抽象的GydF4y2Ba
肺泡巨噬细胞(AM)积极参与炎症反应,表征慢性阻塞性肺病(COPD)。本研究研究了COPD患者AM表型的潜在变化。GydF4y2Ba
使用流式细胞术,涉及吞噬作用的受体的表面表达(CD44,CD36,CD51,CD61,CD14),抗原呈递能力(人白细胞抗原(HLA)-DR),共刺激分子(CD80,CD86,CD40)和补体来自18名COPD,14名吸烟者的患者评估了受体3型,具有正常的肺功能和九个不吸烟者。GydF4y2Ba
与肺功能正常的吸烟者和不吸烟者相比,慢性阻塞性肺病患者AM中HLA-DR和CD80的表面表达较低。此外,这些患者有较高比例的AM与低水平的CD44表面表达。在AM中研究的其他受体在三组之间似乎没有任何差异。所有这些受体在外周血单核细胞中的表达在组间也没有差异。GydF4y2Ba
总之,这些观察结果表明,肺泡巨噬细胞的细胞介导的免疫功能可以减少慢性阻塞性肺部疾病,这是本地而不是系统性事件。GydF4y2Ba
吸烟是慢性阻塞性肺病(COPD)的主要危险因素。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.然而,出于尚未完全理解的原因,只有百分比的吸烟者发展COPD。鉴于对吸烟的异常炎症反应是COPD的标志GydF4y2Ba1GydF4y2Ba,控制启动和/或解决这种炎症反应的机制的差异可以解释易受一些吸烟者展出的易感性的易感性GydF4y2Ba2GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
肺泡巨噬细胞(AM)在低级人呼吸道中的炎症反应的起始和分辨中发挥关键作用GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba.我有能力改变它们的表面表型GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba响应于肺实质的外源刺激和/或病理过程的功能性质GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba.一些与宿主防御和炎症相关的表面受体作为巨噬细胞功能激活的良好标记物,可被多种肺部疾病(包括结节病)中出现的不同炎症信号修饰GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,肺纤维化GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba,过敏性气道炎症GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba,以及肺结核GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba.这些受体的实例是涉及吞噬症(CD44,CD36,CD51,CD61,CD14),抗原呈递能力(人白细胞抗原(HLA)-DR)或几种共刺激分子(CD80,CD86,CD40)或补体受体的那些类型3(CD11b)。GydF4y2Ba
越来越多的证据表明AM与COPD的炎症反应有关GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba.在COPD患者中,AM释放更多的基质金属蛋白酶-9GydF4y2Ba13GydF4y2Ba和白细胞介素-8GydF4y2Ba14GydF4y2Ba,较少的金属蛋白酶抑制剂-1GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba和转化生长因子-β1GydF4y2Ba15GydF4y2Ba比健康的吸烟者,并且还具有有限的吞噬细胞凋亡细胞能力GydF4y2Ba16GydF4y2Ba.然而,迄今为止,虽然先前的几项研究研究了烟草吸烟对AM表面表型的影响,但迄今为止尚未表现出来的表面表型。GydF4y2Ba17GydF4y2Ba-GydF4y2Ba24GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
为了更好地了解慢性阻塞性肺疾病的炎症反应,本研究试图比较慢性阻塞性肺疾病患者、肺功能正常吸烟者和非吸烟者细胞表面受体AM的表达模式。外周血单核细胞(PBM)是AM的循环前体GydF4y2Ba25GydF4y2Ba.为了确定在全身循环中还可以确定AM表型的潜在差异,研究了同一个体中PBM的表面受体表达模式。这可能有助于将源自局部肺部微环境的变化(预期诱导AM的表型差异)分离,从可能潜在地反映不同的遗传背景(预期在AM和PBM中诱导表型方差)。GydF4y2Ba
方法GydF4y2Ba
主题和道德GydF4y2Ba
总共从西班牙帕尔马大学Son Dureta医院门诊招募了以下患者:18名COPD患者(7名目前吸烟者,11名前吸烟者),按全球慢性阻塞性肺疾病研究所(GOLD)标准(1秒用力呼气量(FEV))定义GydF4y2Ba1GydF4y2Ba) < 70%预测)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba;14名吸烟者(7名目前吸烟者,7名已戒烟者),无慢性支气管炎或呼吸困难,肺功能正常GydF4y2Ba1GydF4y2Ba> 80%pred)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba;和9名不吸烟者。所有病例都需要支气管镜检查单独的肺结节或咯血。所有受试者均无任何重大疾病,包括哮喘、急性呼吸道感染、支气管扩张、间质性肺病和心、肝或肾衰竭。所有COPD患者临床稳定,纳入研究前3个月以上未发生任何加重。所有患者均接受吸入性支气管扩张剂治疗。4名患者接受吸入类固醇治疗,但没有人接受口服类固醇。吸烟者和不吸烟者都不服药。目前和已戒烟者有>20包年的吸烟史。肺功能正常的戒烟者3个月前停止吸烟>。 Current smokers refrained from smoking for 12 h before bronchoscopy. All participants signed an informed consent. The ethics committee of Hospital Universitari Son Dureta (Palma de Mallorca, Spain) approved the study protocol.
