摘要
根据目前的证据,转化生长因子(TGF)-β在肺纤维化的发展中起着重要的致病作用。越来越多的证据表明血管紧张素II可以作为TGF-β介导的肺纤维化的刺激因子。然而,血管紧张素II在肺纤维化病理生物学中的作用在活的有机体内目前尚不清楚,在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中靶向血管紧张素II的治疗潜力尚不清楚。
因此,本研究的目的是测试血管紧张素II拮抗剂,氯沙坦是否衰减了两种不同鼠菌株,C57 / BL6和SV129中的肺炎素诱导的肺纤维化的发展。这是通过羟脯氨酸测定的组织病理学和定量胶原甲烷的定量来确定。
尽管血管紧张素II对抗在活的有机体内在减少急性肺损伤的措施中,氯沙坦治疗,在显示减少小鼠肾脏和心脏纤维化的剂量,未能显著改善博莱霉素诱导的肺纤维化。
总之,这些数据表明肺纤维化疾病过程在活的有机体内并非仅仅依赖于血管紧张素II的活性,而血管紧张素II受体阻滞剂作为肺纤维化患者治疗策略的潜力可能有限。
特发性肺纤维化是一种逐步的间质性肺病,死亡率高,迄今无效待遇1- - - - - -4.这种未知的病症病症的特征在于肺实质中的成纤维细胞异常增殖和胶原沉积。越来越多的证据表明,炎症和纤维化均由细胞因子活性介导,特别是转化生长因子(TGF)-β5- - - - - -8.实际上,在动物模型和肺纤维化患者中,已经观察到TGF-β水平的升高5,9- - - - - -11.因此,靶向TGF-β已成为治疗肺纤维化的一种新的潜在治疗策略12,13.
激素血管紧张素II主要在肺部生产,用作TGF-β-介导的纤维化的推定诱导剂。血管紧张素II不仅可以上调TGF-β表达,还可以改变各种组织纤维化模型中的TGF-β受体14- - - - - -18.在体外,血管紧张素II对AT的作用1受体可以刺激多种组织中的胶原合成和平滑肌肥大19.这种促纤维化血管紧张素II效应已在心脏、血管系统、肾脏和肝脏中观察到,其效应已被血管紧张素II阻断剂消除16- - - - - -20..事实上,血管紧张素受体阻滞剂的抗纤维化活性,如氯沙坦,可能显著有助于心血管和肾脏疾病患者的治疗效益。在肺中,有越来越多的证据表明血管紧张素II与TGF-β介导的肺纤维化有关。血管紧张素转换酶水平的升高已经在肺间质性疾病的广谱中得到证实21,22,而血管紧张素II已被证明可刺激TGF-β介导的肺成纤维细胞增殖在体外23.然而,血管紧张素II在肺纤维化病理生物学中的作用在活的有机体内靶向血管紧张素II在肺纤维化中的治疗潜力尚不清楚。
因此,本研究的目的是探讨慢性血管紧张素II拮抗剂治疗对小鼠肺纤维化诱导的影响通过气管内给药化疗药物博莱霉素。
方法
鼠纤维化的鼠模型
梅奥基金会制度的动物护理和使用委员会批准了所有实验方案。这些研究利用了两种不同的小鼠菌株:C57 / BL6(Harlan,Indianapolis,In,USA)和SV129菌株(杰克逊实验室,Bar Harbor,Me,USA)。通过Bleomycin(0.05-0.1u·kg体重,在甲氧基氟丙烷麻醉小鼠中诱导肺纤维化−150µL生理盐水;西柯制药公司,Irvine, CA, USA),在直接显像下注入气管通过一个口服喂养插管,随后加入150µL的空气,以增加对远端气隙的输送。对照组给予等量的气管内无菌生理盐水。组间比较采用方差分析、非配对t检验或非参数检验。数据以平均值±表示扫描电镜;n是指样本大小。预先确定p值为<0.05以表示统计学上显着差异。
血管紧张素ⅱ对抗
