抽象的GydF4y2Ba
闭塞性细支气管炎是一种以炎症、上皮损伤、纤维增生和细支气管闭塞为特征的疾病,可导致气流阻塞,这限制了肺移植的长期存活。为探讨支气管上皮在闭塞性毛细支气管炎发病机制中的作用,本研究旨在从肺移植物中建立原代支气管上皮细胞培养(PBEC)。GydF4y2Ba
从肺同种异体移植物的亚段支气管获得了四到六个支气管刷。将细胞接种到胶原涂层的平板上,并在支气管上皮生长培养基中生长至汇合。GydF4y2Ba
27例患者33例支气管刷。在33个刷子中,有12个(39%)被培养成聚合的PBECs。未能达到汇合点是由于早期先天感染。细菌通常从支气管肺泡灌洗液和培养基中分离出来,但仅在培养基中鉴定出一个单独的群体。GydF4y2Ba
尽管早期,患者衍生的感染率高,但肺移植受者的支气管上皮细胞的原发性培养是可行的。同种异体移植物的潜在感染,仅通过支气管胶带鉴定,本身可以是对上皮损伤的持续刺激。该技术有助于在湮灭支气管炎的发病机制中的气道上皮反应的未来机械研究。GydF4y2Ba
肺移植是一个被接受的策略管理终末期肺病精心挑选的患者GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.虽然肺移植后的早期预后已经改善,但肺移植受者的长期生存受到闭塞性细支气管炎综合征(BOS)的发展的限制。BOS临床表现为进行性气流阻塞,导致不可逆、固定、小气道阻塞和过早死亡,尽管应用了当前的治疗策略GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba.目前,肺移植后5年>存活的患者中有50%的>受BOS影响,7年生存率仅为31%GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
BOS的组织学病变是闭塞性细支气管炎(BO),其特征在于周围细支气管白细胞浸润,与后异常,旺盛上皮 - 间质(成纤维细胞)以修复成纤维增殖响应相关联。通过胶原基质沉积导致呼吸支气管的腔缺失GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
最近,肺病发病机制中存在重大范式转变。这使得在肺纤维化的发展中的临界位置进行了临界位置的上皮,并疤痕(GydF4y2BaIE。GydF4y2Ba成纤维细胞灶的上皮起源)GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba和哮喘(上皮 - 间充质相互作用,哮喘的亚上皮纤维化和气道重塑的发病机制)GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba.在肺移植中,越来越认识到,对支气管上皮损伤的共同途径反应,GydF4y2Ba通过GydF4y2Ba异种免疫依赖性和独立机制的组合,导致上皮激活,过度上皮 - 间充质纤维束修复反应及后期发育BOSGydF4y2Ba11GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
在Bos中注意到上皮激活,如人白细胞抗原(HLA)II类抗原(HLA-DR和HLA-DP)的增加所反映的GydF4y2Ba12GydF4y2Ba-GydF4y2Ba14GydF4y2Ba随着用于共刺激分子,CD80和CD86的MRNA转录物的表达增加,对来自BOS患者的支气管上皮细胞GydF4y2Ba15GydF4y2Ba.在BOS患者中,气道上皮诱导型一氧化氮(NO)合酶表达增加,与呼出NO水平升高相关,这与气道中性粒细胞相关GydF4y2Ba16GydF4y2Ba.中性粒细胞菌和升高的中性粒细胞化疗引诱剂,例如白细胞介素-8和rantes(对激活,正常的T细胞表达和分泌)是博的特征GydF4y2Ba16GydF4y2Ba-GydF4y2Ba18GydF4y2Ba.支气管上皮是一种良好认可的细胞因子,趋化因子和生长因子来源,其可能有助于炎症细胞招生和激活,以及博的气道重塑过程GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba.上皮和底层间充质层之间的紧密空间关系形成了一个完整的单位,称为上皮间充质营养单位(EMTU)。GydF4y2Ba10GydF4y2Ba,这在胎儿肺部发育中的分支形态发生时起着枢转作用GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba并且涉及通过上皮细胞和肌肉成纤维细胞释放生长因子和细胞因子GydF4y2Ba10GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
