抽象的
环加氧基酶(COX)-2涉及许多癌症的血管生成,COX-2抑制剂有效地防止肿瘤的发育,例如结肠癌。其表达在非球体细胞肺癌中增加,预后不良。本研究评估了正常支气管上皮中的COX-2表达,以及鳞状细胞癌的所有推定前体。
通过免疫组织化学在106个活检中研究了COX-2表达,在肺癌的高风险中连续荧光支气管镜检查期间收集的106个活检。
对应于正常上皮或低级病变的所有活组织检查(病变直到中度发育不良)未显示出增加的COX-2表达。14名严重发育不良患者中的八个中的八分之八,八分之八原位癌症,八分之五的侵袭性癌症。COX-2在正常上皮或低级别病变与高级别病变(严重异常或更严重)之间表达差异有统计学意义。COX-2表达对高级别病变的阳性预测值为100%,阴性预测值为82.35%。
总之,鳞状细胞癌的支气管前体表明环氧化酶-2表达增加,并被隔离成低 -相对高级具有高阳性预测值。因此,环加氧基酶-2表现为鳞状细胞癌的潜在早期标记。
在西方世界,肺癌是最常见的癌症死亡原因,死亡人数超过前列腺癌、乳腺癌和结肠直肠癌的总和1.非小细胞肺癌(NSCLC)的预后没有明显改善,5年生存率仍小于10%。肺癌预后不良主要是由于绝大多数NSCLC诊断为局部晚期或转移期,且缺乏有效、创新和靶向的治疗方案。了解肺癌发病机制的分子机制,将为NSCLC创新疗法的发展提供新的机遇。近年来,在发现家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者结肠息肉可通过非甾体类抗炎药减少后,前列腺素和COX在癌症中的作用受到关注2.COX是一种关键酶,其在植物糖酸转化为前列腺素,并且存在于两种同种型,COX-1和COX-23..COX-2是一种高诱导基因,由细胞因子、生长因子、佛波酯、致癌基因和化学致癌物激活3..在各种恶性人类肿瘤中据报道了COX-2的过度表达。因此,COX-2抑制剂的可用性提供了针对靶向癌症治疗或化学预防的潜力,并且Celecoxib已经显示出显着减少FAP患者的结肠直肠息肉数量4.
在NSCLC中,在腺癌(ADC)和鳞状细胞癌(SQCC)中检测到COX-2表达的增加5- - - - - -7与正常肺组织相比;然而,ADC相对于SQCC在ADC中观察到更高水平。此外,COX-2表达被证明是NSCLC患者存活的阴性预后因素8,9.也发现COX-2表达在非典型腺瘤增生中增加,ADC可能的前体6,7,10,11,但据目前作者所知,它从未在假定为SQCC之前的肿瘤前病变中进行研究。基于小鼠临床前研究,COX-2抑制剂目前正在进行II期非小细胞肺癌化学预防研究12,13.在本研究中,使用免疫组织化学(IHC)在所有类型的支气管前体病变中检查COX-2表达,以确定COX-2表达是否在SQCC致癌过程中增加,如果是,则在发生这种情况时。
材料和方法
研究人群
符合条件的患者至少有30包年的吸烟暴露史和/或肺癌或头颈癌史。局部麻醉下行激光荧光支气管镜检查,对荧光异常的部位进行活检14.只有14个原位我们获得了癌(CIS),这是队列中最罕见的前体,并对14个不同组织学类型的样本(正常(Nl)、增生(H)、上皮化生(M)、轻度异常(MiD)、中度异常(MoD)、重度异常(SD)和CIS)进行了平行分析。我们还分析了8例在荧光支气管镜检查中诊断为浸润性癌(IC)的活检。从1996年2月到2002年11月收集的106个不同病人的106个连续合格的活组织检查被回顾。只有在单个患者中发现的最严重的病变被评估,每个患者只被纳入研究一次。所有106例符合条件的患者均进行了足够大的活检以评估COX-2表达。其中女性19例,男性87例,中位年龄63岁(范围:38-92岁)。共有42名患者目前是吸烟者,62名前吸烟者,其中2名吸烟者的吸烟习惯未知。患者吸烟的中位数为50包年(范围19-134年)。18例肺癌患者接受了支气管镜检查,19例为支气管(10例)或头颈部(9例)癌症的术前检查,45例为之前治疗过的肺癌的随访,22例为CIS的随访,2例为其他原因。