随机分配小鼠接受血管紧张素II受体拮抗剂洛萨顿(Merck和Co.,West Point,Pa,USA)口服(40-50 mg·kg−1·天−1)仅在博来霉素/盐水滴注之前,并继续直到学习完成。将自由水溶性脱萨沙沙顿溶解并递送在饮用水中(最初200 mg·l−1).每周根据饮水量调整药物浓度两次,以维持目标剂量。
在活的有机体内血液力学
使用1.4-Fr高保真导管在线记录全身动脉血压(spr671;在2,2,2-三溴乙醇(375µg·kg)下插管右侧颈总动脉−1i.p。;Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)麻醉小鼠。基线测量记录在实现稳定的平台追踪和急性给药血管紧张素II (Peninsula Laboratories Inc., San Carlos, CA, USA;1µg·kg体重和10µg·kg体重−1进入左心室)。
支气管肺泡灌洗
腹腔内戊巴比妥麻醉后,支气管肺泡灌洗(BAL),分别灌洗5份0.8 ml的含0.4 mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。第一组分离用于TGF-β分析。所有材料均硅胶化,以防止TGF-β的粘附。酸化后第4天和第14天,采用ELISA法定量TGF-β总(活性+潜伏)水平,以pg·mL表达−1(节目,麦迪逊,WI,美国)。离心灌洗液中的颗粒在PBS中重悬后,将剩余的等量物合并用于细胞检测。
组织病理学
在连续的实验时间点,在气管内灌注博莱霉素或生理盐水后,取经氯沙坦处理或对照组小鼠的4%福尔马林固定的肺,取0.5µm厚的石蜡包埋的肺切片,用苏木精和伊红染色或马森三色染色进行光镜观察。通过在不考虑样本来源的连续显微镜视野中比较纤维化区域和非纤维化区域的比例,对纤维化进行数字量化。
羟脯氨酸法测定胶原蛋白含量
通过12 n HCl在过夜水解后测定肺羟基脯氨酸含量,在整个肺中测定总肺胶原蛋白含量24.所有的样本都是重复的,与已知的羟脯氨酸浓度平行,以生成标准曲线(Sigma)。
结果
洛萨兰损害血管紧张素II对血管基调的影响
莱斯坦坦通过直接对抗的直接对抗介导全身性动脉压力降低1周边脉管系统中的受体25.在本研究中,口服氯沙坦治疗5天后在活的有机体内直接测量小鼠的血流动力学(图1)⇓).与对照组相比,经氯沙坦预处理的小鼠体表平均动脉压显著降低(7.04±0.56 kPa(52.9±4.2 mmHg))。与9.5±0.45 kPa(71.3±3.4 mmHg), p<0.005;图1一个⇓b)。此外,在对照动物中观察到对照动物的血管紧张素II的急性压力响应在氯沙坦处理的小鼠中消除了(图1C⇓).因此,在当前的研究中使用氯沙坦的剂量导致血压的降低至少与临床实践中观察到的一样大,并证明了血管紧张素II (at)的定量拮抗作用1)受体体内。这些发现证实了足够的氯沙坦被实验动物消耗以产生强大的药理学反应。
洛沙坦改变血液动力学在活的有机体内.a)对照(—)或氯沙坦处理(····)小鼠的代表性动脉血压曲线。b)接受氯沙坦治疗的小鼠(n = 7;烧嘴动物的平均动脉压较对照组低(n = 11;▪)。**:与对照组相比,p<0.01。c)与对照组相比,氯沙坦治疗的小鼠(烧烧组)对外源性给药血管紧张素II也表现出取消的升压反应。*: p < 0.05;**:与基线相比p<0.01;#:与氯沙坦处理的动物相比P <0.05。1 mmhg = 0.133 kpa。
氯沙坦治疗的急性炎症反应衰减