支气管镜检查GydF4y2Ba
根据标准技术进行纤维电光支气管镜和支气管肺泡灌洗(BAL)GydF4y2Ba26GydF4y2Ba.为了研究气道定植的存在,这可能会影响研究结果,使用受保护的样品刷获得支气管分泌物GydF4y2Ba27GydF4y2Ba并被发现在所有情况下都是文化。同样,为了避免急性吸烟的潜在效果,在支气管镜检查之前,目前的吸烟者不会吸烟12小时。在所有情况下,通过呼出的CO浓度<10 ppb确认。GydF4y2Ba
细胞悬液的制备GydF4y2Ba
在收集1小时内在无菌条件下处理BAL样品,并在4℃下保持直至分析。通过离心从BAL流体回收细胞(400×GydF4y2BaGGydF4y2Ba4℃,静置10min),悬浮于1×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba细胞·ml.GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,2毫米GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-Glutamine,25 u·mlGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba青霉素和25μg·mlGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba链霉素。通过光学显微镜检查在血吞来确定总细胞计数。由台盼蓝排除确定的细胞活力总是> 96%。通过在细胞加压液(Cytospin 2; Shandon Southern Prod.,Ltd,Runcorn,UK)上计算500个细胞来进行差异细胞计数(Cytospin 2; Shandon Southern Prod。,UK)用Haemolor(Merck Kgaa,Darmstadt,德国)。GydF4y2Ba
通过穿刺外周静脉获得血液样本。采用Ficoll-Hypaque梯度离心(Pharmacia, Upsala, Sweden)分离外周血单个核细胞,洗涤两次,以1×10的浓度悬浮GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba细胞·ml.GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,2毫米GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-Glutamine,25 u·mlGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba青霉素和25μg·mlGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba链霉素。GydF4y2Ba
免疫荧光标记和流式细胞分析GydF4y2Ba
在采样后1小时内按照相同的方法标记AM和外周血单个核细胞。细胞悬液(1×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba细胞·毫升GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba),将100μl与10μl的每个FITC / PE标记的单克隆抗体混合,针对所研究的不同表面受体(Immunotech,Marseille,法国)。这些包括那些涉及吞噬作用的人(CD44:克隆J.173; CD36:Clone Fa6.152; CD51:CD51:CD61:Clone SZ21; CD14:克隆RM052),抗原呈递能力(HLA-DR:克隆IMMU-357),几个共刺激分子(CD80:克隆mAb 104; CD86:HA5.2B7; CD40:克隆MAB89)和补体受体3(CD11b:克隆BEAR 1)。另外,用CD44和HLA-DR重叠一类100μl等份的AM悬浮液,用于进一步鉴定表达CD44的高或低表面水平的亚次蛋白酶(CD44高GydF4y2Ba+GydF4y2Ba和CD44低GydF4y2Ba+GydF4y2Ba分别)。用HLA-DR门控法检测AM表面CD44的表达GydF4y2Ba+GydF4y2Ba细胞中表达CD44的AM百分比较低GydF4y2Ba+GydF4y2Ba估计GydF4y2Ba28GydF4y2Ba.最后,用10μlCD14重叠外周血单核细胞以鉴定PBM。GydF4y2Ba
在4℃下在黑暗中孵育30分钟并在PBS中洗涤两次,细胞在0.5ml PBS中重新悬浮,并立即分析(Coulter Epic XL.MCL; Coulter Corporation,Miami,FL,USA。).AM通过在FITC通道中的高自发荧光的细胞上鉴定AM,以及典型的前向和侧散射特性。通过在细胞上鉴定PBM CD14GydF4y2Ba+GydF4y2Ba.使用三伐标度产生荧光直方图,并以平均荧光强度为单位表示。用于平均荧光强度的免疫球蛋白(IG)-G对照值(FITC / PE IgGGydF4y2Ba1GydF4y2Ba,克隆679.1 mc7;(Immunotech, Marseille, France)从每种特异性单克隆抗体中减去。为了生成每个直方图,我们分析了10,000 AM或5,000 PBM。GydF4y2Ba
