摘要
内皮细胞粘附分子的上调,随后粒细胞和巨噬细胞的涌入,可导致劳力引起的骨骼肌损伤。本研究的目的是量化吸入阻力负荷(IRL)后横膈膜循环白细胞亚群、膈肌损伤和浸润性白细胞亚群、血管细胞粘附分子(VCAM)-1和细胞内粘附分子(ICAM)-1的表面表达。
8只新西兰大白兔接受1.5 h的IRL, 7只对照兔接受假手术。在基线和IRL或假手术后2、6、12、24、48和72小时采集的血液样本显示,在IRL后6小时带细胞计数增加。对IRL后72小时采集的苏木精和伊红染色横断面点数计数显示,与对照组相比,IRL家兔横膈膜损伤更严重。免疫组化处理显示ICAM-1和VCAM-1表达增加,IRL膈膜中粒细胞和巨噬细胞计数高于对照组。炎症细胞以巨噬细胞为主。
细胞内粘附分子-1和血管细胞粘附分子-1表达增加,粒细胞和巨噬细胞浸润可能是吸气阻力负荷诱导膈肌损伤的原因。
急性运动增加白细胞的循环池,其幅度是相对于运动的强度和持续时间1,2.循环非特异性免疫细胞的数量,包括将中性粒细胞的嗜中性粒细胞从边缘池中的循环中的循环中的循环,由胁迫激素等运动强度依赖性分泌介导,例如儿茶酚胺3.,皮质醇4,5和生长激素3.,4.通过运动诱导的血液力学的剪切力发生从边缘池中的中性粒细胞从边缘池中的嗜中性粒细胞介导的。皮质醇和各种细胞因子从骨髓中诱导早期释放中性粒细胞3.,这反映在力竭运动后带细胞的增加3.,4.
运动性肌肉损伤可由不习惯的运动引起,导致运动中和运动后肌纤维的结构破坏5.随后中性粒细胞浸润并释放肌细胞蛋白,如肌酸激酶(CK)和肌红蛋白进入循环4,5.耐力运动后,显著的全身中性粒细胞左移(反映带细胞增加)和中性粒细胞释放活性氧的能力增强已被证实,并与随后的CK外排呈正相关4,6,7.这表明在压力运动后,动员和灌注的中性粒细胞可能是劳动诱导的肌肉损伤的重要介质4.此外,一些研究人员最近指出,急性炎症指标是偏心运动后z线中断、心肌细胞蛋白释放和延迟发作肌肉酸痛的一种机制8- - - - - -10..
受伤肌肉中的局部炎症可包括补体激活,在白细胞和内皮上上调粘附分子表达,随后迁移,血液白细胞浸润到受影响的组织中9,11..白细胞按一定顺序选择性地募集到受损组织中11.涉及多种细胞粘附分子的联合作用,包括细胞内粘附分子(ICAM)-1和血管细胞粘附分子(VCAM)-1,它们分别与内皮细胞上表达的LFA-1和白细胞上表达的VLA-4结合12.,13..
