摘要
本研究试图在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中鉴定合适的内源性控制基因,用于实时RT-PCR。
采用定量RT-PCR方法分析了7种常见内源性控制基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、v-abl Abelson小鼠白血病病毒癌基因同源物1、β -2-微球蛋白、低黄质磷酸核糖转移酶1 (HPRT1)、磷酸甘油酸激酶1、肽基脯氨酸异构酶A和核糖体蛋白,大,P0)在18例异质性NSCLC肿瘤标本、10例正常肺组织和6株NSCLC细胞株中的表达。比较各对照基因在3个组织组和亚组的周期阈值(Ct)值的方差和相关系数。计算每个对照基因的Ct值与其余对照基因的平均Ct值之间的差值和相关系数。
GAPDH基因转录本方差最小,线性回归分析表明,GAPDH和HPRT在合并肿瘤和正常肺组织中相关性最强。GAPDH表达值与其余内源对照基因的平均表达值差异最小,相关性较强。
在7个常见的内源性控制基因中,甘油醛-3-磷酸脱氢酶最适合在非小细胞肺癌组织样本中进行定量RT-PCR反应。
肺癌是世界上男性和女性癌症死亡的主要原因1。每年死于肺癌的人比死于结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的总和还要多。台湾每年有近7000人死于肺癌2。尽管1995-2005年期间治疗取得了进展,但非小细胞肺癌(NSCLC)患者的长期生存率仍然很低。总体5年生存率仍然低于20%,因为大多数患者的病情已经进展到晚期3.。为了提高生存率,肺癌必须尽早发现。实时荧光定量PCR技术近年来被广泛应用于循环DNA的定量检测,用于肺癌早期诊断4。此外,定量PCR已用于肺癌的研究,以确定分子特征5,目的基因及其表达6,并预测预后7。然而,为了准确量化基因表达,将目的基因与一个或多个内源性控制基因并行扩增是一个关键问题。理想的内源性控制基因在所有组织样本、细胞、实验处理和设计中始终表现出相同的表达水平。不幸的是,这样一个通用的内源性控制基因也不存在8或者还没有被发现9- - - - - -14。因此,为实验设置选择的内源性对照基因的恒定表达需要在获得任何可靠数据之前进行测试和验证。一些报道已经验证了一个或多个适合在特定器官或组织中进行RT-PCR的内源性控制基因,如:白血病的Ableson基因15;蛋白激酶环单磷酸鸟苷(cGMP)依赖的1型(PGK1)对T细胞淋巴瘤和b细胞淋巴瘤均有效16;人酸性核糖体蛋白治疗肺结核17;18s rRNA和亲环素用于肾活检18;泛素B,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和结肠癌的翻译控制肿瘤蛋白19;热休克90kd蛋白1b,睾丸增强基因转录;以及治疗膀胱癌的腺苷三磷酸合酶19。
最近的肺癌研究使用了各种内源性控制基因,如GAPDH20.,β肌动蛋白21, tata结合蛋白22, 18 s rrna23还有苯丙氨酸羟化酶24,用于RT-PCR。然而,目前还没有内源性控制基因在肺癌和正常肺组织中得到验证。因此,本研究试图确定一种内源性控制基因,适用于研究涵盖不同阶段和类型的NSCLC肿瘤、正常肺组织和NSCLC细胞系的实验设计。采用定量RT-PCR检测7个常用内源性控制基因的表达水平。分析各基因间的方差及对照基因间的相关系数。
材料与方法
肿瘤组织和细胞系
原发肿瘤样本(n = 18)和相应的良性肺组织(n = 10)来自于2000年6月至2003年3月期间在中华民国桃园市忠宫纪念医院接受治愈性切除手术治疗的NSCLC患者(9男9女,年龄28-81岁,平均63±9岁)。腺癌14例,鳞状癌3例,大细胞癌1例(I期12例,II期2例,III期4例),正常肺组织10例。手术取出的样品立即冷冻在液氮中,并保存在−80°C直到使用。冷冻的手术标本被切片并安装在载玻片上。固定后用苏木精和伊红染色。其中两位作者仔细检查了切片的病理情况。在低倍和高倍显微镜放大镜下计算肿瘤样本中污染间质细胞的面积。基质细胞百分比为11.95±8.06(4 ~ 35%)。使用6种NSCLC细胞株:NCI-H23、NCI-H226、NCI-H460和NCI-H1299。这些资料来自蔡将军(台北退伍军人总医院,台湾,中华民国)。 Calu-1 was a generous gift from S.H. Liau (Chang Gung University TaoYuan, Taiwan, ROC) and NCI-A549 was obtained from Y.C. Liu (Chang Gung Memorial Hospital). All NSCLC cell lines were grown and propagated in Royal Park Memorial Institute medium-1640 supplemented with 10% foetal calf serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The study was approved by the ethical committees at the Chang Gung Memorial Hospital and informed consent was obtained from each patient.
