文摘
炎症介质的呼出的气息正在接受侵入性疾病标记医学的兴趣日益浓厚。挥发性有机化合物研究了在这种背景下,但临床信息和方法论的标准是有限的。
的水平乙烷、丙烷、n戊烷、甲醇、乙醇、丙胺、丙酮,异戊二烯、苯、甲苯、二甲基硫(DMS)和柠檬烯以重复呼吸样本20囊性纤维化患者和20名健康对照组(8-29年岁)。三个end-exhaled和一个人均环境空气样品收集和分析一个定制气相色谱系统。
Intra-subject系数变化范围9至34%,呼吸和碳氢化合物的含量受其启发浓度的影响。戊烷的肺泡梯度是囊性纤维化患者高于健康对照组(0.36与十亿分之0.21)和在一秒钟用力呼气量成反比;肺急性加重患者的观察值最高(0.73与十亿分之0.24)。囊性纤维化患者还表现出较低的输出DMS (3.9与十亿分之7.6)。组差异不显著的乙烷和剩余的物质。
得出化学呼吸分析挥发性有机化合物是可行的和可能潜在的炎症过程的非侵入性诊断和随访囊性纤维化肺病。
鲍林后超过30岁et al。1描述了大量的挥发性有机化合物(VOC)在人类呼吸,定期自动测量的上下文中才意识到乙醇汽车毒理学。其他呼出化合物在医学背景:吸引了关注乙烷和n戊烷有关在活的有机体内脂质过氧化反应和氧化应激水平2- - - - - -4,呼吸丙酮被证明与糖尿病患者的代谢状态5生酮饮食或老鼠6,减少呼出异戊二烯臭氧接触后不久就被报道7在急性肺囊性纤维化(CF)的急性加重8。然而,尽管越来越多的科学关注一氧化氮和其他呼出肺疾病的生物标记物9,10,呼吸VOC数据仍然稀缺和重要的方法论问题没有回答,如标准化收集、处理和分析人类的呼吸样本。气相色谱法是最适当的方法可以影响呼吸的水和二氧化碳含量高的样品,和没有建立标准的选择各种常用程序,温度项目,列和探测器11。这阻碍了临床生化呼吸分析工具的开发。
肺病在CF的特点是慢性气道炎症,保留粘性分泌物、支气管扩张,通常,细菌感染12,13。这些因素导致一个变量临床与进步的支气管阻塞和恶性通货膨胀。评分系统基于症状的程度和结果从放射学,微生物学和肺功能测试可能有助于研究设置和定义一个肺恶化。支气管镜灌洗或活检可以申请炎症过程的客观评估,但程序性风险往往是不合理的。因此,大多数的治疗决定仍然根据临床判断和二次参数来源于肺功能测试,评价胸片或血液分析14。
提出,呼出挥发性有机化合物可以准确、重复性良好呼吸样本中确定CF患者和健康对照组,而肺汇率这些潜在的生化标记和其他描述符的CF肺部疾病相关。
方法
主题
15个患者处于稳定状态期间安排门诊去亚琛CF中心和五个住院期间患者包括静脉注射抗生素治疗肺急性加重。详细的病史,现状和环境烟草烟雾暴露聚集表记录和结构化面试。长期吸入药物治疗在前一个月持平,包括抗生素5、DNase四和七个病人吸入类固醇;六个科目收到由于CF-related糖尿病胰岛素。
共有20名健康受试者无慢性肺部疾病或呼吸道感染前月作为对照组。所有受试者不吸烟者,年龄分布(8-29岁)、性别(女性每组11日)组间可比性和高度。然而,CF患者显著较低的身体质量指数z得分(-0.8与+ 0.315)。肺量测定法在所有正常对照组(平均一秒钟用力呼气容积(FEV1)108%的预测(% pred),范围85 - 138),但显示不同程度的CF组(中位数FEV支气管阻塞165%,21 - 105)范围。
所有测试人员(法定监护人,如果适用)给他们的书面知情同意,和研究协议经当地伦理委员会批准。
呼吸采样
调查前,受试者被要求避免饮食和体力活动至少3 h。经过10分钟的休息空间的研究中,他们要求提供通过钢嘴呼出呼入6 l罐的用电解法抛光不锈钢石英内衬(SilcoSteel®, Supelco有限公司Bellefonte, PA,美国)。这些已经被四倍疏散前提< 500 Pa和后续pressurisation纯合成空气300 kPa;其次是最后一个撤离。剩余VOC内容进行气相色谱和罐只有如果集成峰值区域发布的所有剩余信号对应于总挥发性有机化合物的体积混合比< 20 ppt。