与劳力引起的肢体肌肉损伤类似,在高强度吸气阻力负荷(IRL) 1.5小时后显示明显的膈肌损伤。14.,15..该动物模型的IRL为最大负荷的~ 60-70%,这可能与慢性阻塞性肺疾病(COPD)或哮喘患者在急性加重期间所经历的负荷相似。粘附分子的作用以及循环和肌内白细胞群的反应在这个模型中还没有被描述。本文提出的假设是,IRL诱导的膈肌损伤增加了循环白细胞,并上调内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达,促进中性粒细胞和巨噬细胞/单核细胞向损伤肌肉募集。本研究的目的是量化循环白细胞亚群、横膈膜中VCAM-1和ICAM-1的表达、浸润白细胞亚群和IRL后横膈膜损伤。
方法
英国哥伦比亚动物护理大学(加拿大)提供道德批准。该研究符合加拿大动物护理委员会的动物护理指南。研究了两组新西兰白兔3.5-4.5千克:IRL(n = 8)和控制(n = 7)组。
协议
前面已经描述了IRL的协议14.,15..简而言之,在静脉内麻醉和插管后,IRL兔在〜45cmh的气道开口压力下达到1.5小时2O,对照组兔在没有电阻负荷的情况下进行相同的程序。然后拔管,让兔子恢复。
在IRL(基线)的麻醉前在IRL(基线)的麻醉前进行取样(0.5ml样品),并且在IRL开始后的2,6,12,24,48和72h,以进行总和差异白细胞计数。总白细胞和差异包括带细胞计数,包括编码的赖特染色的涂片,观察者对组分配代码蒙蔽。
irl后72小时,对兔子实施安乐死。切除膈肌,切割,用异戊烷液氮冷冻,-70℃保存,用于组织学和免疫组化研究。
组织学和免疫组化研究
横膈膜切片用苏木精和伊红(H&E)染色以量化肌肉损伤。免疫组化处理:10 μm横切面横切面用丙酮固定10分钟。切片与最优稀释的一抗在室温下孵育1小时。本研究使用了以下小鼠抗兔抗体:RbM2(巨噬细胞/单核细胞抗体;稀释1:10 0;ICN Biomedical, Inc., Irvine, CA, USA);NP-5(中性粒细胞防御蛋白5;稀释1:50;Hycult Biotechnology,乌登,荷兰);t辅助淋巴细胞单克隆抗体(稀释1:12 00; Spring Valley Lab., Woodbine, MD, USA); monoclonal antibody to T-suppressor lymphocytes (dilution 1:400; Spring Valley Lab.); Rb 2/3 (ICAM, dilution 1:20); and Rb 1/9 (VCAM; dilution 1:25; both Rb 2/3 and Rb 1/9 were kind gifts from M. Cybulsky, University of Toronto, Toronto, Canada). After rinsing with TBS, the specimens were treated with rabbit anti-mouse IgG (1:20) for 30 min. Control sections were incubated with the nonspecific mouse IgG1.特异性结合检测由1:50单克隆小鼠碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物(DAKO,安大略,加拿大)孵育30分钟,然后用新的褐红色底物溶液。
横膈膜损伤、白细胞浸润和粘附分子的定量分析
编码所有肌肉横截面的幻灯片,因此观察者对组分配盲目。使用40×目的和附接到显微镜和数码相机的0.6×还原透镜,捕获为不同白细胞的H&E或特异性抗体处理的每种肌肉横截面的二十个图像。
通过使用图像Pro加软件(媒体周刊,银色春天,MD,USA),通过计算机点计数量计数H&E染色隔膜横截面量化膜片损伤。投影在H&E染色的横截面上的点被分配到正常膜片,异常膜片和结缔组织的类别,并且表示为如前所述对每只动物计数的总点的百分比14..
如前所述,用矩形无偏计数框叠加在图像上对标记的肌纤维内和间质白细胞进行计数16..排除血管内的标记细胞。计数架面积为0.0901 mm2并在每次会议开始时进行校准。每mm表达白细胞数2.
每毫米ICAM-1和vcam -1阳性的血管数量2计算,包括毛细血管大小一致的血管,在×400(40×物镜,10×目镜)的放大率下每个样品的隔膜横截面图像的15-20个横截面图像。还通过染色强度评估ICAM-1的表达17.: 0 =未着色;1 =温和;2 =温和;和3 =强。通过内皮染色量评估VCAM-1的程度18.: 0 =未着色;1 =≤25%的血管周长呈阳性;2 = 25-50%血管周长阳性;3 = 50-75%的血管周长为阳性;4 =≥75%的血管周长为阳性。
统计数据
ICAM-1和VCAM-1的染色强度被表示为中位数。所有其他数据都表示为平均值±SD..循环白细胞和差异数据采用双向重复测量方差分析。如果交互作用显著,单因素重复测量方差分析程序,然后是Tukey HSD事后测试,进行测试以确定每个级别的干预(控制或IRL)的从属变量上的效果19..通过独立样品T检验分析基团之间的隔膜白细胞浓度的差异。使用Mann-Whitney U-Test测试组之间的ICAM-1强度评分。
结果
膜损伤
光镜下h & e染色横膈膜断面检查显示IRL组横膈膜损伤,包括坏死的横膈膜纤维,纤维变性,坏死的横膈膜纤维和间质中有炎症细胞流入。点计数H&E截面显示,与对照组相比,IRL组膈肌异常面积分数高85%,膈肌结缔组织面积分数高36% (p<0.05;图1⇓).相反,IRL组正常膈肌面积分数显著小于对照组(p<0.05;图1⇓).