与薄层网上上皮胶原和其他基质蛋白的增加相关的Bo上皮激活增加的证据表明,EMTU可以在该疾病中重新激活,导致形态发生机制的再活化,具有疑难的上皮 - 间充质信号和所述气道墙体结构变化的诱导GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
因此,作者认为支气管上皮在BOS的发展中起着关键作用,它既是损伤的靶点,也是通过损伤反应的疾病过程的媒介。本研究的目的是建立和描述一种原代支气管上皮细胞培养方法,以促进上皮细胞反应的未来研究GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba在博斯的发病机制中。GydF4y2Ba
方法GydF4y2Ba
该研究符合当地研究伦理委员会的道德批准,并从所有研究患者那里获得知情同意。GydF4y2Ba
耐心GydF4y2Ba
所有患者均接受肺功能测试,并根据标准化标准评估BOS状态GydF4y2Ba21GydF4y2Ba.从经历支气管镜检查的27个连续的肺移植接受者获得支气管刷(n = 33)。进行中叶/菱形的支气管肺泡灌洗(BAL),并送常规微生物学评估和跨刻度活组织检查,以基于标准国际心脏和肺移植标准排除急性血管抑制作用GydF4y2Ba22GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
患者包括10个单肺移植,16个双侧肺移植和1个心肺移植。移植的适应症包括囊性纤维化(CF)(N = 15),肺气肿(n = 11)和肺纤维化(n = 1)。12名患者是女性和15名男性,平均年龄为39岁(16-59级)。支气管镜检查在移植27周(范围1-120)的平均时间进行。支气管镜检查的适应症是咳嗽/呼吸呼吸困难和/或肺功能下降的症状,并且在剩余的29个受试者中作为常规监测程序。只有一名患者在支气管镜检查时建立了博斯。患者免疫抑制制度包括泼尼松龙,环孢菌素和氮杂唑作为常规,随着临床过程的替代Tacolimus和/或Mycophenalate Mofetil。该研究中没有患者在免疫抑制性上具有“抗增殖”性质,例如everolimus或雷帕霉素。此外,在研究时没有患者在大环内德抗生素(阿奇霉素)上。GydF4y2Ba
患者细节总结在表1中GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
研究患者的特征GydF4y2Ba
病人微生物预防GydF4y2Ba
采用移植计划中的预防策略包括用于研究患者的移植计划:1)基于预移植前和供体微生物学的移植后患者移植后的氟氯苄虫/甲状腺唑/雾化结肠霉素。2)雾化的亚马逊霉素(2兆单位,GydF4y2Ba出价。GydF4y2Ba3)复方新诺明960mg,每周3次GydF4y2Ba卡氏肺孢子虫GydF4y2Ba1周后预防。4)移植后3个月,巨细胞病毒(D+/R -)不匹配患者继续口服更昔洛韦。5)真菌预防包括曲霉(移植前或移植后BAL)患者使用伏立康唑,如果供体或受体BAL中存在念珠菌,则使用氟康唑。GydF4y2Ba
支气管上皮细胞分离与培养GydF4y2Ba
支气管镜检查(使用Olympus FB45.5支气管;奥林巴斯,东京,日本)是用静脉注射的占氮唑仑和局部4%的4%Lignocaine预先用药的患者进行,施用于声带和气管腔内以1ml等分试样成7个 mg·kg-1GydF4y2Ba体重。支气管刷 = 4–6)使用保护样本单套尼龙细胞学刷(5)从亚段支气管获得 fr;威尔逊·库克,温斯顿·塞勒姆,北卡罗来纳州,美国),并分散在5个国家 mL无菌磷酸盐缓冲盐水,随后添加5 根据上述方法,每毫升RPMI和10%胎牛血清(FCS)GydF4y2Ba13GydF4y2Ba.悬浮样品在1000×离心5 minGydF4y2BaGGydF4y2Ba.随后的细胞颗粒再次悬浮在2ml的基底上皮生长培养基(BEBM)中GydF4y2BaTMGydF4y2Ba;克隆(Cambrex),圣地亚哥,加州,美国)补充有乞丐GydF4y2BaTMGydF4y2Ba单曲(批判),青霉素和链霉素。