RNA纯化和cDNA制备
根据制造商说明书,用Trizol试剂(Invitrogen, Carsbad, CA, USA)分离总RNA。用OD分光光度法测定总RNA含量260测量。第一链cDNA合成采用M-MLV逆转录酶法(Invitrogen)进行。8µg总RNA和足量总体积为21µL的焦碳酸二乙酯水在95°C下孵育5分钟。加入0.3µg·µL的2.74µL后−1随机引物,4µL 0.1 M二硫苏糖醇(DTT), 8µL 5×reverse-transcription (RT)缓冲液,1µL RNase-out 40 U·µL−12µL Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(200 U·µL−1),总体积为40 μ L, RNA混合物在37°C下孵育过夜。将cDNA按1:16稀释后用于RT-PCR。
rt - pcr
7个内源性控制基因(v-abl Abelson小鼠白血病病毒致癌基因同源物1 (ABL1;NM-007313), β -2-微球蛋白(B2M;次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1 (HPRT1;NM-000194), GAPDH (NM-002046), PGK1 (NM-000291),肽基脯氨酸异构酶A (PPIA;NM-021130)和大的核糖体蛋白P0 (RPLP0;NM-001002))在ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上采用5 '核酸酶技术,采用定量RT-PCR方法进行检测。探针序列用FAM®dye-MGB (Applied Biosystems)标记。HPRT1、PGK1、PPIA和RPLP0(应用生物系统公司)的特异性引物和探针是人类TaqMan®(应用生物系统公司)预先开发的内源对照或通过引物表达软件虚拟设计,以选择那些满足TaqMan®PCR要求的引物和探针。引物和探针设计的序列如表1所示⇓。
PCR反应的最终体积为25µL,最终浓度为1×TaqMan®Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems),浓度为400 nm·L−1分别为100 nm·L−1探针(TaqMan)。然后加入62.5 ng cDNA,按照以下循环参数对样品进行处理。热循环条件包括在50°C初始孵育2分钟,95°C孵育10分钟,然后在95°C变性15秒,在60°C退火和拉伸1分钟,循环40次。每次测量都重复进行,并确定阈值周期(Ct)。没有模板作为对照,在所有实验中都进行了四到五次cDNA混合物连续稀释的标准曲线。
统计分析
所有数据均使用标准计算机软件进行分析。对肿瘤亚组(腺癌和其他病理类型)的Ct值进行Levene检验和配对t检验进行方差相等的独立样本检验。相关性由皮尔逊检验确定。p值<0.001被认为具有统计学意义。
结果
7个内源性控制基因的可变表达
在NSCLC肿瘤、正常肺组织和NSCLC细胞系中,七个内源性控制基因的Ct值与平均Ct值的差异表达水平和离散度被确定(图1)⇓).数据以均数±表示sd。最低表达水平(最高Ct值(均数±sd)在NSCLC肿瘤中HPRT1基因(Ct = 26.87±0.93)表达最高,PPIA基因(Ct = 20.22±1.44)表达最高。正常肺组织中HPRT1基因表达量最低(Ct = 26.53±0.60),B2M基因表达量最高(Ct = 20.16±0.66)。NSCLC细胞系中表达量最低的ABL1基因(Ct = 23.51±1.38)和最高的PPIA基因(Ct = 17.43±0.66)(表2)⇓).除了B2M外,NSCLC细胞系中所有内源性控制基因的表达均高于肺肿瘤和正常肺组织。比较不同样本组各内源性对照基因Ct值的方差(表3)⇓).在NSCLC肿瘤中,GAPDH(0.71)的表达差异最小(n = 18),其次是RPLP0(0.76)。正常肺组织(n = 10)中变异最小的是HPRT1(0.36)或ABL1(0.36)的表达,其次是GAPDH(0.40)。在NSCLC细胞系(n = 6)中,RPLP0(0.75)的表达方差最小,其次是GAPDH(0.31)。然而,在NSCLC肿瘤和正常肺组织联合(n = 28)中观察到的最小方差是GAPDH的表达(0.59),其次是HPRT1(0.69)和RPLP0(0.71)。相反,B2M在肺肿瘤组织和正常肺组织中表达差异最大(2.17,表3)⇓).为了研究病理上不同的肿瘤是否影响全身变异,NSCLC肿瘤根据其组织病理学模式进一步分为两个亚组:腺癌(AD;N = 14),其余病理类型(3例鳞状细胞癌,1例大细胞癌)。GAPDH的表达在两个亚组中方差最小(0.67和0.57),B2M和PGK1的表达方差最大(1.69和2.57;表3⇓).总的来说,在7个内源控制基因中,GAPDH的表达方差最小,B2M的表达方差最大。亚组的变异对系统变异的影响最小。
内源性控制基因间的相关性
尽管NSCLC肿瘤样本、正常肺组织和NSCLC细胞系中内源性控制基因的表达水平不同,但一些内源性控制基因的表达呈强相关性(表4)⇓).在NSCLC肿瘤和正常肺组织中,GAPDH和HPRT1的相关性最强(r = 0.9328, p<0.0001)(图2)⇓表格4⇓)和NSCLC肿瘤和正常肺组织中内源性对照基因Ct值之间的差异(数据未显示)。然而,B2M的Ct值在肺肿瘤、正常肺组织、NSCLC细胞系以及合并的肺肿瘤和正常肺组织中与其他内源性控制基因的相关性较弱(表4)⇓).
