摘要
CC趋化因子在间质性肺疾病的发病机制中起着重要作用,而结节病纤维化阶段CC趋化因子受体(CCR)5的下调已被观察到。
为了评估CC趋化因子和CCR5在特发性肺纤维化(IPF)中的表达,更具体地说,在常见的间质性肺炎中,对35名受试者进行了研究。测定了18名非吸烟者对照组和17名IPF患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中CC趋化因子配体(CCL)2、CCL3和CCL4的水平。在肺泡巨噬细胞和淋巴细胞中检测CCR5的表达。
IPF中所有趋化因子的BALF水平均显著升高:CCL3的中位数(范围)为1.6(1.0–11.1)对1.2(0.0–3.8)pg·mL−1.; CCL4 6.2(1.3-96.0)对3.4 (0.3 - -6.8) pg·毫升−1.; 和CCL2 60.1(16.7-251.3)对4.6(0.5–119.4)pg·mL−1..CCL2水平与肺的一氧化碳扩散能力呈负相关(DL,有限公司)和动脉血氧张力。与对照组相比,IPF组的淋巴细胞中CCR5表达明显减少。
研究的CC趋化因子参与了特发性肺纤维化的炎症机制,结果与该疾病中T-helper 1免疫应答下调的假设一致。
特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种局限于肺的慢性纤维化间质性肺炎的特殊形式,肺活检显示其组织病理学特征为通常的间质性肺炎(UIP)1.. 病因不明。组织学特征和主要诊断标准是低倍镜下的异质性表现,伴有正常肺、间质炎症、纤维化和蜂窝状改变的交替区域1..
肺损伤后的正常修复导致组织完整性和功能的快速恢复。与正常修复相反,IPF中的慢性炎症促进纤维增殖和细胞外基质的沉积,反映出组织修复失调和过度。慢性炎症的一个显著特征是白细胞浸润,白细胞的募集需要浸润的白细胞与内皮细胞、驻留的基质细胞和实质细胞之间的细胞间通讯。这些事件由早期反应细胞因子(如白细胞介素(IL)-1和肿瘤坏死因子(TNF))的产生、细胞表面粘附分子的表达以及趋化因子(如趋化因子)的产生介导2..
趋化因子最初被描述为趋化因子,现在已知可以调节细胞因子的产生、粘附分子的表达和单核细胞的增殖3.. 在博莱霉素诱导的IPF动物模型中,CC趋化因子如CC趋化因子配体(CCL)3(巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α)和CCL2(单核细胞趋化蛋白-1)在肺损伤的发生和维持及其血管生成中起着关键作用3..
目前尚无关于CCL4(MIP-1β)在IPF中作用的数据,但在累及肺的系统性硬化中观察到外周血单个核细胞产生CCL4的增加以及该趋化因子的血清浓度增加,以及CCL2和CCL34..
两种巨噬细胞来源的CC趋化因子CCL3和CCL4之间的平衡可能参与IPF炎症的维持和慢性进程。这两种趋化因子都将CC趋化因子受体(CCR)5识别为活化的t淋巴细胞和肺泡巨噬细胞的细胞受体5..刺激CCR5诱导细胞内生化级联反应,增加IL-2和干扰素(IFN)-γ的产生和释放6..
在最近一项关于肺结节病的研究中,CCR5在结节病患者的淋巴细胞和肺泡巨噬细胞中表达增加,但在晚期表达下调;从疾病的早期阶段也观察到CCL4的累及,在结节病的晚期纤维化阶段普遍累及CCL37..为了比较IPF与晚期结节病的关系,本文作者测定了IPF患者支气管肺泡灌洗(BAL)中CCL3和CCL4的水平以及肺泡细胞中CCR5受体的表达。我们还评估了BAL液(BALF)中CCL2的浓度及其与功能损害程度的相关性。这项研究的一些结果以前以摘要的形式报道过8..