博莱霉素诱导急性肺炎症是肺纤维化发展的前奏,这一作用强烈通过TGF-β信号通路介导7.通过BAL 4天后评估用BLEOMYCIN或盐水处理的C57 / BL6小鼠中的急性肺损伤。正如预期的那样,通过灌洗液总细胞的增加来诱导博来霉素诱导显着的炎症反应(图2A⇓),主要由中性粒细胞升高介导(图2b⇓).在博莱霉素刺激的动物中,氯沙坦治疗显著减弱了这种早期中性粒细胞反应(图2a)⇓b)。此外,在Bleomycin /盐水滴注后4天,在所有小鼠的BAL流体中观察到高水平的总TGF-β(图2C⇓).此外,在给予博莱霉素而不给予氯沙坦的小鼠中观察到TGF-β显著升高(图2c)⇓).然而,在14天内,在博莱霉素 - 单独的群中,TGF-β水平仍然很高,而洛萨顿治疗不再表现出有益效果(图2D⇓).因此,氯沙坦治疗减弱了暴露于博莱霉素的肺中最初的急性炎症反应和TGF-β的释放,尽管这些作用在14天后消散。
与对照(▪)相比,洛萨沙坦(▓)减少了博尔霉素诱导的急性肺炎。a)Bleomycin诱导显着的炎症反应,通过在4天内通过支气管肺泡灌洗(BAL)流体的总细胞的增加来测量。**:与对照组相比,p<0.01。b)预期,通过嗜中性粒细胞的增加,通过Bleomycin诱导的增强的细胞性主要介导。有趣的是,这种早期的中性粒乳反应被氯沙坦显着抑制。**:P <0.01与对照相比;#:与氯沙坦比较p<0.05。c)此外,博莱霉素/生理盐水灌注后第4天,所有小鼠的BAL液中均观察到高水平的转化生长因子(TGF)-β。TGF-β在给予博莱霉素组小鼠中明显升高,而氯沙坦组小鼠中没有。*:与对照组相比p<0.05。d)第14天,博莱霉素处理的动物TGF-β水平仍然很高。然而,氯沙坦治疗不再显示TGF-β的抑制。*:与对照组相比p<0.05。在第4天或第14天,每种条件下至少有5或6只老鼠被研究。TGF-β表达为pg·mL−1.
血管紧张素II拮抗剂不能影响博莱霉素诱导的肺纤维化
来自博莱霉素暴露后的小鼠的连续肺切片显示弥漫性间质纤维化和慢性炎症(图3⇓).血管紧张素受体阻滞剂氯沙坦的慢性治疗对纤维化反应没有显著影响(p = 0.34;图3⇓).博莱霉素毒性诱导小鼠明显胶原沉积,通过羟脯氨酸测定全肺匀浆。与生理盐水对照组相比,暴露博莱霉素4周后,C57/BL6小鼠的胶原沉积水平显著升高(p<0.01;图4⇓).慢性氯沙坦治疗没有衰减这种纤维化反应(P = 0.88与saline-treated bleomycin-challenged老鼠)。同样,在Sv129菌株中,已知对博莱霉素有较慢的纤维化反应,在接受博莱霉素的小鼠中,肺胶原水平在4周和8周均显著升高,氯沙坦治疗未能在任何时间点显著缓解这种反应(图4b)⇓和c)。因此,在两个单独的鼠菌株中,血管紧张素II对洛萨沙坦的拮抗作用始终未能改变博莱霉素诱导的纤维化肺重塑,尽管这些小鼠的动物接受足够的药物以改变这些小鼠的血液动力学和早期炎症活性。
氯沙坦治疗并不改变博莱霉素治疗小鼠的弥漫性间质纤维化和慢性炎症。对照(a和b)、对照+氯沙坦(c和d)、博莱霉素(e和f)和博莱霉素+氯沙坦(g和h)的连续肺切片用Masson三色(a, c, e,g)和苏木精-伊红(b, d, f, h)染色进行分析。博莱霉素暴露小鼠的肺切片显示弥漫性间质纤维化和慢性炎症。氯沙坦治疗并没有明显改变这些小鼠的炎症或纤维化。比例尺= 1000 μm。
与对照组相比,氯沙坦不能改变博莱霉素诱导的小鼠胶原沉积(▪)。a) C57/BL6小鼠4周全肺匀浆羟脯氨酸测定(4个研究组各5只小鼠);b) 4周时SV 129小鼠(四组中n = 4 - 9只小鼠)和c) 8周时SV 129小鼠(四组中n = 3-6只小鼠)在博莱霉素治疗后,小鼠肺部胶原蛋白含量均有所提高。值得注意的是,在任何时间点,氯沙坦治疗对两种菌株的肺纤维化均无明显效果。**:P <0.01与对照相比。