Ct与平均Ct的线性回归和差值图
为了检验单个基因的表达是否能代表整个7个基因聚类的平均表达,每个内源性对照基因的Ct值与绘制肿瘤和正常肺组织样本中其余6个内源性控制基因的平均Ct图。然后计算肺癌、正常肺组织以及肿瘤和正常肺组织联合的相关系数(r-value)(表5)⇓).GAPDH的表达与肺癌组织(r = 0.8382, p<0.001)、正常肺组织(r = 0.9702, p<0.001)、合并肺癌与正常肺组织(r = 0.8605, p<0.001)具有较高的相关系数。GAPDH在NSCLC细胞系中的表达与其余6个内源性对照基因的平均Ct值呈弱相关(r = 0.77, p = 0.073,数据未显示),还计算了每个基因的Ct值与其余6个基因的平均Ct值的平均差值。平均差异是指每个内源性控制基因的表达量与其余基因的平均表达量之间的固定距离。显然,GAPDH表达的平均差异最小,即。其表达量与其余6个内源控制基因的平均表达量基本相等。最重要的是,精度(2×sd)表示每个内源控制基因的表达向其余基因的表达转移的程度。同样,在混合肺癌和正常肺组织中,GAPDH的表达与其他基因组合(95%的组织样本)的表达测量值最大偏差±0.47 Ct (PCR周期)(图3)⇓).
讨论
本研究的主要结果如下:1)GAPDH mRNA的表达在肺肿瘤和正常肺组织样本、腺癌和其他病理类型亚组中差异最小;2)在肺肿瘤和正常肺组织样本中,GAPDH mRNA表达与其他6种内源性对照基因mRNA表达均有很强的相关性(数据未显示);3)在肺肿瘤和正常肺组织样本中,GAPDH mRNA的表达与其余6个内源性对照基因的表达相关性最强;4) GAPDH mRNA的表达与其余6个内源性对照基因在合并肺肿瘤和正常肺组织样本中的平均差异最小,准确性最高。
本研究通过定量RT-PCR分析了7个常见内源性对照基因在NSCLC肿瘤、正常肺组织和NSCLC细胞系中的表达情况。总的来说,组织标本中这7个内源性控制基因的表达水平低于NSCLC细胞系(表2)⇑和3⇑).这种现象在白血病细胞系中也可见到16。细胞系中内源性控制基因高表达的一种可能机制是血清刺激影响几种常见内源性控制基因的表达25。这种现象的发生机制有待进一步研究。为了确定合适的内源性控制基因进行RNA数量归一化,我们采用了两个标准来选择最合适的内源性控制基因:1)NSCLC组织基因表达方差最小;2)在7个内源控制基因中表达相关性最强。
为了在NSCLC细胞系中选择最合适的内源性控制基因进行RT-PCR,应用了两个选择标准。在6种不同的NSCLC细胞系中评估了7种内源性对照基因的mRNA表达。RPLP0(0.13)和GAPDH(0.31)的表达在这些NSCLC细胞系中变异性最小。相关分析表明,RPLP0基因的Ct值与其余6个基因的大部分Ct值具有很强的相关性。GAPDH基因的Ct值与B2M、HPRT1、PGK1、RPLP0基因的Ct值相关性较强,与ABL1、PPIA基因的Ct值相关性较差(数据未显示)。RPLP0基因的Ct值与其余6个基因的平均Ct值的相关性最好(r = 0.8407)。RPLP0基因的准确性与GAPDH基因相同(0.84)。我们认为RPLP0基因是NSCLC细胞系中最适合的内源性控制基因。这一分析结果在其他细胞系中是兼容的,因为RPLP0基因最适合在B-和t细胞系中进行内源性控制16。
在肺肿瘤、正常肺组织组和NSCLC细胞系组中,基因GAPDH表达的方差第二低(0.72、0.40和0.31)。然而,在合并肺肿瘤组和正常肺组织组,GAPDH表达的方差最小(0.59)。GAPDH也是腺癌和其他病理类型亚组中方差最小的基因(表2)⇑和3⇑).GAPDH的表达在正常结肠上皮中表现出明显的变异性8,人前列腺癌26和正常的人类细胞27。然而,分析结果显示,GAPDH基因表达在合并的NSCLC肿瘤和正常肺组织中差异最小(表2)⇑).另外,B2M是组织相容性白细胞抗原(HLA) I类复合体的组成部分,是NSCLC肿瘤和NSCLC细胞系中受强烈影响的内源性控制基因。这一结果与B2M在不同淋巴瘤中的显著变化相吻合28,29。