样品制备与选择
所有活检标本均常规固定3小时(最少)至10小时(最多),在支气管镜检查后立即用10%中性缓冲福尔马林固定,然后包埋在石蜡中。从每个石蜡包埋的组织块中,切割4 μm切片并沉积在SuperFrost Plus玻片上(Menzel-Gläser, Braunschwein, Germany)。病理学家使用1999年世界卫生组织(WHO)/国际肺癌研究协会(IASLC)的组织学分类对所有苏木精和伊红染色的病变进行分类15成:Nl, H, M, MiD, MoD, SD, CIS和IC。
免疫组织化学对cox - 2
所有试剂均具有分析质量,不需要进一步纯化。甲醇、柠檬酸、柠檬酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)和氯酸从默克(德国达姆斯塔德)购买。
使用标准的抗生物素-Biotin-Peroxydase复合物进行IHC16和抗人COX-2序列(氨基酸580-599;免疫球蛋白(IG)-G1)的小鼠单克隆抗体来自Cayman Chemical Company(Ann Arbor,USA),染色细胞质。
通过二甲苯从载玻片中除去石蜡,并将组织在乙醇中再水化。通过在室温下将甲醇中的0.3%过氧化氢在0.3%氢过氧化氢中孵育30分钟后淬灭内源性过氧酶活性,然后在0.05M Tris-HCl pH 7.6中在0.9%NaCl中进行10分钟。在0.01M柠檬酸盐缓冲pH6中完成抗原检索,在650W下偶联15分钟的微波加热,然后在室温下冷却25分钟。抗Cox-2抗体(稀释1:24;最终滴定4.17ng·μl−1)在37℃下在载玻片上温育60分钟。使用Nexes系统(Ventana Medical Systems,Tucson,AZ,USA)在37°C下自动进行以下步骤。使用0.05%戊二醛在0.9%NaCl中使用0.05%戊二醛固定的原发性抗原抗体复合物,然后用二次生物素化抗体孵育8分钟。使用二氨基苯甲胺检测试剂盒(Ventana Medical Systems)染色载玻片,并用Haemoxylin染色。
阴性对照包括省略常规小鼠IgG的一抗和其取代。COX-2阳性结肠癌,在正常平滑肌的滑块上也是阳性的,并且已知的COX-2阳性NSCLC用作阳性对照。
解释免疫组织化学染色
两项独立评估由肿瘤学家C. Mascaux和生物学家B. Martin进行,他们都接受过支气管上皮样本免疫组化检查的培训。每个人独立评估两次免疫组化染色结果。对这两位评价者的观察结果进行了比较,不一致的解释通过使用多头显微镜对相关载玻片进行共同回顾来解决。所有的分析都是在不了解患者背景信息的情况下进行的。
仅检测细胞质染色以评估COX-2的表达。COX-2的分布为:1)无染色(0%);2) foca1染色(1-49%);3)弥漫性染色(≥50%细胞)。染色强度定义为:0 =未染色;弱染色=强度低于或等于正常肺上皮细胞;中等染色=较正常肺上皮细胞(如部分非小细胞肺癌、结肠癌细胞或结肠平滑肌)强;强染色=非常强染色,强于结肠平滑肌细胞或内皮细胞,相当于非小细胞肺癌细胞或结肠癌细胞中最强的染色。
统计评估
使用Chi平方试验和双侧渔业测试进行组织学组和COX-2表达的正面或负活检的分布之间的比较。显着性水平设定为P≤0.05。
结果
