的作者先前已经观察到来自gcs治疗的COPD患者的t细胞Bcl-2表达显著降低(未发表的数据)。因此,本研究中气道来源的t细胞在Bcl-2或Bax的表达上没有任何显著差异是令人惊讶的。然而,气道来源的t细胞和上皮细胞p53和caspases表达增加的发现在COPD中具有重要意义。氧化应激可诱导p53调控的细胞凋亡37,38.据报道,COPD中氧化应激增加39并可能因此导致p53的增加,进而导致凋亡的增加。与COPD患者的这些发现一致,在弥漫性肺泡损伤中,p53表达增加与II型肺细胞凋亡有关40在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的支气管和肺泡上皮细胞中,以及在人类的间质性肺炎和特发性肺纤维化中41- - - - - -43.进一步的研究以确定BAL中细胞凋亡诱导因子的水平将有助于进一步描述所涉及的机制。
总之,气道源性上皮细胞凋亡增加与caspase活性和p53表达上调相关,提示凋亡可能在慢性炎症和修复缺陷过程中发挥重要作用,而慢性阻塞性肺疾病的发病机制是这些过程的标志。t细胞凋亡的增加可能导致对感染生物的免疫反应减弱,并导致与慢性阻塞性肺疾病相关的感染频率增加。重要的是,即使在戒烟后,细胞凋亡的增加似乎仍在持续。这种持续的异常是否源于多年的有害损伤后肺环境的表型变化,或者是否存在一个亚组人群具有自然倾向于增加细胞凋亡,从而发展为慢性阻塞性肺疾病,仍有待确定。无论如何,这种持续异常的存在可能为旨在减少细胞凋亡的新治疗方法提供基础。
致谢
作者感谢皇家阿德莱德医院胸科支气管镜检查部门的宝贵贡献。
- 收到了2004年6月28日。
- 接受二零零四年十一月五日。
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