文摘
越来越多的证据表明,巨噬细胞(Mφ)扮演重要downregulatory在过敏性哮喘的发生和发展中的作用。最近,当前作者表明,卵清蛋白(OVA))下载Mφ(OVA-Mφ)抑制后续OVA-induced呼吸道症状的哮喘和选择性激活时,这种效应可能会加强。在目前的研究中,作者进一步划定Mφ发挥免疫抑制效应的根本途径。
检查OVA-Mφ迁移,细胞被标记和5′二乙酸chloromethylfluorescein (CMFDA)和管理(注射。)OVA-sensitised BALB / c小鼠。20 h后,有关机关使用荧光显微镜解剖和分析。Allergen-specificity被治疗调查OVA-sensitised小鼠锁眼坚守岗位的血蓝蛋白(KLH) -Mφ激活免疫刺激性序列oligodeoxynucleotide (ISS-ODN)。之间通过延长周期4周治疗和挑战是检查是否OVA-Mφ施加一种免疫抑制记忆的反应。
引人注目的是,CMFDA-labelled Mφ没有困在肺部,但迁移到脾脏。ISS-ODN-stimulated KLH-Mφ未能抑制OVA-induced气管哮喘的表现。此外,治疗ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ后仍有效延长治疗和挑战之间的时期。
这些数据表明,allergen-loaded巨噬细胞可以引起间接免疫抑制反应有浓度过敏原特异性而持久的,这都是一个记忆淋巴细胞反应的特点。
过敏性哮喘的特点是可逆的气道阻塞,增加有浓度过敏原特异性免疫球蛋白(Ig) - e,慢性气道炎症和气道的持续代(AHR)。过敏性哮喘的持久性和维护由长期记忆t细胞激活的一个子集1,2。免疫内稳态的维持呼吸道需要微调的t细胞活化,以产生足够的炎症反应对吸入病原体,同时避免过度反应。越来越多的证据表明,巨噬细胞(Mφ)发挥关键作用的增强作用和抑制炎症反应3。
Mφ触发免疫反应对微生物病原体分泌促炎细胞因子,如白介素1 (IL)、白介素和肿瘤坏死因子(TNF) -α4,5。此外,可以通过释放il - 12他们可以专门斜向辅助免疫反应细胞类型1 (Th1)反应6- - - - - -8。尽管MφTh1反应的诱导9,10,它也表明,Mφ可以向Th2淋巴细胞诱导分化11,12。发挥免疫抑制反应Mφ分泌抗炎介质,如前列腺素(PG) E2转化生长因子(TGF) -β,il - 10和一氧化氮3,5,13。
肺泡Mφ代表最主要的免疫效应细胞的肺泡空间和开展航空公司3。通过分泌促炎细胞因子和趋化因子肺泡Mφ直接招聘和激活炎症细胞,同时也发挥了重要的作用,它能抑制免疫反应对非病原的抗原5,14。肺泡Mφ可以抑制t淋巴球增生在体外15,16和抗原呈递功能的树突状细胞在体外和在活的有机体内17。虽然损耗肺泡Mφ强IgE抗体生产针对吸入过敏原18和肺泡Mφ抑制AHR过继转移19,底层的细胞和分子机制还有待阐明3。
以前,当前作者发明了一个小鼠模型中allergen-loaded Mφ抑制allergen-induced呼吸道症状20.。Mφ的抗炎效应可能会激活与选择性Mφtoll样受体(TLR) 9或4配体免疫刺激性序列oligodeoxynucleotide (ISS-ODN)和脂多糖(LPS),分别体外21。有趣的是,il - 10在这些激活Mφ调节和Mφ的抗炎作用中扮演着关键角色在活的有机体内21。在这项研究中,这些抗炎作用的机制更加仔细的研究。引人注目的是,在政府(注射。),allergen-loaded Mφ迁移到脾脏。因此,作者调查Mφ是否诱导,在脾脏,间接有浓度过敏原特异性和长期抑制的反应。
方法
动物
动物保健和使用进行按照荷兰动物实验委员会的指导方针。特定的无菌(根据欧洲实验室动物科学协会联合会22)雄性BALB / c小鼠(6周)购买的查尔斯河(马斯特里赫特、荷兰)。老鼠被安置在层流内阁macrolon笼子。所有的老鼠都提供食物和水随意。
材料