在整个培养基中培养培养基中的最终抗菌浓度是青霉素50 u·mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba链霉素50µg·mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba,庆大霉素50μg·mlGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba两性霉素B 50 ng·mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba.将100μl等分试样用于细胞计数和差异,然后将剩余的细胞悬浮液转移至25cmGydF4y2Ba2GydF4y2Ba胶原蛋白(Vitrogen 100;凝聚力,帕洛阿尔托,加州,美国)和安置在一个COGydF4y2Ba2GydF4y2Ba培养箱(37°C / 5%COGydF4y2Ba2GydF4y2Ba). 另外3 在第一次48小时后添加mL补充培养基 随后每48小时交换一次培养基 h,直到原代支气管上皮细胞培养(PBEC)达到融合。一旦汇合,使用胰蛋白酶传代PBEC,胰蛋白酶使用补充有10%FCS的等体积RPMI中和。然后在10分钟内转移PBEC mL培养基至Vitrogen(内聚力)涂层75 厘米GydF4y2Ba2GydF4y2Ba烧瓶(5×10GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba cells·flask-1GydF4y2Ba)或8腔载玻片(Lab-Tek, Nunc, Naperville, IL, USA;2.5×10GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba细胞·室GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)和融合汇合。GydF4y2Ba
细胞计数和活力GydF4y2Ba
在使用Nebhauer血液血液和对Giemsa染色的细胞源螺旋蛋白制剂上进行的血管血慢性计和差异细胞计数进行刷涂后,对PBEC细胞悬浮液进行细胞计数和差异,计数至少为500个细胞。通过排除耳蛋白蓝染料(0.4%; Sigma,UK)来评估培养细胞的活力。GydF4y2Ba
免疫细胞化学GydF4y2Ba
为了确认上皮特征,我们在八腔载玻片上培养了PBECs,并用小鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体(LP34和MNF116;DakoCytomation, Ely, UK)与异硫氰酸荧光素共轭二级试剂,安装在荧光安装介质(DakoCytomation)并使用共聚焦显微镜检查。使用针对白细胞共同抗原、CD3和CD68 (KP-1巨噬细胞;DakoCytomation)。为了观察免疫反应性,采用改良的免疫过氧化物酶染色法和间接报告系统(Envision;DakoCytomation)。同型匹配免疫球蛋白作为阴性对照。GydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗和培养上清液的微生物评估GydF4y2Ba
BAL液体标本在医学微生物学系以标准化的方式处理,包括使用选择性琼脂和扩大细菌、真菌和GydF4y2Ba军团国GydF4y2Ba根据每天的目测检查,在同一实验室根据BAL液体对感染的spp.细胞培养上清液进行微生物生长评估。简单地说,培养基在1200倍离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba将10分钟和随后的沉淀接种到血糖和巧克力杆菌蛋白琼脂上,并在37℃/ 5%CO孵育48小时GydF4y2Ba2GydF4y2Ba检查生长情况。采用标准方法和扩大敏感性试验鉴定细菌分离株。在BAL和培养基中均未常规进行革兰氏染色和定量培养。GydF4y2Ba
统计分析GydF4y2Ba
成功的培养物与生长失败的培养物之间的比较采用卡方检验,即对分类数据采用Fisher精确检验,对非分类数据采用Mann-Whitney u检验。假设p≤0.05时显著性。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
支气管刷产生了4.1×10的意思GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba细胞(范围1.8-8.7×10GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba).差分计数证实,上皮细胞占89%的细胞(范围77-99),其中嗜中性粒细胞(0.2-5.2),3.7%巨噬细胞(0-26)和淋巴细胞的小群体,0.5%(0-5.4).纤毛和基底上皮细胞均在刷籽细胞悬浮液中鉴定(图1AGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