方差表示偏离平均值的程度。有可能,一个表达Ct值方差最小的内源性控制基因与另一个内源性控制基因不一定有很好的相关性。用相关系数法分析只有不足之处。相关系数可能不适用于分析所测控制基因的表达稳定性,因为最低和最高表达水平之间的数据范围或任何离群值可能对回归线的斜率产生重大影响,从而对相关系数的值产生重大影响8。以GAPDH为例:通过绘制NSCLC肿瘤、正常肺组织、NSCLC细胞系和三组合并组织中每两个内源性控制基因之间表达水平的Ct值来进行线性回归测量。GAPDH与其他内源性控制基因具有明显的强相关性(表4)⇑).然而,在聚集的肺肿瘤、正常组织和肺癌细胞系中,GAPDH的Ct值方差并没有降低。这一发现是由于肺癌细胞系的Ct值位于回归线的左下角(数据未显示)。因此,本文作者通过绘制NSCLC肿瘤和正常肺组织中内源性控制基因表达水平的Ct值并计算其差异,进行方差分析和线性回归测量。数据显示,在汇总的NSCLC肿瘤和正常肺组织中,GAPDH的Ct值方差最小,并与其他内源性控制基因强相关(表2)⇑和3⇑,图2⇑).
GAPDH mRNA的表达也与β-actin mRNA和18S-rRNA在NSCLC中的表达进行了比较。结果表明,GAPDH mRNA表达差异最小(0.017),18S-rRNA表达差异次之(0.031),β-actin mRNA表达差异最大(0.4143)。GAPDH mRNA表达与18S-rRNA表达相关性最高,β-actin mRNA表达与18S-rRNA表达相关性较低(数据未显示)。虽然18S-rRNA的表达方差较小,但也有局限性16。18S-rRNA基因比大多数其他基因更稳定,受降解影响更小;它不表达为mRNA,因此限制了其作为内源性对照的使用。总的来说,当采用相同的方法(方差和相关)比较GAPDH mRNA、β-actin mRNA和18S-rRNA的表达时,GAPDH基因最适合作为NSCLC标本内部RNA质量和数量的控制基因。
安徒生等。19平均而言,多个基因的变异比单个基因的变异小。尽管如此,使用多个归一化基因,而不是单一基因,并不意味着改善归一化。在处理高通量的异质性临床样本时,选择一个适合内源性控制的单基因比选择多个基因更经济方便,从临床角度来说尤为重要。因此,为了选择一个可以替代多个基因测量的简单基因,目前的作者测试了每个单个内源性控制基因的表达与其余6个基因的平均表达之间的相关性。结果显示,在肺癌和正常肺组织中,GAPDH的表达与其他6个内源性控制基因的平均表达量密切相关(表5)⇑).GAPDH的平均差值(Ct-mean Ct)和正确率(2× 2)最低sd).在差异图中,±0.47个PCR循环(Ct)的准确度表明归一化可能仅相差1.5倍(20.48),用GAPDH的表达代替所有基因的平均表达。
总之,作者认为GAPDH是这7个基因中最适合在肺肿瘤和正常肺组织中控制RNA质量和数量的内源性控制基因。在临床实践中,当临床样本中只有少量RNA可用时(如。经显微解剖或针活检)且目标基因高表达,高表达的GAPDH适合作为内源性对照基因。或者,当感兴趣的基因具有中等或低表达时,或者在所有情况下,当有足够的细胞存在时,低拷贝的管理控制(例如,对于RNA分离效率、RNA质量和rt效率最佳,HPRT1)是GAPDH之后的选择。基于本研究结果,不同NSCLC样本中相关基因的表达应通过同时测量GAPDH基因产物来规范化,以消除或降低系统性偏倚。与先前发表的通过纯数学建模识别合适归一化基因的程序相比19,目前的方法提供了更直接的措施,考虑到样本子组之间的系统性差异,不那么繁琐。
作者认为,甘油醛-3-磷酸脱氢酶可以作为一种内源性控制基因,用于非小细胞肺癌肿瘤和正常肺组织样本的实时定量PCR基因表达研究。
- 收到了2005年4月25日
- 接受2005年8月22日。
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