卵子(V级),净化有限合伙人大肠杆菌0111:B4,醋甲胆碱(氯化acetyl-β-methylcholine)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。锁眼坚守岗位的血蓝蛋白(KLH)获得Calbiochem(美国圣地亚哥,CA)。荧光染料5′二乙酸chloromethylfluorescein (CMFDA)从分子探针获得欧洲BV(荷兰莱顿)。CpG-containing phosphorothioate ISS-ODN被等基因合成生物科学BV (Maarsen、荷兰)。已经使用的ISS-ODN序列5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3′23。
加载和刺激的巨噬细胞
从天真的BALB / c小鼠腹膜Mφ如前所述20.。随后,1×107Mφ·毫升−1装有2 mg·毫升−1卵巢或2 mg·毫升−1KLH刺激µg·10毫升−1有限合伙人或3µg·毫升−1ISS-ODN21。孵化后3 h在37°C和5%的公司2广泛,Mφ清洗去除所有剩余可溶性卵子,有限合伙人,ISS-ODN。
敏化作用、治疗和挑战
老鼠卵子的敏感与7活跃的敏化作用i.p。在0.5毫升注射10µg卵子pyrogen-free盐水隔天24。治疗后17天过去执行由管理局(敏化作用注射。)的3×105Mφ(OVA-loaded或KLH-loaded)在50µl盐水。作为额外的对照组,老鼠注射。50µl注射生理盐水。1 - 4周后治疗后,小鼠暴露于卵巢(2 mg·毫升−1生理盐水)气溶胶挑战5分钟连续八天。
巨噬细胞的荧光标签和本地化
总共1×107Mφ·毫升−1装有卵子(2 mg·毫升−1与ISS-ODN(3)和刺激µg·毫升−1)3 h在37°C和5%的公司2。在最后30分钟,10µM CMFDA添加到Mφ,Mφ被广泛洗。为了测试标签效率,1×105CMFDA-labelled Mφ·毫升−196年培养,圆底板块(他一一Bio-One GmbH, Kremsmuenster,奥地利)在罗斯威尔公园纪念研究所1640年中期富含2%胎牛血清,青霉素和链霉素(所有GIBCO BAL英杰公司分工,布雷达,荷兰)和50µMβ-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)。经过20 h, Mφ收获和cytospins Mφ使用荧光显微镜进行分析。随后,OVA-sensitised小鼠治疗(注射。),3×105Mφ。20 h后,血、肺、脾、淋巴结(腋窝、臂、胸),肝脏和肾脏收集。几6-µm厚cryosections使用荧光显微镜的组织进行了分析。
气道反应性测量在活的有机体内
气道反应性测定在有意识的,放纵的老鼠使用气压全身体积描记法通过记录呼吸压力曲线(Buxco corp . EMKA技术,巴黎,法国)为了应对吸入乙酰甲胆碱(从0-50 mg·毫升−1醋甲胆碱)。气道反应性增强的停顿(金边)表示,如前所述25。
ovalbumin-specific测定血清中免疫球蛋白e的水平
经过测量的在活的有机体内气道反应性,老鼠牺牲注射1毫升10%氨基甲酸乙酯(i.p。Sigma-Aldrich)。老鼠被心脏穿刺流血。随后,血清收集和储存在−70°C到分析。血清OVA-specific IgE测量如前所述26。通过参考标准i.p。免疫的小鼠卵子和任意分配一个值为1000的实验单位·毫升−1(欧盟·毫升−1)。欧盟IgE ELISA检测水平为0.5毫升−1IgE。
支气管肺泡灌洗液中细胞成分的分析
支气管肺泡灌洗(BAL)后立即进行洗胃出血的老鼠的航空公司通过气管插管1毫升生理盐水(37°C)包含2µg·毫升−1aprotinine(罗氏诊断,Almere、荷兰)和5%的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)。上层清液中细胞因子的第一个毫升的液体(BALF) ELISA测定。随后,小鼠灌洗一共有四次1毫升生理盐水(37°C)。BALF细胞都汇集在寒冷的磷酸盐(包括那些从第一个毫升)。随后,BALF细胞分化成单核细胞(单核细胞、Mφ和淋巴细胞),嗜酸性粒细胞,中性粒细胞如前所述26。