![图。1-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/26/5/786/F1.medium.gif)
吸气阻力负荷下正常膈肌、异常膈肌和结缔组织(CT)的面积分数□;N = 8)和控制(代码;N = 7)组。IRL组异常膈肌和CT的面积分数明显大于对照组。IRL组正常膈肌面积分数明显小于对照组。*: p < 0.05。
循环白细胞和亚群计数的变化
从基线到72小时,总循环白细胞浓度在不同组中没有随时间变化。然而,与基线相比,各组的粒细胞计数在第6和12小时时均增加(p<0.002;图2⇓。),此后减少到基线值。在跨组的6小时,带细胞计数较高,并从双向ANOVA中显示显着的相互作用。为了解释相互作用,对来自每组的频带小区数据进行单向重复测量ANOVA。与基线相比,在6小时后,在6小时后,带细胞在6小时内较高,然后在此后减少(P <0.001;图2⇓).在对照组中,带细胞计数没有随时间变化。随着时间的推移,不同组的单核细胞计数没有变化。
吸气阻力负荷(IRL;□;N = 8)和控制(代码;N = 7)组:a)总循环白细胞浓度随时间变化(组间无差异或随时间变化);B)循环粒细胞浓度随时间变化(在6和12 h时,两组循环粒细胞均较基线显著增加,#:P <0.002);c)循环单核细胞随时间循环的浓度(发现组或随时间之间的差异);而d)随时间循环带细胞(IRL组中的带细胞在6小时下显着增加,然后此后降低,***:P <0.001)。
VCAM-1和ICAM-1的表达
VCAM-1和ICAM-1的表达如图3所示⇓.
细胞内黏附分子(ICAM)-1强烈阳性(a),血管细胞黏附分子(VCAM)-1表达(b)。ICAM-1在对照组兔血管内皮上表达较弱(c),而VCAM-1在对照组横膈膜上表达不明显(d)。箭头表示横膈膜横截面上的血管。比例尺= 50µm
与对照组相比,IRL组ICAM-1阳性染色的每野血管计数趋于更高(表1)⇓)但趋势没有达到统计学意义。与对照值相比,IRL组在隔膜血管内皮血管内切割的ICAM-1染色强度增加(P <0.05,表2⇓).
与对照组相比,IRL组VCAM-1阳性染色的血管计数更高(p<0.05,表1)⇑).IRL组的8个IRL膈中有5个显示小静脉和静脉中vcam -1染色的内皮细胞。其余3个IRL和7个对照横膈膜均无VCAM-1阳性血管(表1)⇑和2⇑).五千il兔子呈正染色容器的计数范围为0.45-2.98艘船舶·mm−2.
IRL后膈肌炎症细胞浓度
巨噬细胞是IRL组膈膜的主要炎症细胞类型。与对照组相比,IRL组横膈膜上的巨噬细胞和中性粒细胞计数显著升高(p<0.05,图4)⇓).