讨论
这里提出的结果表明,尽管血管紧张素II拮抗作用在活的有机体内以及减少急性肺损伤和炎症的措施,氯沙坦治疗,先前显示的剂量可以减少小鼠肾脏和心脏纤维化16- - - - - -18,在连续时间点上未能改善博莱霉素治疗的两个独立品系小鼠的肺纤维化。目前在博莱霉素损伤模型中观察到的肺纤维化与早期心脏和肾纤维化的研究之间存在差异的原因尚不完全清楚。与肺纤维化相比,这些差异可能与血流动力学力量对心脏和肾脏纤维化更显著的影响有关。在心脏和肾纤维化模型中,这些力量可能与氯沙坦对TGF-β的局部作用协同作用。尽管在本研究中使用的氯沙坦浓度显著改变了全身血压和肺部炎症,AT1-受体拮抗剂未能抑制两株博莱霉素治疗小鼠的肺纤维化。
肺纤维化疾病是一组异质性的疾病,其特征是实质结构破坏,胶原沉积和纤维化1- - - - - -3..病因是多种多样的,包括一系列环境和有毒物质暴露,包括治疗药物。肺纤维化疾病已通过使用各种有毒暴露在动物模型中模拟,最常见的是通过使用暴露于博莱霉素的啮齿动物,这些啮齿动物发生急性炎症反应,随后发生纤维化间质反应。然而,在不同遗传背景的小鼠中,肺对博莱霉素的反应有明显的菌株特异性差异26.研究最多的菌株,C57BL6具有强大的早期肺损伤反应,随后在2-4周最大纤维化,随后结构恢复。其他菌株,如Sv129,可能更好地反映了临床疾病模式,表现出一个缓慢但更持久的破坏性纤维化过程。作者选择两种菌株进行研究,以验证氯沙坦对博莱霉素诱导的肺纤维化缺乏疗效并不仅仅与所选小鼠的遗传差异有关。
博莱霉素损伤引起肺纤维化的确切机制尚不完全清楚,肺肾素-血管紧张素系统在其中的相对作用也不完全清楚。本文报道的研究表明,AT1在这种模型中,尽管初始损伤后肺炎症得到明显的抑制,但阻断并不一定能改善肺纤维化。然而,仍然有可能肺中的局部血管紧张素II活性可能不能被这种药物完全拮抗。此外,血管紧张素II受体的抑制可能进一步导致局部和循环血管紧张素II活性的增加,这可能通过其他可能独立于AT的机制发挥作用1受体。尽管如此,目前的研究确实表明,氯沙坦的药理学剂量与显著降低血压和早期减少肺部炎症有关,并没有改变这些小鼠的肺纤维化。
最近的研究使人们进一步了解肾素-血管紧张素系统在不同器官纤维化过程中的潜在作用。在肺里,有在体外血管紧张素II可以刺激TGF-β介导的成纤维细胞增殖23.鉴于肾素-血管紧张素系统调节剂在心血管疾病患者中的广泛临床经验,以及这些疗法普遍安全有效的发现,人们对评估靶向血管紧张素II是否可能在肺纤维化治疗中有价值感兴趣。为此,本研究研究了临床是否可用血管紧张素AT1受体阻滞剂氯沙坦可抑制博莱霉素诱导的肺纤维化反应。尽管实现了血管紧张素II-dependent血液动力学的影响,以及一个初始的释放减少TGF -β博来霉素曝光后,这影响早期炎症/纤维化细胞因子并不持续,并最终洛沙坦对纤维化的程度没有影响或在任何后期胶原沉积。
最近的一份报告表明,血管紧张素II拮抗剂可能会减弱博莱霉素诱导的急性肺损伤大鼠模型中的胶原沉积27.在那项研究中,报告的数据表明,氯沙坦的主要作用似乎是促进正常的肺胶原蛋白转化,而不是消除博莱霉素诱导的纤维化27.马歇尔先前的研究也存在一些差异et al。27本报告如下。首先,目前的研究只在老鼠身上进行,而早期的研究集中在大鼠身上。在马歇尔的研究中et al。27,在博莱霉素损伤之前皮下施用氯沙坦24小时;虽然在目前的研究中,莱斯坦坦在Bleomycin滴注之前在饮用水中给出,更紧密地模仿药物可能在人类纤维化疾病中施用的途径。