目标策略包括呼吸深的灵感和5 s的屏息,其次是缓慢的和完整的呼气/ 10 s。呼吸空气丢弃在第一次2 s呼气,然后直接进入碳罐电磁阀。这是重复> 1 - 3次,一般生产最后的30 - 40 kPa的压力罐。三个呼吸样本收集每个会话在下半场间隔与室内空气的一个示例。所有测量进行在一个没有窗户的会议设施在亚琛大学医学中心,由一个中央通风系统和控制没有消毒剂分配器或交通频繁的人。气体样本运往j研究中心24小时内收集挥发性有机化合物含量的测定。
分析性程序
测量他们的初始气体压力后,罐被加压到300 kPa纯合成空气(质量5.0 = 99.999%)为了进一步减少样品的相对湿度。气体样本进行使用气相色谱仪(惠普6890;惠普有限公司帕洛阿尔托、钙、美国)和一个特别设计的取样管汇,如前所述16,如图1所示⇓。跟踪物种从一个样本体积是800厘米3pre-concentrated在80毫升·分钟的流量吗−1样品环(20厘米长度,内直径(ID) 2毫米)挤满了玻璃珠的0.25毫米直径在液氮温度下。随后,样品热眠在120°C和注入毛细管柱(DB-1 120×0.32毫米ID 3µm膜厚度)。注射后,列一直在等温−60°C 5分钟,然后加热到200°C的速度5°C·分钟−1最后保持在200°C,持续15分钟。从火焰电离检测器信号聚集,这获得了98%的通过分裂阀门列输出。剩余的流量是指向一个离子阱质谱仪(土星9000;美国瓦里安公司,帕洛阿尔托,CA)用于识别特定的山峰。的洗脱顺序列,信号为乙烷、丙烷、甲醇,乙醇,n戊烷、丙酮、丙胺、异戊二烯、二甲基硫(DMS),确定了苯、甲苯和柠檬烯和相应的峰值区域由半自动集成。阅读都是相同质量控制的经验丰富的研究员(b . Mittermaier);图2⇓色谱图显示了一个典型的气息。分析一个样品持续了90分钟,并设置10罐可以分析系统在无人操作。
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/27/5/929/F1.medium.gif)
试验装置的气相色谱(GC)和罐箱系统,气动阀门(V 1 - 6),质量流量控制器(MFC),各种循环,毛细管柱,烤箱,火焰电离检测器(FID)和质谱(MS)。一组10个人6 l罐可以分析在无人操作。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/27/5/929/F2.medium.gif)
原始的呼吸样品的色谱图;研究化合物标签名称和保留时间在各自的山峰之上。插入左边显示了完整的色谱表明丙酮和异戊二烯化合物在空气呼出一口气,正确的插入显示了该地区毗邻异戊二烯的爆破峰值。
VOC体积混合比率终于从产品的峰面积计算和相应的质量响应因子。这些因素来自74复合高精度分析混合物含有烷烃、芳烃、萜烯、醛和酮在1到5磅之间的混合比率(汽缸CC169190;美国丹佛市Apel-Riemer环境Inc .)。校准测量进行每1 - 2周,非常稳定的保留时间和质量响应因素变化可以忽略不计,没有漂移在研究期间。
实验验证
从事临床协议之前,湿度在呼出的潜在影响呼吸系统的分析性能进行了研究。为此,50µL超纯水的加入50 kPa的校准气体样本;成对的湿润和干燥标准混合物被存储为1天,然后测量气相色谱系统如上所述。由此产生的色谱图(图3所示⇓)显示相同保留时间;应该注意的是,一些山峰明显减少湿混合属于物质没有呼出样本进行分析。此外,只有最小峰值振幅的变化被观察到的化合物进行调查(如图4所示⇓)。略高的相对误差为甲醇可能归因于其相对含量低标准混合物(5磅或∼3%的呼出浓度)。