吸气阻力负荷(IRL;□)或假(代码)。每毫米巨噬细胞和中性粒细胞计数2而IRL组膈肌的变化明显大于对照组。*: p < 0.05;* * *: p < 0.001。
讨论
本研究的独特发现是,IRL在兔体内诱导了循环带细胞的增加,这意味着骨髓刺激。负重后3天,膈血管内黏附分子ICAM-1和VCAM-1表达增加,并伴有巨噬细胞和中性粒细胞向损伤肌肉募集增加。这是第一个显示运动性膈肌损伤后炎症事件序列的研究,推测这些白细胞参与了阻力负荷后膈肌损伤。
在irl后6和12 h,所有动物的粒细胞增加,条带细胞计数增加;然而,不同组的总循环白细胞浓度没有随时间变化。伴随带细胞计数增加的循环中性粒细胞增加表明,骨髓释放是未成熟循环中性粒细胞的主要来源,此外还有边缘池的动员20..在粒细胞和带状细胞计数增加的情况下,IRL后总循环白细胞计数不变可能是由于淋巴细胞浓度下降。这一发现与之前在剧烈耐力运动后的发现一致21.,22..体育运动引起的短暂的外周血再分配的特点是在运动期间粒细胞增多伴淋巴细胞增多,接着是更明显的粒细胞增多伴淋巴细胞减少22..Wigernaes等.21.reported a continuous increase in neutrophils during active recovery with a fall in lymphocytes, which kept the total leukocytes constant at 120 min following a 60-min bout of uphill running at 83% of maximal oxygen uptake. In the present study, mononuclear cell counts tended to decrease in the IRL group at 6 h post-IRL compared with baseline, but the decrease did not reach a significant level, which could be due to the small change and small sample. Based on the means, variances and differences shown in the circulating mononuclear cells of the IRL group, a sample size of n = 45 would be required to achieve a power of 0.80 with a standardised difference of 0.83.
在对照手术和IRL后动员效果似乎是非特异性应力反应,可能是由应激激素的介导的,例如儿茶酚胺3.,23.和皮质醇4,5.然而,IRL后带细胞的显着增加是更具体的损伤而不是指示骨髓释放的应力反应23..肌束细胞释放可能与用力刺激引起的生长激素和细胞因子有关3.,4.已经显示剧烈的电阻呼吸诱导血浆白细胞介素(IL)-1β,IL-6和肿瘤坏死因子-α增加,这已被证明被抗氧化剂显着钝化24.,25..IL-6、IL-8和粒细胞集落刺激因子可能与骨髓储备中性粒细胞的延迟动员有关1,4.此前,IL-6和巨噬细胞集落刺激因子反应被证明与运动后中性粒细胞的活化呈正相关20..
在目前的研究中,发现通过小肌肉批量锻炼的吸气肌的电阻载荷改变了白细胞贩运。这与Nemet最近的报告一致等.26.他证明了10分钟的低强度单侧手腕屈曲运动可以增加炎症介质、生长因子和循环白细胞的浓度在控制组,而不仅仅是在运动组。他们得出结论,循环白细胞和炎症细胞因子的增加可能是由于对自主神经系统的刺激,而不是局部工作肌肉的刺激。