细胞因子elisa
位于莱茵河畔IL-5 ELISA (BD PharMingen,荷兰)执行根据制造商的指示。的检测极限IL-5 ELISA是pg·10毫升−1。
统计分析
所有数据都表示为±扫描电镜。醋甲胆碱在统计学上的气道剂量反应曲线的一般线性模型分析了重复测量紧随其后事后对比组。数据日志转换之前分析在所有组均分差异。统计分析BALF细胞计数都使用了非参数Mann-Whitney u测验(2-tailed)。对ELISA,结果统计分析用t检验(2-tailed同方差的)。结果被认为是p < 0.05的显著水平。
结果
Allergen-loaded巨噬细胞迁移到脾脏
Allergen-loaded Mφ抑制抗炎反应过敏性哮喘小鼠模型20.,21。以获得更多的信息在底层机制、本地化后OVA-Mφ管理局(注射。)检查。腹膜Mφ都装有卵子与ISS-ODN (OVA-Mφ)和刺激。随后这些Mφ与荧光染料CMFDA贴上标签。
控制,CMFDA-labelled OVA-Mφ培养20 h在37°C和5%的公司2和标签的效率进行了分析。如图1所示⇓)和b), 20 h桁标签> 95%的Mφ仍荧光。
免疫刺激性序列oligodeoxynucleotide (ISS-ODN)刺激卵清蛋白(OVA)巨噬细胞(Mφ)迁移到脾脏。ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ贴上了5′二乙酸chloromethylfluorescein (CMFDA)。控制,未标记的Mφ和CMFDA-labelled Mφ培养20 h在37°C和5%的公司2随后,cytospins未标记的Mφ(a)和CMFDA-labelled Mφ(b)为标签效率进行分析。OVA-sensitised小鼠治疗(注射。)与CMFDA-labelled Mφ(n = 6;c、e和f)或生理盐水(n = 3 d)。经过20 h,肺(c)和脾脏(d, e, f)解剖和分析。mz:边缘区。
此外,OVA-sensitised小鼠治疗(注射。),3×105CMFDA-labelled OVA-Mφ。20 h后,血、肺、脾、淋巴结(腋窝、臂、胸),肝脏和肾脏是解剖和分析存在的CMFDA-labelled Mφ。分析不同组织,没有CMFDA-labelled OVA-Mφ被发现在整个肺(图1 c⇑),而标签Mφ显然是d-f检测脾(图。1⇑)。与苏木精染色(图中未显示)显示大部分(∼90%)CMFDA-labelled Mφ在脾脏的边际区域本地化。没有CMFDA-labelled Mφ检测在血液或其他组织进行了分析,包括主要的间隙网站;肝脏和肾脏(数据没有显示)。
自OVA-Mφ迁移到脾,提出这些Μφ可以完成一个间接抑制的效果,很可能由感应有浓度过敏原特异性记忆淋巴细胞。
一个有浓度过敏原特异性抑制Allergen-loaded巨噬细胞诱导
治疗了Allergen-specificity OVA-sensitised老鼠ISS-ODN-stimulated和KLH-loaded Mφ。sham-treated老鼠,气道反应增加乙酰甲胆碱的浓度(1.6 -50 mg·毫升−1)明显增加(p < 0.05)在卵巢吸入的挑战。作为一个例子50 mg·毫升气道高反应−1醋甲胆碱是如图2所示⇓。作为与sham-treated老鼠相比,气道高反应性的增加显著(p < 0.05;40%)抑制在治疗ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ(图2⇓)。相比之下,ISS-ODN-stimulated KLH-Mφ未能气道高反应性抑制乙酰甲胆碱(图2⇓)。