为了检查作者的外部控制的质量,评估结肠癌标本的COX-2免疫染色,癌细胞以及平滑肌细胞和包括在同一载玻片上的正常肺组织的NSCLC样品。仅在细胞质中发现COX-2染色。在结肠癌中,检测到三种强度模式:1)正常腺体细胞中的弱阳性细胞;2)适度阳性细胞位于平滑肌,血管内皮或某些癌细胞中;3)与大多数癌细胞相对应的强烈阳性细胞。在相同载玻片上具有正常肺组织的NSCLC中的COX-2染色也显示出三种染色模式。常规上皮支气管细胞具有弥漫性,但染色弱,而阳性NSCLC以中等或强强度染色与结肠癌载玻片。在肿瘤前病变中,使用与结肠和NSCLC相同的标准,观察到三种不同的染色强度:弱,中等或强。支气管前肿瘤病变染色的初始检查显示了阳性细胞的三种不同分布:染色所有细胞是阴性的,或少数群体(焦点染色)或大多数细胞(漫射染色)。支气管病变的染色得分如下(图1⇓):0 =仅染色或染色基底细胞层;1+阳性=焦点或弥漫性弱染色(0-100%的阳性细胞染色弱);2+阳性=局灶性中等或强染色(<50%的阳性细胞,中等或强烈染色);3+阳性=弥漫性中等或强染色(> 50%的阳性细胞,中等或强烈染色;表1⇓)。显示比正常肺组织更多染色的任何前体病变被认为是阳性的。将0或1次阳性的病变被认为是阴性(与正常肺组织相比的COX-2表达没有增加),与2+或3+阳性的那些被认为是阳性的(与...相比,COX-2表达的增加正常肺组织)。
目前的作者发现,21例活检中COX-2表达阳性(20%),85例活检中COX-2表达阴性(80%)。COX-2根据病变分期的表达分布见表2⇓.57.14%的SD、57.14%的CIS和62.5%的IC活检阳性。因此,58.33%的高级别活检(定义为与严重异常或更严重的病变相对应的病变)中COX-2阳性。而NI、H、M、MiD、MoD(低级别)70个病灶COX-2阴性,61个(87%)为0级,9个(13%)为1+级。在所有21例阳性活检中,18例2+或局灶染色(8例SD, 6例CIS, 4例IC), 3例3+或弥漫染色(2例CIS, 1例IC)。我们还观察到,在局灶染色的活检中,表达COX-2的细胞是非典型性更强。
阳性切片还评估了COX-2在其正常组织和毗邻高级别病变的低级别病变中的表达。该分析显示COX-2表达仅在这些患者的高级别病变中增加。在21张阳性切片中,10张切片同时包含正常、低级别病变和高级别病变,其中一些切片在同一活检中包含多个正常组织区域或低级别病变。阳性活检共发现5个正常组织,8个增生组织,3个化生组织,16个病变均无COX-2表达。
Nl、H、M、MiD、MoD组与SD、CIS、IC组COX-2表达差异有统计学意义(p<0.001)。分组MiD和MoD相对SD(p <0.001)或中间和mod相对SD和CIS (p<0.001)的差异也有统计学意义。COX-2表达并不能区分SD、CIS和IC (p = 0.10)。COX-2表达增加对高级别支气管恶性前病变(SD、CIS、IC)的阳性预测价值为100%。阴性预测值为82.35%。
讨论
本研究表明COX-2在SQCC的前体中表达增加,但仅在高级别支气管肿瘤前病变(SD, CIS)和早期侵袭性隐匿性SQCC中。SD似乎是COX-2表达的截止点。目前作者的数据扩展了先前对肿瘤前病变的研究17- - - - - -19据表明,SD可能是早期肺癌的关键步骤,将低级病变与高等病变分离,更容易进入侵入性癌症。在常规的临床实践中,恶性病变的分类低相对与1999年世卫组织/IASCL分类系统相比,高级别阶段可以更公平地反映其临床行为。然而,这一假设需要进一步的研究来证实。而且,COX-2阳性表达仅在高级别病变及相邻正常组织阳性或低级别病变患者的高级别病变中检测到。这些数据表明COX-2的表达没有场效应,只有分级效应。目前的研究是第一个评估所有SQCC前体活检中COX-2表达的研究,之前几乎没有可比较的数据。金等.20.据报道,与肿瘤相邻的少数内增生和非肿瘤支气管上皮细胞具有非常弱的COX-2表达。Hastürk.