![图3 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/27/5/929/F3.medium.gif)
色谱得到干燥(左边)和湿润(右边)的校准气体样品。
![图4 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/27/5/929/F4.medium.gif)
峰地区差异为特定的挥发性有机化合物(正常化丙烷的峰面积,不受水的影响)之间干(□)和湿润标准气体混合物(▒)。
误差估计
实验可以由很多因素和不确定性是一个重要的考虑因素。罐运输和存储的影响评估通过分析并行的挥发性有机化合物含量样品的干燥的标准气体混合物,环境或呼出空气后0、1、2和3天。总共30测量结果一致表明,non-methane碳氢化合物的混合比率,芳香族化合物、DMS和萜烯5%除以2天内稳定而瞬间分析样本。酒精浓度达10%的呼吸不同样品。
此外,测量精度取决于校准的质量标准(≤5%真实,宣布气体浓度,Apel-Riemer环境Inc .)和质量流量控制器用于稀释的校准气体(偏差≤2%,MKS仪器,威尔明顿,美国)。分析精度影响的不确定性的校准功能和图形分析。线性回归计算的稀释步骤的标准混合物进行个别物种的相对不确定度小于5%。峰地区的不确定性是由于他们的再现性说谎(≤4%),以及一个集成的不确定性估计< 6%。集成的不确定性是在低浓度水平最高。几何的所有这些因素产生了12%的整体实验的不确定性。
统计数据
再现性的呼吸测量是评估通过计算intra-subject系数连续变化的三个样品。组比较是由Mann-Whitney紫外线测试,参数之间的关联进行了线性回归分析。被认为具有统计显著性p值< 0.05。
结果
呼吸采样被证明是可行的在所有科目没有不适或不良事件。由于色谱干扰,呼出浓度不可用在四个样本和柠檬烯丙胺在一个样本。DMS无法检测到除了一个环境调查。在所有其他情况下,离散体积混合比率决定了上面指定的化合物。短期再现性是一般好,平均intra-subject系数方差的三个连续测量范围从9%丙酮为34%乙醇(表1⇓)。一个重要的和线性的影响环境条件对呼出浓度了乙烷(r = 0.63),丙烷(r = 0.72),戊烷(r = 0.6)和甲醇(r = 0.59, p < 0.001)。因此,随后的分析是基于特定化合物的肺泡梯度:Δ(挥发性有机化合物我]= [VOC我]呼吸——(挥发性有机化合物我]房间(挥发性有机化合物,我)是一个给定的混合比VOC在各自的样本类型。这些差异是等价的内生的生产单位或特定化合物的吸收通风率,假设稳态平衡人体组织内,肺和过期的气体。呼出的值、环境和Δ(挥发性有机化合物我表2中给出⇓。
组比较显示明显高于戊烷输出(p = 0.04),低DMS生产(p = 0.001)和高丙胺吸收CF患者(p = 0.003)与健康对照组。没有观察到显著差异为乙烷、丙烷、甲醇,乙醇,丙酮,异戊二烯、苯、甲苯或柠檬烯(表2所示⇑)。CF患者,FEV相关性1(表示为% pred)演示了呼吸甲苯(r = 0.72, p < 0.005)和Δ戊烷(r =−0.62, p < 0.005;图5⇓)。对比CF科目注射。抗生素和稳定的门诊病人显示值明显高于Δ(戊烷)在前组(0.73与十亿分之0.26,p = 0.007)。此外,Δ(戊烷)是提高患者营养不良(r =−0.46, p = 0.04为线性回归身体质量指数z分数)或慢性假单胞菌感染(n = 16, p < 0.001)。糖尿病患者的呼吸中包含更多的异戊二烯(141与十亿分之89,p = 0.003),减少DMS (1.43与十亿分之4.95,p = 0.04)和甲醇(109与十亿分之229,p = 0.04)比CF受试者正常糖耐量。吸入抗生素治疗是降低Δ乙烷(−0.49与十亿分之0.68,p = 0.001),国内烟草烟雾暴露(n = 9)患者表现出更高的值Δ(甲醇)(281与十亿分之120,p < 0.01)和呼出或Δ(DMS) (6.1与十亿分之2.1,p < 0.01)。呼出VOC没有显著相关的特异反应性地位,吸入类固醇和DNase治疗,或用CF基因型(分层根据delF508等位基因的数量)。