Allergen-loaded巨噬细胞(Mφ)产生一个有浓度过敏原特异性免疫抑制反应。前卵白蛋白(OVA)挑战,OVA-sensitised小鼠治疗(注射。),盐(假的),免疫刺激性序列oligodeoxynucleotide (ISS-ODN)刺激OVA-Mφ(ISS-ODN / OVA-Mφ),或ISS-ODN-stimulated锁眼坚守岗位的血蓝蛋白(KLH) -Mφ(ISS-ODN / KLH-Mφ)。)对气道高反应的aerosolised醋甲胆碱测量之前(□)和之后(▒)卵子吸入挑战(表达增强暂停:金边)。醋甲胆碱剂量响应曲线为代表的团体,50 mg·毫升的响应−1醋甲胆碱被描述。b)血清OVA-specific免疫球蛋白(Ig) E水平(□)之前和之后(▒)的挑战。嗜酸性粒细胞的数量(□),中性粒细胞(▪)和单核细胞(░)c)支气管肺泡灌洗液(BALF)和d)白介素(IL) 5级后的BALF卵子的挑战。值表示为均值±扫描电镜每组(n = 6 - 8)。欧盟:试点。#:p < 0.05同比小鼠卵子之前的挑战。* *:*:p < 0.05和p < 0.01相比sham-treated和OVA-challenged老鼠。¶:p < 0.05+:与小鼠相比p < 0.01处理ISS-ODN / KLH-Mφ和OVA-challenged。
此外,分析血清OVA-specific IgE水平证明了OVA-specific IgE水平大幅度增加在挑战sham-treated老鼠(图2 b⇑)。ISS-ODN-stimulated KLH-Mφ并不能够抑制upregulation OVA-specific IgE(图2 b⇑)。控制,ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ镇压的upregulation OVA-specific IgE为68% (p < 0.01),与sham-treated老鼠相比(图2 b⇑)。
同意这些结果,ISS-ODN-stimulated KLH-Mφ既未能抑制气道嗜酸性粒细胞和BALF IL-5水平(图2摄氏度⇑和d),而ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ显著(p < 0.05),抑制这些哮喘症状(分别与sham-treated老鼠相比,89%和83%)。
激活ovalbumin-macrophage产生持久的免疫抑制效果
Mφ之间通过延长时间治疗和卵子吸入挑战从1到4周,可以调查是否allergen-loaded Mφ诱导记忆抑制的影响。OVA-sensitised老鼠OVA-Mφ对待,LPS-stimulated OVA-Mφ,或ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ。4周后小鼠卵子挑战吸入(8天),随后,增加气道反应乙酰甲胆碱测量。sham-treated小鼠气道反应乙酰甲胆碱浓度增加(1.6 -25 mg·毫升−1)明显增加(p < 0.01)在卵巢吸入的挑战。作为一个例子25 mg·毫升气道高反应−1醋甲胆碱是如图3所示⇓。四周后间隔治疗和挑战,如。短期区间后,ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ显著(p < 0.05)抑制气道高反应性的48%,比sham-treated老鼠(图3⇓)。
巨噬细胞免疫刺激性序列oligodeoxynucleotide (ISS-ODN)刺激卵清蛋白(OVA-Mφ;ISS-ODN / OVA-Mφ)引起的长期免疫抑制反应。OVA-sensitised小鼠治疗(注射。)和生理盐水(假)、OVA-MφISS-ODN / OVA-Mφ或脂多糖(LPS)刺激OVA-Mφ(有限合伙人/ OVA-Mφ)。4周后,这些老鼠卵子吸入的挑战。)对气道高反应的aerosolised醋甲胆碱测量之前(□)和之后(▒)卵子吸入的挑战。醋甲胆碱剂量响应曲线为代表的团体,应对25 mg·毫升−1醋甲胆碱被描述。b) OVA-specific血清中免疫球蛋白水平(Ig) E(□)之前和之后(▒)的挑战。c)的嗜酸性粒细胞数量(□),中性粒细胞(▪)和单核细胞(░)支气管肺泡灌洗液(BALF)后卵子的挑战。d)白介素(IL) 5级后的BALF卵子的挑战。值表示为均值±扫描电镜每组(n = 6 - 8)。欧盟:实验单位。¶:p < 0.05#:p < 0.01同比小鼠卵子之前挑战;* *:*:p < 0.05和p < 0.01相比sham-treated和OVA-challenged老鼠。