统计分析GydF4y2Ba
结果以平均值±表示GydF4y2BaSEM.GydF4y2Ba.非参数统计(Kruskal-Wallis测试和Mann-Whitney U-Test)用于评估组之间差异的统计学意义。p值<0.05被认为是显着的。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
人体测量和肺功能数据GydF4y2Ba
所有受试者都符合年龄和吸烟历史(表1GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).在目前吸烟者和出吸烟者获得的结果中没有发现显着差异。根据黄金,COPD患者显示中等气流梗阻(表1GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.根据定义,肺活量测定在肺功能正常的吸烟者和非吸烟者中是正常的。GydF4y2Ba
所有参与者的临床和肺功能数据GydF4y2Ba
BAL细胞计数GydF4y2Ba
COPD患者总细胞计数较高(1.7±0.3×10)GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba·ML.GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)和吸烟者肺功能正常(2.3±0.4×10)GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba·ML.GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba(0.5±0.1×10)GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba·ML.GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba;p < 0.05)。各组间细胞计数差异无统计学意义(表2)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗液中的总和差异细胞计数GydF4y2Ba
PBM表面表型GydF4y2Ba
在PBM中研究的不同表面受体的表达在三个主题组中相似(表3GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
外周血单核细胞(PBM)和肺泡巨噬细胞(AM)表面受体平均荧光强度值GydF4y2Ba
我表面表型GydF4y2Ba
大多数研究的AM表面受体的表达在三个实验组之间没有差异(表3)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).然而,HLA-DR和CD80在COPD患者中的表达较低(p<0.01)(图1)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).AM亚步骤的分析(图2GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)表明,CD44低的AM百分比GydF4y2Ba+GydF4y2BaCOPD患者增加(P <0.001;图3GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
![图。1-GydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/25/4/647/F1.medium.gif)
a)人白细胞抗原(HLA)-DR和b) CD80在健康不吸烟者、肺功能正常吸烟者和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺泡巨噬细胞中的表面表达。GydF4y2Ba#GydF4y2Ba:P <0.02;GydF4y2Ba¶GydF4y2Ba:p = 0.002;GydF4y2Ba+GydF4y2Ba:p = 0.003;GydF4y2Ba§GydF4y2Ba: p = 0.006。GydF4y2Ba
![图2-GydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/25/4/647/F2.medium.gif)
a)慢性阻塞性肺疾病患者和b)肺功能正常吸烟者的支气管肺泡液中肺泡巨噬细胞(AM)的代表性特征。采用双色流式细胞术检测CD44和人白细胞抗原(HLA)-DR的双重表达;方形表示AM表达低水平的CD44。GydF4y2Ba
表达低水平CD44的肺泡巨噬细胞百分比(CD44低GydF4y2Ba+GydF4y2Ba)在非莫科赫,吸烟者具有正常的肺功能和慢性阻塞性肺病(COPD)。***:P <0.001。GydF4y2Ba