![图5 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/27/5/929/F5.medium.gif)
呼出戊烷产量之间的关系和在一秒用力呼气量(FEV1)在健康对照组(□),稳定囊性纤维化(CF)患者(○)和CF患者在恶化(•),包括回归线结合CF组(r =−0.62, p = 0.004)。
讨论
在这项研究中,环境和呼出气息12挥发性微量气体浓度测量的儿童,青少年和年轻成年人健康或由于CF慢性气道炎症的影响。基于假设不同呼吸模式可能会影响呼出参数,最近证明了应付et al。17呼吸,一个标准化的策略被开发来定义吸气和呼气气体混合的程度,确保肺泡起源的空气样本。
呼出气体被交付到惰性容器通过一个定制的设备。采样和分析技术与一个第二列探测器是改编自大气化学气相色谱系统16;他们以前从未被应用到人类呼吸测量。部分罐灌装和随后的稀释导致含水量较低的呼吸样本终于转移到气相色谱仪。由于这是一个临界点分析呼出的空气,湿度的影响已经彻底事先评估。干扰可能会在三个不同的层次:1)冷凝罐表面吸附的化合物,2)堵塞各种循环的冰,和3)色谱信号的改变。验证实验进行没有任何这些问题的证据,但没有了贮存稳定性高,对保留时间和峰值振幅有关水的影响。因此,目前的作者相信,天然气的使用方法收集、分离和VOC检测是健壮的和同样适用于干气的标准,部分潮湿环境空气和水饱和人类呼吸样本。
呼出VOC分析性能被证明是很好的,较低的极限检测10 - 20的ppt。环境水平不容忽视的化合物,因此目前作者选择确定一个特定气体的肺汇率从启发和过期浓度之间的区别。结果显示大量inter-subject两组内差异,对戊烷显著差异,DMS和丙胺。戊烷和甲苯是线性相关的CF患者的肺功能,和乙烷水平没有歧视CF患者健康对照组。
炎症过程已经被认定为中央在许多慢性肺部疾病的病理生理学和众多研究小组致力于敏感标记和方法的发展。明显优势的生化呼吸分析其内在的特性,以及近生理靶组织和分析底物之间的距离。CF的上下文中,肺部炎症的非侵入性标记物可能导致个体裁剪的治疗通过监测氧化应激和疾病进展14,18。呼出戊烷已被建议作为这样一个气道病理的标志10,现有的证据表明,肝脏中多不饱和脂肪酸的过氧化作用是其主要来源。增加戊烷浓度是急性哮喘患者的呼吸19、肺感染20.和急性香烟烟雾暴露后21。一个观察成人CF患者曾被报道以抽象的形式22当编辑写信23,显然是没有后续的创新性的贡献。作者收集了潮汐空气/ 2分钟10分钟后冲刷,发现更高的呼吸戊烷输出CF患者与健康对照组相比,但病人的细节特征,分析方法和结果不可用。目前的调查表明,Δ(戊烷)的患者明显高于健康对照组,具有负相关性肺功能和营养状况。此外,更高的戊烷梯度中检测到肺急性加重慢性假单胞菌感染的存在,这是一个众所周知的中性气道炎症的兴奋剂。这些发现支持了假设呼出戊烷反映在活的有机体内氧化过程在CF患者参加本研究。然而,个别学科有广泛的分散(图5所示⇑),大量的重叠结果CF患者和控制。到目前为止,戊烷的长期变化和歧视的力量在特定的临床情况下(如肺恶化)的诊断尚未评估。斯普林菲尔德和莱维特提出的24时,应进行色谱分析与勤奋和环境考虑来源。