经过长期治疗的时间间隔和挑战,OVA-Mφ强烈抑制(75%,p < 0.05)的upregulation血清OVA-specific IgE水平(图3 b⇑)。体外刺激OVA-Mφ有限合伙人或ISS-ODN没有进一步抑制这些OVA-specific IgE水平(图3 b⇑)。
此外,经过长期治疗的时间间隔和挑战ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ抑制显著(p < 0.05)为82%,嗜酸性粒细胞进入肺部的涌入而sham-treated老鼠(图3 c⇑)。与嗜酸性粒细胞的数量相关,BALF IL-5水平显著低下(81%,p < 0.01),治疗后ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ(图3 d⇑)。LPS-stimulated OVA-Mφ未能抑制气道嗜酸性粒细胞但抑制显著(p < 0.05)水平IL-5 BALF的51%,相比之下,虚假治疗(图3 d⇑)。
讨论
尽管建议Mφ激活发挥关键作用,以及抑制过敏性哮喘,他们发挥这些功能的机制仍在争论3。以前,当前作者证明allergen-loaded Mφ抑制抗炎反应过敏性哮喘小鼠模型20.,21。当前的研究表明,allergen-loaded Mφ迁移到脾脏和诱导,在当地,一个有浓度过敏原特异性和持久的免疫抑制反应,记忆淋巴细胞反应的典型特征。
使用动物模型的过敏性哮喘,有人建议Mφ可以施加直接影响免疫内稳态的航空公司。损耗的肺泡MφIgE反应增加18和肺泡Mφ废除AHR过继转移19。最近,Pynaertet al。27显示脾Mφ,装有卵子和intratracheal-administered,抑制气道嗜酸性粒细胞,可能通过诱导肺Th1-mediated计数器的监管8,27。相比之下,在目前的研究中获得的证据是间接的机制Mφ可以抑制抗炎反应肺。
使用CMFDA-labelled Mφ,观察到静脉注射Mφ没有困在肺部,但迁移到脾脏。二十小时后治疗,CMFDA-labelled Mφ只可检测脾,虽然没有CMFDA-labelled Mφ被发现在肺部或淋巴结。这是在协议的归航intravenous-administered Mφ和树突细胞生成体外暂时迁移到肺部(在2 - 3 h)其次是积累在脾脏和几乎没有淋巴结28- - - - - -31日。此外,> 95%的interferon-γ-stimulated Mφ到达后5小时内脾脏注射。注入,而检测不到3%在肺组织(个人沟通:Pynaert和J。Grooten,部分子生物医学研究,根特,比利时根特大学)。在脾脏的积累allergen-loaded Mφ表明Mφ诱导,在当地,一个间接免疫抑制效果。额外的发现allergen-loaded Mφ引起一个有浓度过敏原特异性和持久的抑制反应显然表明有浓度过敏原特异性抑制淋巴细胞诱导的脾脏。然而,它不能完全排除肺部的少量Mφ还负责抑制t细胞的诱导。Mφ必须被激活,产生高水平的il - 10,反过来,抑制OVA-induced气道炎症是至关重要的21。自从OVA-induced气道炎症抑制甚至4周后注射。Mφ管理,而是假设,他们仍然会产生高水平的il - 10在这个时候,目前的数据支持的角色有浓度过敏原特异性抑制淋巴细胞诱导allergen-loaded Mφ脾脏。此外,donor-Mφ-derived il - 10的关键作用21不建议居民Mφ应对死亡或凋亡的作用管理allergen-loaded Mφ。