等.11,分析了51个增生和15个细胞增生,发现它们对COX-2表达完全是阴性的,这与目前的结果一致。关于Dysplasia和CIS中的COX-2表达的第一个和唯一以前的数据出现在HIDA的研究中等.6,其中Cox-2表达在四种细胞,四种发育不良和四个顺式中评估。它们的病变均表现出COX-2的表达增加6.对于不典型增生,观察到的COX-2表达的增加与之前的研究没有可对比性,因为Hida等.6没有使用新的1999年/ ariascl分类,也没有区分mod或sd。相比之下,HIDA评估的四个CIS等.6没有显示COX-2表达增加,而在目前的研究中,8个CIS中有5个COX-2表达阳性。这种差异可以用Hida研究的少量样本来解释等.6以及定义COX-2过表达的不同阈值。
在COX-2表达增加的活检中,区分出两种不同的亚型;一个呈局灶性染色(18 / 21阳性病变,85.71%),另一个呈弥漫性染色(3 / 21)。在病灶组中,COX-2强烈表达的细胞可能与同一病变中的其他细胞表现不同。COX-2在肿瘤发生中的作用已被广泛研究体外和体内使用动物模型。COX-2可以干扰大多数与肺癌发生有关的途径,如微血管生成21,抗细胞凋亡22,23、宿主免疫力24和细胞粘附25.此外,COX-2似乎是NSCLC的预后因素,特别是在早期阶段8,9.因此,在支气管肿瘤前期病变中,COX-2表达细胞可能是恶性发展的初始细胞。目前观察到COX-2表达增加的细胞表现出更多的非典型性,支持这一假设。
尽管通过炎症和致癌刺激诱导COX-2,但其他病理机制也可以降低。最近的一项研究发现,与正常肺组织相比,诸如特发性肺纤维化和结节病等间质性疾病中,COX-2表达降低了26.
COX-2应该被认为是一种潜在有趣的标记,用于早期检测肺癌风险很高的患者。在本研究中,COX-2表达的阳性预测值预测预测高级瘤预瘤病变(SD,CIS或CI)的检测为100%。没有COX-2过表达的阴性预测值为82.35%,没有高级病变。因此,COX-2表达似乎是发展NSCLC的高风险的有趣潜在标记。可以进一步推测,不表达COX-2的高级病变可能具有比那些更好的预后。然而,与组织学等级本身相比,描述性分析不能显示对高风险群体中肺癌风险的任何令人上瘾的价值。前瞻性研究应该证明是否存在从高级病变中的Cox-2表达中添加预测值。
基于目前的结果,显示高级病变中的COX-2表达,COX-2似乎是肺癌化学预防的潜在有希望的靶标。化学预防疗法的目标是2倍;为了促进已经表达COX-2的更具侵袭性细胞的回归,并禁止进展尚未表达COX-2。COX-2抑制剂还具有不同的COX-2独立抗癌性能27,28目前,一些正在进行的试验正在评估COX-2抑制剂在非小细胞肺癌化学预防中的作用。这些试验是基于在临床前动物模型研究中获得的数据12,13,29.- - - - - -32..然而,临床资料仍缺乏。目前的研究提供了更多关于COX-2在SQCC肿瘤发生中的信息,并提示COX-2抑制剂在肺癌的化学预防中可能具有潜在的前景。这些药物的风险与最近发现的COX-2抑制剂的长期心脏毒性有关,在考虑这些药物用于化学预防的临床实践之前,应该权衡它们的潜在优势,这需要它们使用多年。
总之,环氧氧酶-2,在鳞状细胞癌的早期肺癌期间增加了在几种肺癌发生途径中发挥关键作用的酶,并从高等症状预防病变中偏离低级病变。环加氧氧酶-2似乎是具有高阳性预测值的肺恶性肿瘤的潜在早期标记,尽管仍然需要进行前瞻性研究以证明组织学等级的潜在添加剂值。如果基于环加氧基酶-2抑制的化学预防是在未来的临床试验中进行的,则应认为环氧氧基酶-2应被认为是良好的中间点标记。
致谢
作者要感谢K. Willard-Gallo对手稿的批判性阅读。
- 收到了2005年1月5日。
- 接受2005年5月3日。
- ©ers Journals Ltd