PBM与AM表面表型比较GydF4y2Ba
补体受体3(CD11b)的表达和涉及吞噬作用(CD36,CD61和CD14)的几种受体的表达比在所有群体中的植物中均高于AM(表3GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).相比之下,在三组研究中,AM的共刺激分子(CD80, CD86和CD40)表达较高。这些差异反映了PBM向AM成熟的过程GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
正常的PBM迁移到肺部并成熟进入AMGydF4y2Ba25GydF4y2Ba.AM是人类下呼吸道的主要免疫活性细胞群,可能在慢性阻塞性肺病(COPDGydF4y2Ba32GydF4y2Ba.AM的不同功能状态反映在其表面不同受体的表达,包括吞噬作用(CD44, CD36, CD51, CD61, CD14),抗原提呈能力(HLA-DR),几个共刺激分子(CD80, CD86, CD40)和补体受体3型(CD11b)。目前的作者假设,与肺功能正常的吸烟者和非吸烟者相比,慢性阻塞性肺病患者的AM可能表现出一种特定的表面表型,这可能最终有助于增强对吸烟的反应,并/或限制一旦损伤消失后停止反应的能力。为了探索这一假设,我们比较了这三组个体中AM(和PBM)的表面表型。研究发现,在所有三组中,大多数受体的表面表达是相似的。然而,也有一些明显的例外。首先,COPD患者AM上HLA-DR和CD80的表达降低,其次,表达CD44的AM亚群降低GydF4y2Ba+GydF4y2Ba在同样的病人中增强了GydF4y2Ba
巨噬细胞的功能是作为抗原提呈细胞,因此协调激活不同的淋巴细胞亚群。HLA-DR通过AM调节抗原呈递,其在单核/巨噬细胞表面的表达与这些细胞的激活状态密切相关GydF4y2Ba10GydF4y2Ba.因此,AM上HLA-DR的表达减少与低激活状态有关GydF4y2Ba33GydF4y2Ba并且可以促进免疫宽容GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba.此外,CD80在提供抗原特异性免疫应答所需的共鸣信号方面发挥着重要作用GydF4y2Ba36GydF4y2Ba.因此,COPD患者AM中发现的HLA-DR和CD80的表达降低表明,这些患者的细胞介导的免疫功能可能是异常的。这可能通过干扰CD4 + T-辅助淋巴细胞的抗原复合物的识别通过干扰抗原复合物来倾向于支气管殖民化GydF4y2Ba37GydF4y2Ba.HLA-DR的表达和CD80 PBM相似,三组受试者的研究表明,不同的表型观察正在发生变化而在当地肺环境和排除的可能性,这些患者的遗传背景不同。GydF4y2Ba
CD44是糖粉粘附受体和糖氨基氨基甲酰透明质糖的主要细胞表面受体GydF4y2Ba38GydF4y2Ba.因此,CD44在透明质酸的清除中发挥重要作用,透明质酸在炎症和组织损伤部位积聚,具有促炎功能GydF4y2Ba39GydF4y2Ba.在正常的肺中,AM是将透明质酸透明质的主要细胞类型用于降解,CD44参与此过程GydF4y2Ba40GydF4y2Ba.此外,CD44对巨噬细胞的连接选择性地促进了凋亡中性粒细胞的摄取GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba41GydF4y2Ba.因此,整体CD44在肺炎的分辨率中发挥着重要作用GydF4y2Ba42GydF4y2Ba.目前的研究发现表达CD44的AM的百分比较低GydF4y2Ba+GydF4y2BaCOPD患者比肺功能正常和非吸烟者的吸烟者更高。这可以确定透明质酸结合能力下降GydF4y2Ba28GydF4y2Ba因此,限制了AM在COPD患者中清除凋亡中性粒细胞的能力GydF4y2Ba41GydF4y2Ba-GydF4y2Ba43GydF4y2Ba,并有助于长期肿瘤炎症。然而,由于目前研究的横截面设计,因此无法建立这些改变是否参与疾病的主要发病机制或因此是它的结果。GydF4y2Ba
总之,目前的研究表明,慢性阻塞性肺病患者的肺泡巨噬细胞表现出特定的表面表型,其特征在于减少了参与抗原呈递(人白细胞抗原-DR和CD80)的两种受体的表达和涉及的一种受体终止炎症反应(CD44)。这些观察结果突出了两种以前未描述的改变,可能有助于表征慢性阻塞性肺病的异常炎症反应。GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
作者要感谢参与这项研究的个人的合作;F. Bauzà, M. Bosch, A. Noguera和M. López,感谢他们在研究过程中的帮助。GydF4y2Ba
- 收到了GydF4y2Ba2004年5月27日。GydF4y2Ba
- 公认GydF4y2Ba2004年12月3日。GydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司GydF4y2Ba
参考文献GydF4y2Ba
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