因此,大鼠和小鼠模型之间的差异可能存在于这两个物种中洛萨顿效果的动力学中,肺损伤的峰,以及在所用的有效剂量的博莱霉素中存在。最后,目前的研究测量了氯沙坦对总TGF-β水平的影响,而早期的研究仅关注这种生长因子的生物活性形式。尽管如此,在两种乳糖霉素处理的小鼠中,在纤维化肺病的产生中没有观察到差异。在目前的研究中,氯沙坦治疗似乎没有影响假攻击的小鼠中的肺胶原含量。实际上,氯沙坦治疗未能降低纤维化水平的结果表明,血管紧张素II不是纤维化过程的临界介质,至少在博来霉素小鼠模型中。因此,尽管氯沙坦治疗抑制TGF-β最初,但这种效果不完全并且不持续,表明肺中TGF-β-介导的纤维化的刺激并不完全取决于血管紧张素II。
李的另一项研究et al。14探讨了血管紧张素II和AT的潜在作用1博莱霉素肺损伤后小鼠的受体阻滞。这些作者记录了氯沙坦在早期对博莱霉素诱导的细胞凋亡具有保护作用。这与目前观察到的肺炎症和TGF-β早期减少相一致。然而,这些作者进一步报道了博莱霉素刺激C57/BL6小鼠4周后羟脯氨酸含量的微小但显著的下降。造成这种差异的原因目前还不完全清楚。尽管在本次研究中使用的博莱霉素的剂量低于Li的研究et al。14,两项研究在给予小鼠博莱霉素4周后观察到的纤维化相对程度非常相似。虽然在从Harlan公司获得的C57/BL6小鼠中也观察到羟脯氨酸含量略有下降,但尽管多次实验运行,这没有达到统计学差异。可以想象,在老鼠的供应商来源之间存在轻微的应变差异,这是造成这些差异的原因。然而,此外,使用小鼠Sv129株进一步评估了氯沙坦的作用,尽管与对照组小鼠相比,总体肺纤维化的测量结果很可靠,但Sv129株小鼠在4周或8周时也未能显示出对羟脯氨酸的任何保护作用。因此,在本研究使用的模型系统中,氯沙坦能拮抗血管紧张素II与AT的相互作用1受体未能显著保护小鼠对抗博莱霉素诱导的肺纤维化。
它可能会假设血管紧张素II对拮抗作用的水平可能已经是次优。解决此问题,血管紧张素II抑制血管1受体是记录。我们进一步知道,在心脏和肾脏模型中,血管紧张素受体阻滞剂的抗纤维化作用在剂量范围低于显著改变血流动力学参数的剂量范围时发生。在博莱霉素纤维化模型中使用高剂量的氯沙坦会受到血压不良影响的限制。当地的药物管理是否有益还有待研究。
目前,血管紧张素II抑制是否对具有特发性肺纤维化或其他间质性疾病的患者的肺纤维化进程有任何影响,仍然是未知的。然而,最近的临床调查进一步表明这些途径可能不会证明是人类临床治疗的有效目标。例如,厌恶et al。28进行了一项关于血管紧张素转换酶抑制剂和他汀类药物对特发性肺纤维化患者生存的潜在影响的大型回顾性研究。无论是单独用药还是联合用药对这些患者的生存都没有任何有益的影响。临床研究专门调查血管紧张素II和AT的使用1间质性肺纤维化的受体抑制目前还不存在。然而,根据本文提供的临床和实验室数据,这些药物似乎不太可能对治疗人类特发性肺纤维化有效。
总之,尽管血管紧张素II是肺纤维化的中介在体外此处介绍的数据表明,尽管对早期炎症和转化肺中的生长因子-β表达有显着影响,但血管紧张素II受体阻滞剂氯沙坦未能消除源霉素诱导的肺纤维化。这表明肺纤维化疾病过程在活的有机体内尽管血管紧张素II活性有拮抗作用,但仍可发生,即使使用显著降低全身血压的浓度。这些数据表明,血管紧张素II受体阻滞剂作为肺纤维化患者治疗策略的潜力可能是有限的。
致谢
作者要感谢梅奥胸科疾病研究单位的工作人员对这些数据进行了许多有益的讨论。
- 已收到2004年7月30日。
- 接受2004年12月14日。
- ©ers Journals Ltd