方法
研究人群
18名健康、不吸烟的历史对照,他们也在当前作者先前的研究中提出7.,并对17例轻-中度IPF患者进行了研究。IPF的诊断依据是临床、功能、影像学和组织学标准。根据美国胸科学会和欧洲呼吸学会国际共识声明对IPF的定义,9例患者在通过开胸或电视胸腔镜活检获得的UIP组织学证据,188bet官网地址8例患者在所有主要和次要诊断标准的情况下,经支气管活检和BAL诊断为IPF1..9例非吸烟者,8例戒烟者(≥5年)。纳入研究前≥3个月停用类固醇或非类固醇抗炎药物治疗。在纳入之前,所有受试者均未接受过细胞毒性或免疫调节药物治疗。
每个受试者都获得了知情同意,该方案由意大利维鲁诺科学研究所的审查委员会批准。
肺功能测试
肺功能测试包括测量一秒内的用力呼气量、用力肺活量(6200 Autobox肺功能实验室;美国约巴林达Sensormedics公司)和一氧化碳的肺扩散能力(DL,有限公司),通过单次呼吸法测定(2200肺功能实验室;Sensormedics公司)。
支气管肺泡灌洗处理
如前所述进行BAL9.简单滴注3次50 ml 37℃预温0.9%无菌生理盐水于右中叶,注射器正常吸引恢复。液体通过单层无菌纱布过滤。Cytocentrifuge (Cytospin II;用天然液体制备的载玻片,用May-Grunwald Giemsa染色以确定细胞差异。在×1,000放大镜下,每片共500个细胞(不含上皮细胞)。用于免疫细胞化学的细胞离心机载玻片用丙酮固定2分钟,-80°C冷冻至分析。4℃离心后获得的BAL上清立即在−80℃保存至分析。
免疫细胞化学
在冷冻细胞离心切片上采用免疫细胞化学方法检测CCR5在BAL细胞中的表达。抗ccr5 (MAB 181)购自研发系统公司(Abington, UK)。单克隆抗体结合采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法(apap kit system K670;Dako,哥本哈根,丹麦)和耐晒红色衬底。
脂多糖刺激的单核细胞的胞旋制备作为每次染色的阳性对照。阴性对照载玻片包括用小鼠单克隆免疫球蛋白G2a (Dako)免疫染色的细胞旋蛋白制剂。
在×1,000放大镜下对染色细胞进行光镜分析,并根据形态学标准检测和鉴定总共≥250个细胞(巨噬细胞和淋巴细胞)。
免疫分析
使用Centricon-3浓缩器(Amicon Inc.,Beverly,MA,USA)浓缩至少10倍的BALF中的趋化因子水平,通过Quantikine CCL2、CCL3和CCL4 ELISA试剂盒(研发系统)获得。本试验采用定量夹心酶免疫分析技术。将趋化因子特异性单克隆抗体预先包被在微量滴定板上。标准曲线从0到1000绘制 pg·mL−1..试剂盒(厂家数据)的检测下限分别为5.0、6.0和4.0 pg·mL−1.分别为CCL2, CCL3和CCL4。标准品和样品是一式两份。得到的结果被划分为浓度值。
统计分析
人口统计学和功能数据以平均值±报告sd;其他结果用中位数(范围)表示。两组间的差异通过人口学和功能数据的非配对t检验进行评估,其他结果采用Mann-Whitney u检验。用Spearman秩相关系数研究趋化因子浓度与肺功能试验和BAL细胞群之间的相关性。p<0.05为差异有统计学意义。
结果
功能数据
表1⇓显示研究人群的人口学和功能数据。IPF患者的年龄明显大于对照组。所有IPF合并a的患者均观察到肺功能受限和气体交换障碍DL,有限公司52.2±13.9%和动脉氧分压(P啊,一个2.)为9.0±1.4 kPa,分别为98.3±10.3%和11.9±0.3% 在对照组中分别为kPa。
BALF细胞计数差异