观察治疗后与allergen-loaded Mφ,微分的影响依赖于检测参数(图3所示⇑)。这是在协议与以前的观测21。ISS-ODN-stimulated OVA-Mφ更有效地抑制气道炎症与如果OVA-Mφ或LPS-stimulated OVA-Mφ。这表明,激活与ISS-ODN需要一个有效的诱导OVA-Mφ有浓度过敏原特异性抑制淋巴细胞的脾脏。的激活Mφ不需要抑制血清OVA-specific IgE水平(图。3⇑),它可以推测allergen-loaded Mφ抑制allergen-induced呼吸道症状通过至少两种不同机制的哪一个是依赖于il - 10的21。OVA-induced测量气道高反应使用金边的方法,作者想规定,金边值可能不与肺阻力的变化32。
最可能涉及一个t细胞子集,il - 10生产OVA-MφOVA-specific t细胞识别在体外是依赖主要组织相容性复合体II级/ t细胞受体的相互作用20.。过敏原吸入后,抑制t淋巴球子集将allergen-specifically激活(图2所示⇑),从而抑制了Th2-lymphocyte介导气道高反应性气道炎症和过敏。这些数据表明,治疗allergen-loaded Mφ可以用来抑制气道炎症有浓度过敏原特异性的方式。因此,免疫系统仍在治疗功能,能够应对入侵者。这表明,敏感的病人多气源性致敏原可能需要与每个过敏原Mφ-based治疗,同时或连续。然而,它已经表明,多个疫苗不成熟或不成熟的抗原递呈细胞会产生毒性33。
虽然还有待阐明的抑制T细胞子集,调节性T细胞(Treg)可能是引起allergen-loaded Mφ。Treg细胞通常在微环境诱导与当地高水平的il - 10和现在外来抗原的抗原呈递细胞。重要的是,Treg表型细胞抗原和记忆34。Antigen-induced Treg细胞发挥着至关重要的作用在维护针对外来抗原的t细胞耐受。这个展览其抑制t细胞子集活动通过分泌抑制细胞因子il - 10(1型Treg细胞)或TGF-β(Th3细胞)35。研究,利用过敏性哮喘小鼠模型,证明有浓度过敏原特异性Treg细胞可以调解allergen-induced呼吸道症状的抑制36- - - - - -38。在当前研究的模型后的BALF中il - 10的水平没有增加Mφ-treatment和随后OVA-inhalation挑战被发现(数据未显示)。这表明OVA-Mφ诱导suppressor-lymphocyte子集1型Treg细胞。
在脾脏的本地化allergen-loaded Mφ进一步支持这一概念,Treg细胞诱导。尽管一些CMFDA-labelled Mφ在t细胞检测区域,大多数(∼90%)CMFDA-labelled Mφ在脾脏的边际区域本地化。以前,这是证明在脾脏边缘区抗原呈递Mφ,连同边缘区b细胞和自然杀伤t细胞可能分泌抑制细胞因子il - 10和TGF-β等,创造一个能够引起抗原Treg细胞的微环境39,40。在当前研究的模型中,ISS-ODN-stimulated Mφ迁移到脾脏和现在的边缘地带,在那里,淋巴细胞的过敏原。因为这些Mφ产生高水平的il - 1021,它可以提出,创建了一个微环境有浓度过敏原特异性Treg细胞可以诱导。实验中从tolerised小鼠脾细胞转移到敏感受体小鼠的进步建立suppressor-lymphocyte子集是诱导在互动allergen-loaded Mφ。
在一起,这是证明allergen-loaded巨噬细胞能诱导,除了直接的抑制,间接抑制呼吸道症状的哮喘小鼠模型。可以推测的是allergen-loaded巨噬细胞迁移到脾脏和现在,本地,过敏原免疫系统分泌白细胞介素- 10”。这将导致一个微环境诱导一个有浓度过敏原特异性和持久的免疫抑制反应。effector-phase期间,这种免疫抑制反应抑制allergen-induced呼吸道症状。巨噬细胞在哮喘病理一般和特定的内存macrophage-induced免疫抑制反应的重要性哮喘症状可能会导致新策略来产生稳定的抑制有浓度过敏原特异性辅助2型反应。
确认
作者想感谢硕士Bloksma热情支持和建议。
- 收到了2004年7月29日。
- 接受8月2日,2005年。
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