在本研究中,与马拉松运行后的报告相比,带状细胞增加的程度远低得多20..这可能是由于在IRL中招募的肌肉群相对于跑步要小得多。嗜中性粒细胞,特别是嗜中性粒细胞动员与剧烈运动强度呈正相关,运动百分比最大摄氧量反映了这一点,支持Suzuki的建议等等。4,20.工作量的大小可以是从骨髓储备的中性粒细胞动员量的决定簇。当前发现IRL后的较小循环的白细胞再分分配并不令人惊讶,因为吸气肌的小肌肉质量不会增加运动氧气吸收与马拉松跑步相同的程度。虽然在目前的研究中未测量氧气消耗,但分别在狗模型中的高中和中的IRL期间的氧气摄取分别为1.29-速度氧气摄取的1.17倍27..相比之下,全身锻炼在60%的最大氧摄取中估计持续氧气吸收的估计增加。
在本研究中,循环白细胞和粒细胞在运动刺激期间不增加的时间过程与其他运动刺激后的报道数据有所不同。麻醉2 h时,IRL刺激时循环白细胞未早期增加的主要原因可能是麻醉对中性粒细胞功能和动力学的抑制作用。硫喷妥钠是目前研究中使用的麻醉剂,在临床相关浓度下,硫喷妥钠以剂量依赖的方式降低人体中性粒细胞的趋化性28..目前作者实验室之前的工作表明,当用各种不同的药剂麻醉时,兔子的循环白细胞计数会降低(未发表的数据),这可能部分是由于麻醉引起的压力下降和循环儿茶酚胺导致肺毛细血管中性粒细胞边缘增加。虽然这些麻醉效果还没有发表,鲍克瑟等.29.发现β-拮抗剂普萘洛尔能在很大程度上(但不是完全)阻断肾上腺素介导的循环中性粒细胞增加。
本研究检测了该模型在irl后72 h横膈膜内ICAM-1和VCAM-1的表达和白细胞亚群的侵袭,基于之前的时间进程研究,表明运动刺激后3天肌肉损伤和炎症最严重30.- - - - - -34.其中一项研究显示,中性粒细胞和巨噬细胞在3天内达到峰值34..先前的IRL研究表明,在72小时后发生的明显膜片损伤伴随着隔膜中增加的炎症细胞14..白细胞-内皮细胞相互作用是导致炎症反应和细胞外渗的级联反应的早期步骤。有人提出,被广泛接受的范式支持粒细胞聚集到受损的横膈膜,炎症刺激激活这些血管的内皮细胞表达粘附分子和趋化因子,这在物理上参与循环白细胞并促进它们对这些血管的粘附。粘附分子ICAM-1和VCAM-1在炎症反应中正常表达并上调,或仅在炎症刺激激活的内皮细胞上表达35..
ICAM-1和VCAM-1在受伤隔膜中的强烈表达支持这些分子与白细胞之间的相互作用是激活白细胞迁移到发炎的膜片中的主要因素36.,37..正如预期的那样,在对照组的血管内皮中没有表达VCAM-1,但在IRL后观察到阳性染色。
IRL后膈肌中ICAM-1和VCAM-1表达增加的结果与其他类型运动和肌肉疾病后的报告相似。以前的研究表明,运动可以引起血浆中可溶性ICAM-1水平的增加12.,38..akimoto.等.12.测量了三种运动前后血浆中sICAM-1的浓度。在42公里跑或下坡跑后1天,血浆中sICAM-1的浓度显著增加,而高强度自行车运动对sICAM-1的血浆浓度没有影响。结论是,血浆中sICAM-1浓度只有在与肌肉损伤相关的运动后才会增加12..免疫组织病理学研究显示多发性肌炎和皮肌炎患者肌肉组织活检中内皮细胞和浸润细胞中ICAM-1和VCAM-1的表达上调39.,40,并伴有危重症、多发性神经病变和肌病18..VCAM-1的组织表达与肌肉损伤和多发性肌炎的发炎有关40.迄今为止,迄今为止,没有研究已经研究了IRL后隔膜中粘附分子在隔膜中的作用。
irl后72小时,横膈膜的主要炎症细胞类型为巨噬细胞。白细胞,最初是中性粒细胞,后来是单核细胞/巨噬细胞,在偏心运动后的肌肉损伤区域被发现10..中性粒细胞,第一种炎症细胞类型出现在受伤的肌肉中11.,34.,41.,被认为在受伤肌肉的损伤和再生中都有作用。虽然没有直接体内存在证据,已经假设中性粒细胞通过加剧初始损伤和/或通过释放自由基和蛋白酶来延缓肌肉再生延迟肌肉再生8.此外,中性粒细胞可以通过清除损伤区域的组织碎片促进肌肉再生通过吞噬作用42.并通过激活卫星细胞43..巨噬细胞在损伤后1-3天内浓度增加,被认为有助于肌肉再生11.,但也可能引起一些伤害。巨噬细胞对肌肉再生相关事件的有益贡献被归因于它们吞噬组织碎片的能力44.以及它们引起成肌细胞增殖的能力体外45..然而,当产生一氧化氮的能力受损时,巨噬细胞也有能力增加肌肉的损伤,一氧化氮是用来保护肌膜的46..