IPF组总细胞的BAL数轻微但显著增加(200.3×103.细胞·毫升−1.对125.1×103.细胞·毫升−1.;P <0.05),见表2⇓. 这种增加包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的百分比(p<0.0001)和绝对数值(p<0.0001)增加。对照组和IPF患者BAL中巨噬细胞的中位数(范围)非常相似(105.6(46.4–234.1)×10)3.细胞·毫升−1.对119.0(29.4 - -226.1)×103.细胞·毫升−1.;不重要)。
CCL2、CCL3和CCL4的BALF水平
IPF患者BALF中所有被评估的趋化因子均增加。CCL3的增加(图。 1.⇓),但有统计学意义,与对照组(1.73 (1.05-11.07)对1.22 (0.0 - -3.84) pg·毫升−1.;p < 0.03)。更明显(图2)⇓)中CCL4浓度的差异(7.03 (1.26-96.04)对3.10 (0.28 - -6.8) pg·毫升−1.;p < 0.003)。如预期,IPF患者BALF中CCL2水平明显升高,如图3所示⇓,与对照组相比(68.65 (16.7-251.3))对4.56(0.50–119.4)pg·mL−1.;p < 0.0001)。
CCL2、CCL3和CCL4浓度与功能损害、BAL特征的关系
由于两组有显著差异,目前的作者分析了趋化因子浓度与IPF组中功能和细胞数据之间的关系。由于对照组被排除在分析之外,许多统计上显著的相关性消失了。然而,IPF患者BALF中CCL2浓度的增加与IPF相关P啊,一个2.(p < 0.003)DL,有限公司(p<0.009)如图4所示⇓.比较CCL4浓度和功能或细胞数据没有发现显著的相关性。相反,如图5所示⇓IPF患者BALF中CCL3水平与每毫升中性粒细胞的百分比和总数显著相关(ρ = 0.569,p<0.05,ρ = 嗜酸性粒细胞(ρ = 0.600,p<0.03,和ρ = 分别为0.675,p<0.02)。
讨论
目前的研究结果表明,IPF患者BALF中三种CC趋化因子CCL2、CCL3和CCL4水平升高,与淋巴细胞中细胞受体CCR5表达降低相关。
IPF或UIP的发病机制是由于肺泡毛细血管壁基底膜的炎症/损伤,导致I型上皮细胞和内皮细胞的丢失、II型细胞的增殖、肺泡完整性的丧失、基质细胞的募集和增殖、细胞外基质的沉积和终末期纤维化10.麦基等.11观察到,细胞外基质中的透明质酸片段,糖胺聚糖组分,能够激活巨噬细胞,诱导功能与慢性炎症相关的基因表达,特别是趋化因子基因家族:CCL2, CCL3和CCL4,细胞因子应答基因-2和RANTES(激活调节,正常t细胞表达和分泌)11.
在动物异硫氰酸荧光素(FITC)和博莱霉素模型中,已观察到CC趋化因子参与IPF的炎症事件,即IPF中CCL2和CCL3水平升高3.,12在人类研究中13.使用FITC和博莱霉素小鼠模型,Moore等.12观察到,与野生型CCR2+/+相比,转基因CCR2−/ -的动物免受肺纤维化的发展,即使在两种类型的小鼠中,BAL中的CCL2水平都增加了。
在人类中,日本须贺等.13观察到IPF患者BAL和血清中CCL2水平升高,表明血清CCL2水平与间质性肺疾病的临床病程有关。目前的研究结果证实了IPF患者BAL中CCL2水平高于正常受试者,并加强了Suga观察到的关系等.13在这种趋化因子和疾病的临床过程之间,也显示出与功能损害的程度,从而与疾病的严重程度显著相关。
CCL2及其受体CCR2通过调节促纤维化成纤维细胞源性细胞因子的生成和基质沉积参与纤维化:从纤维性肉芽肿(T-helper (Th)2型病变)中分离和培养的成纤维细胞产生的CCL2是非纤维性肉芽肿(th1型病变)或正常成纤维细胞的两倍。此外,IL-4(典型的Th2细胞因子)的刺激也增加了表达CCR2的正常成纤维细胞的数量;相比之下,用Th1细胞因子IFN-γ治疗,可显著减少表达ccr2的正常和th2型成纤维细胞的数量14.此外,IFN-γ能抑制成纤维细胞和软骨细胞胶原的生成体外降低稳态I型和III型前胶原mRNA的表达;IFN-γ是一种主要的I型细胞因子,在慢性炎症过程中对胶原沉积具有深刻的调节活性15,16.