乙烷是脂质过氧化作用的另一个主要产品,增加呼吸水平已报告在哮喘患者或CF25,26。这一发现并没有复制在当下研究;这可能是由于不同的环境校正方法和乙烷,由Paredi未提及et al。26在他们的研究中呼出乙烷的CF。然而,吸入患者抗生素治疗是降低乙烷输出在当前的研究中,提高额外的源从细菌生产的可能性。同样,丙烷在类似水平的病人和控制排放。这个C3碳氢化合物可能是主要是从蛋白质降解和粪便菌群,是可疑的使用作为脂质过氧化作用的标志10。
降低肺异戊二烯的输出被描述在CF急性加重,治疗后恢复正常的价值观9。再一次,这一发现并没有重现在当下的横断面研究。呼出异戊二烯稳定、没有差异加剧了CF患者和CF患者和健康对照组之间。异戊二烯水平较高的含义在糖尿病患者尚不清楚;先前的调查未能显示区别学生I型糖尿病患者和健康同行27。
呼吸的挥发性硫化合物先前在口腔恶臭的环境评估28,职业暴露29日、先天性酶缺乏症30.和肝硬化31日。虽然海拔DMS被发现在所有这些条件,明显降低呼吸输出测量的CF人口。虽然进步的胆汁郁积和肝纤维化发生过程中定期CF,本研究的患者有严重肝脏介入。此外,患者呼出DMS水平明显高于环境烟草烟雾暴露和降低胰岛素或吸入的抗生素。由于生化途径的复杂性和潜在的未知的混杂因素,目前这些有趣的结果仍然是描述性的。
柠檬烯被描述为肝病患者的呼吸升高32。单萜被认为是潜在的抗氧化剂的主要营养来源,虽然他们的确切作用在人类代谢尚不清楚。柠檬烯被发现在混合比率0.1至15磅的呼出的气息现在研究的CF患者和健康对照组没有系统的差异。
剩下的化合物中,丙胺实际上是被环境空气的CF患者数量明显高于控制。乙醇释放表现出最高的可变性,而甲醇产量更高的烟草烟雾暴露和低长期假单胞菌感染的病人。然而,没有观察到CF患者和健康对照组之间的差异这些醇。同样,净吸收被描述为芳香族化合物苯和甲苯没有集团的重大差异。丙酮被证明是最丰富的挥发性有机化合物在人类呼吸(图2所示⇑)可重复性高,但又不与糖尿病和CF患者和健康对照组之间没有差别。
总之,年轻的CF患者表现出更高的戊烷和更低的DMS输出与正常对照组相比,他们的呼吸。他们的肺泡的梯度n戊烷与肺功能、营养状态、假单胞菌感染和肺部恶化的存在。额外的证据的预后价值呼出戊烷作为炎症标记可能会收集的连续测量病人队列之前和之后发作的抗生素治疗。这是超出了本研究的范围,但应该在不久的将来解决。组比较了乙烷没有差异,异戊二烯、柠檬烯和其他挥发性有机化合物。
目前作者承认,这些观察结果导致新的问题多于答案。呼吸挥发性有机化合物的长期变化尚未评估在健康人或呼吸道疾病患者。今天的采样和分析设备和程序相当复杂,unstandardised,更不用说建立参考价值的缺乏。因此,目前可用的知识,它仍然是模棱两可的实用价值,以确定一个特定的挥发性有机化合物的浓度在病人的呼出一口气。尽管如此,目前的调查可能会增加力量概念的发展,化学呼吸分析有可能打开一个新的诊断窗口在肺生理和病理的重要方面在囊性纤维化和其他慢性炎症条件。
确认
目前作者感谢所有患者和家庭谁自愿参加本研究。肺功能测试是由c·金森伯格Niessen和e·莫利托在亚琛大学医院儿科部门,德国亚琛。作者要感谢g . Brasse他的帮助与执行筒测试干燥和湿润标准气体样品。目前的工作是刺激之间的联合研究项目m·巴克湄布莱克,南卡罗来纳州乔治·库珀和加州大学欧文分校加州,美国。作者也希望表达他们的感谢这个科学工作的价值和持续的支持a Wahner (j ICG-II、j研究中心、德国)和g这个(亚琛大学儿科部门医院,亚琛,德国)。
- 收到了2005年7月21日。
- 接受2006年1月24日。
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