a)Giemsasted支气管刷细胞源,证明纤维的上皮细胞(固体箭头),基底细胞(环形)和中性粒细胞(破碎箭头;鳞片条=100μm)。b)汇合原发性支气管上皮细胞培养物(PBEC)单层(Scale Bar =100μm)的明菲尔德菲尔德。c)使用共聚焦显微镜(SCALE BAR =100μm),Cytokeratin免疫染色的上皮细胞证明免疫荧光。d)巨噬细胞(箭头)在通过2(尺度条=100μm)之后PBEC单层内的CD68染色。GydF4y2Ba
在33次刷牙中,12次在支气管镜采样后14天达到融合,并通过。在汇合处,细胞具有未分化细胞的表型外观,缺乏可见的纤毛或其他分化形态特征(图。 1bGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba). 细胞显示细胞角蛋白阳性(图。 1cGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).免疫细胞化学证实,即使在传代后,PBEC单层中也存在巨噬细胞(小于总细胞数的2%)(图1d)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
剩余的21个套管未能因培养物感染而达到汇合,在刷牙后的前72小时内发生。从培养基中分离的生物如表1所示GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba与相同的支气管镜手术一起与相应的BAL微生物学。如果源于阴性BAL微生物学的患者(P <0.0001),最有可能成功的文化很可能是源自具有BAL阳性微生物学的12名成功培养物中的12个成功培养中的一种。与非CF诊断的患者相比,CF和培养细胞失败之间存在关联(P = 0.04),尽管CF患者只有略微更容易具有BAL阳性微生物学(18分,44%)略高于患者)与非CF患者相比(13分,38%,38%; P =不可思议)。与非养成文化(中位数12周)相比,成功的文化从移植(24周)进一步源于移植(24周),虽然该关联未能达到意义(P = 0.08),从移植患者(中位数24周)进一步患者在操作类型或急性排斥评分方面没有其他因素似乎预测了文化成功。由于症状和常规监测患者接受支气管镜检查的四名患者之间似乎没有系统差异(表1GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
而肺移植受者的原代成纤维细胞培养已经建立GydF4y2Ba23GydF4y2Ba致作者的最佳知识,这是源自肺同种异体移植物的人类PBEC的第一个描述。该技术允许研究源自临床表征肺移植受体的上皮细胞。虽然灭错支气管炎的动物模型可获得并支持支气管上皮在鼠异位同种异体移植物中的重要性GydF4y2Ba24GydF4y2Ba,需要对人肺移植受者的研究来检验上皮细胞在BOS发生中的作用。这是特别重要的非同种免疫的侮辱,如感染,人类异体移植受到。GydF4y2Ba
成功的培养导致表型特征上皮细胞的建立,虽然失去纤毛的分化。纤毛表型的维持需要使用气液界面培养技术GydF4y2Ba25GydF4y2Ba. 虽然单层细胞似乎由>98%的PBEC组成,但即使在支气管刷洗后的4-6周内传代一到两次,单层细胞中仍存在少量巨噬细胞。巨噬细胞群对后续实验结果的贡献需要进一步研究。在原代成纤维细胞培养中已证明,理论上可以使用特异性抗CD14涂层免疫磁珠从初始细胞悬浮液中去除巨噬细胞GydF4y2Ba26GydF4y2Ba.然而,具有PBEC的巨噬细胞的“共同培养”实际上可能更像是生物系统的代表性GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba.当然,巨噬细胞和气道上皮细胞的相互作用已经被证明可以增强炎症介质对外源性刺激的反应GydF4y2Ba27GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