本研究中横膈膜中性粒细胞和巨噬细胞的升高与肌肉收缩延长后的其他观察结果一致47.,48.,电刺激收缩49.以及肌肉暴露在毒素或毒物中41.,42.,但与最近的其他报道相反50.,51..在这两个不同的报告中,一个描述了伸肌位数肌肉(EDL)肌肉响应原位延长收缩50.另一组研究了膜片对电阻性负载的响应51..Vassilakopoulos得出的明显不一致的结果等.51.实际上可能是对目前的研究的补充,并可以通过不同的时间课程来解释。这是Vassilakopoulos的研究等.51.在大鼠阻力负荷6h后,膈肌中未发现髓过氧化物酶活性增加,这可能表明中性粒细胞在循环中被招募,但直到6h后才进入膈肌。Lapointe等.50.得出结论,在延长收缩引起的明显损伤后,EDL肌肉中的嗜中性粒细胞不会显着升高。在这些其他两项研究中缺乏中性粒细胞流入的替代解释50.,51.与目前的研究相比,与用于检测中性粒细胞的技术中的种类和/或较小敏感性的差异可能与用于检测中性粒细胞的技术的差异有关。CD43,用于通过Lapointe定量中性粒细胞等.50.,可能是骨骼肌中标记中性粒细胞较不敏感的抗体48..此外,当使用二氨基苯扎定标记中性粒细胞时,发现它比使用NP-5标记中性粒细胞防御素的敏感性更低。二氨基苯扎定显示粒细胞的髓过氧化物酶含量。目前的研究也不同于一些自身免疫性肌肉疾病的报道,如多发性肌炎,其中大多数炎症细胞是t细胞。考虑到不同的病因,这并不奇怪52..
本研究中家兔所承受的IRL为最大负荷的60-70%;本组文献报道兔膈压最大可达~ 65 cmH2o在双侧膈神经刺激期间53..在临床相关性方面,这个负荷可能显得很高,但类似于IRL模型的负荷可能发生在哮喘患者急性支气管痉挛发作、COPD急性加重或机械通气患者脱机试验期间。病情稳定的重症COPD患者静息时膈肌激活增加,最大肌电均方根值为43%54.,在渐进式锻炼中增加到81%55..吸气阻力负荷后膈肌的炎症和损伤反应的一个主要临床后果是在当前组的早期研究中显示其力产生相关的35%的减少15..因此,在这些条件下调节炎症过程可能有助于预防或减少这些临床情况下一些潜在的隔膜损伤。
损伤和炎症响应隔膜的含量过载可能是适应和修复正常生理反应的一部分。事实上,炎症可能是加快最佳修复的必要条件,如啮齿动物的研究证明,显示出非甾体抗炎症的施用导致再生和部分修复后的肌肉交叉点较弱56..然而,如果隔膜损伤压倒了检测过程,则可能用类似于肢体肌肉损伤的重复菌株模型的结缔组织所取代受伤的肌细胞57..因此,在严重损伤反应的情况下,谨慎及时地给予消炎药以减少损伤,随后使用增加肌肉再生的药物可能会改善临床结果。
本研究的一个局限性是,可以观察到与炎症和损伤膈肌相关的ICAM-1和VCAM-1表达的增加,但没有检查其因果关系。未来的研究需要确定阻断这些粘附分子是否会减少隔膜损伤和/或力损失。第二个限制是每组动物数量少,IRL组显示vcam染色的内皮细胞差异很大,包括3只动物没有显示vcam染色的血管。VCAM表达的这种变化可能反映了除了IRL之外的其他触发因素,如低氧血症、高碳血症和/或由于IRL中固有纤维类型特征和吸气肌不同募集模式等因素导致的隔膜损伤易感性的个体差异。
总之,在本研究中,吸气阻力负荷使中性粒细胞随着带细胞计数的增加而进入循环,表明骨髓释放是循环中性粒细胞增加的主要原因。细胞内粘附分子-1和血管细胞粘附分子-1表面表达增加,中性粒细胞和巨噬细胞/单核细胞浸润增加,与吸气阻力负荷诱导的膈肌损伤相关,在该模型中可能介导肌肉损伤。
致谢
作者谨此感谢K. Quinlan为有价值的帮助和A. Scott提供技术援助。
- 收到了2004年9月8日。
- 接受2005年7月26日。
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