此外,由于CCR5的激活诱导IL-2和IFN-γ的产生增加6.本文作者首次在IPF患者的淋巴细胞中证实,该受体的下调可能与IFN-γ水平下降有关。
最近,在评估外科活检和从UIP分离培养原发性肺成纤维细胞系的同时,Choi等.17在这些细胞中观察到CCR5的表达增加,但对肺泡巨噬细胞和淋巴细胞没有影响。有趣的是,在同一项研究中,崔等17还观察到UIP中CCL7水平的增加,并报道该趋化因子可以以高亲和力结合CCR5,而不会引起功能反应并取代CCR5激动剂。因此,高水平CCL7的存在可能导致CCR5活性降低,从而导致IFN-γ产生减少。为了支持这些数据,最近关于结节病的研究7.,18与第一和第二阶段相比,在晚期疾病患者的BAL中,淋巴细胞和巨噬细胞中CCR5表达下调,同时IL-4浓度增加,IFN-γ水平下降。这些数据证实了Th2表达持续失衡的假设对肺中的Th1细胞因子是肺纤维化进展的一种机制,在结节病和肺纤维化的晚期,炎症的类型非常相似,尽管最初的疾病不同。关于CCL3和CCL4在人类IPF炎症机制中的作用知之甚少。
CCL3在纤维化性肺病的炎症过程和博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中已被观察到的重要作用3.,19结果显示,抗ccl3抗体处理小鼠的净肺羟脯氨酸含量较非免疫血清处理小鼠降低49%20..在一项关于结节病的研究中,目前的作者观察到这些CC趋化因子在向纤维化晚期进化过程中的不同参与7..当评估不同结节病分期的患者时,可以观察到这两种CC趋化因子的参与:CCL4来自疾病早期,CCL3普遍存在于结节病的晚期纤维化分期。此外,BAL中CCL3水平与中性粒细胞之间存在显著相关性7..
在本研究中,作者证实了纤维化患者BAL中这两种趋化因子水平升高,并且如预期的那样,中性粒细胞数量和百分比增加,这与BAL中CCL3水平呈正相关。
祝福等.21在大鼠中观察到,CCL4显著促进中性粒细胞的募集和肺组织TNF-α的产生,TNF-α由肺纤维化中增生的II型肺泡细胞分泌,并促进成纤维细胞的DNA合成和增殖22.
CCL4水平与中性粒细胞数量或百分比无相关性。事实上,在人类中,这种趋化因子并不参与中性粒细胞的招募23.
最后,病毒感染,特别是疱疹病毒慢性感染,是UIP的假定病因之一15,22.里沃德等.24最近观察到,CCL3和CCL4不仅参与炎症反应,而且还介导粘膜和系统适应性免疫,增强粘膜和血清体液免疫以及针对传染病的细胞免疫应答,特别是病毒源性传染病。CCR5是HIV-1感染进入细胞的共同受体,CCL7在UIP中增加并阻止HIV R5株的结合17,而CCL3和CCL4是嗜m性HIV感染的有效抑制剂24,正如本研究中观察到的,在UIP中两者均增加。所有这些观察都有助于加强病毒参与UIP病因的假设。
因此,趋化因子在肺部疾病的炎症和免疫,特别是在肺间质性疾病的发病机制中的作用和功能还远未完全阐明。然而,目前的数据表明,CC趋化因子在特发性肺纤维化的进展中具有促纤维化作用,随着对通常间质性肺炎/特发性肺纤维化炎症机制的理解增加,发展可能的方法来挑战纤维形成作为一种手段,以对抗这种进展和致命的疾病。
致谢
作者感谢R.Allpress的编辑协助。
- 收到了2004年7月9日。
- 认可的2004年12月26日。
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