在刷牙培养中观察到很高的感染率,在最初的72小时的培养中发生。在所有情况下,生物体的存在都与培养的绝对失败有关。这些微生物似乎来自于一般情况稳定且未被临床诊断为感染的患者,尽管这些患者经常出现细菌性BAL阳性。扩大抗生素敏感性试验表明,尽管未进行噬菌体分型,但在BAL和培养基中感染同一物种的8例患者中,微生物均相同。有一组感染培养物(n = 9)来自BAL微生物学阴性的患者。这些生物包括GydF4y2Ba念珠菌GydF4y2BaSPP。,GydF4y2Ba假单胞菌GydF4y2BaSPP。,GydF4y2BaAlcaligenes粪群落GydF4y2Ba和GydF4y2Baexophiala dermatitidis.GydF4y2Ba,所有这些生物体在移植受者的气道中都得到了很好的识别。GydF4y2BaE.GydF4y2BaDermatitidis.GydF4y2Ba黑酵母是否被认为是CF患者气道中的潜在病原体GydF4y2Ba28GydF4y2Ba第一次在CF患者的培养基中鉴定(患者19;表1GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).此外,1例患者(患者27;表1GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba),GydF4y2BaBurkholderia CenocepaciaGydF4y2Ba是在培养基中鉴定的,而不是来自BAL。事实上,当这个病人被GydF4y2BaB. Cenocepacia.GydF4y2Ba移植前,在移植后的重复BAL样本中未发现该生物体。GydF4y2BaB. Cenocepacia.GydF4y2Ba是否与CF患者的坏死性肺炎和移植后预后差有关GydF4y2Ba29GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
当BAL微生物学为阴性时,患者培养基中微生物的鉴定可能具有许多解释。微生物生长可以简单地反映培养罩/培养箱中培养基的污染。当前作者认为,鉴于所涉及的生物的性质以及72小时后感染培养物的性质,这是最不可能的。其次,含有抗生素和抗真菌的培养基可以选择从刷子的低浓度存在并促进其生长的生物。第三,生物可能来自包括鼻咽患者在内的患者的上呼吸道,尽管使用受保护的样品刷可能会减少虚假污染的可能性。最后,上皮刷涂的过程可以鉴定可依赖于上皮作为生物膜的离散生物群。目前的作者之前已经证明了稳定肺移植受者BAL中的仲裁信号分子的存在,表明细菌生物膜形成的存在,即使在显然培养负数GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba.而最近一项针对CF患者的研究未能证明支气管刷拭、BAL和痰微生物学在本质上的区别GydF4y2Ba假单胞菌铜绿假单胞菌GydF4y2Ba殖民化GydF4y2Ba31GydF4y2Ba肺移植群体中生物膜形成的文学缺乏。GydF4y2Ba
作者在这项研究中没有采用定量文化。未来的研究可能会解决与定量微生物学相关的问题,以及支气管吻合口上方/下方的气道微生物学差异、随时间变化的生物膜以及供体源性感染的作用。GydF4y2Ba
在目前的研究中,达到PBEC汇合和通过的总成功率为39%。先前发表的关于肺移植受者原代成纤维细胞培养的研究发现,成功率为54%GydF4y2Ba23GydF4y2Ba.虽然作者没有明确评论培养基的感染率,但与目前的研究相比,成纤维细胞培养的成功似乎没有受BAL微生物学的影响。作者建议,这可能是由于采样方法的差异(跨晶活组织检查GydF4y2Ba对GydF4y2Ba支气管套管)。GydF4y2Ba
本研究表明,尽管感染率高,但可以从肺同种异体移植物建立PBEC培养物。该方法还突出了该患者组中神经感染的潜在伤害作用,支持生物膜形成的概念,并重新强调决定肺同种异体移植气道中的“感染”的困难。GydF4y2Ba
目前的作者认为,使用来自同种异体接受者的原发性细胞培养物是使用市售的气道上皮细胞系的重要辅助,以了解慢性气道功能障碍的机制。发育初级支气管上皮细胞培养的可靠方法将促进稳定肺同种异体移植物和患有支气管炎梗死患者的稳定肺同种异体移植物和细胞的上皮细胞反应的比较。这将允许解剖支气管上皮在湮灭支气管炎的发病机制中的作用。GydF4y2Ba
- 收到了GydF4y2Ba2004年12月10日。GydF4y2Ba
- 公认GydF4y2Ba2005年8月29日。GydF4y2Ba
- ©ers Journals LtdGydF4y2Ba
参考GydF4y2Ba
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