摘要gydF4y2Ba
吸入含有内毒素(或脂多糖(LPS))的颗粒物发生在各种职业中。鼻灌洗和诱导痰已用于评估由这种暴露引起的肺部炎症。全血试验(WBA)测量白细胞细胞因子的产生gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba用LPS刺激。本研究检验了WBA在评估炎症反应和易感性方面的有效性。gydF4y2Ba
C3HeB/FEJ小鼠给予LPS注射耐受或生理盐水假性耐受。然后动物吸入含有内毒素的猪舍灰提取物或生理盐水。测定支气管肺泡灌洗液白细胞计数和促炎细胞因子(白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α)。用10或100 ng·mL刺激全血gydF4y2Ba1gydF4y2Ba孵育5或18小时,并检测细胞因子。gydF4y2Ba
与盐水暴露组相比,谷仓灰尘暴露组BAL的总细胞数、中性粒细胞和细胞因子显著升高。耐受LPS和暴露于谷仓灰尘的动物表现出较低的细胞和细胞因子BAL反应。同样,暴露在谷仓灰尘中,WBA产生的细胞因子显著升高,耐受反应降低。gydF4y2Ba
这项研究证明了全血试验作为吸入炎症剂暴露的生物标志物的有效性,并用于评估有机粉尘诱导的肺部炎症的易感性。gydF4y2Ba
有机粉尘是一种复杂的生物气溶胶,由细菌和真菌产物及其代谢产物、动物、昆虫和植物成分组成。吸入有机粉尘可引起严重的急性肺部和全身炎症,并导致职业性哮喘和其他阻塞性肺部疾病gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。研究表明,非过敏性,中性粒细胞介导的反应解释了这些肺部健康结果,促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子(TNF)-α,白细胞介素(IL)-1β和IL-6,在炎症过程中起主要作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。导致肺部炎症的有机粉尘的一个重要组成部分是内毒素,也称为脂多糖(LPS)。内毒素暴露与室内环境中的不良呼吸影响有关gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在以下领域是一种公认的职业危害:1)猪、家禽和奶牛场;(二)粮食装卸设施;3)蔬菜、棉花加工;4)锯木厂、金属机加工、玻璃纤维生产作业;5)堆肥和废物处理gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。内毒素形成了几乎所有革兰氏阴性细菌外细胞膜的外层,已知内毒素具有强大的促炎作用,归因于分子的脂质a区gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。由于这一区域嵌在细菌细胞膜中,内毒素在完整的细胞或细胞膜破裂时释放出来时最有效gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
研究表明,接触内毒素或有机粉尘后一秒内用力呼气量的下降与肺泡巨噬细胞和外周血单核细胞产生炎症介质的增加有关gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。因此,有可能通过分析有机粉尘诱导的气道炎症来评估免疫反应gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba血液单核细胞或肺泡巨噬细胞释放细胞因子。然而,分离和培养这些细胞是耗时的,不利于多学科的研究。此外,分离的细胞可能不会以与在自然基质中维持时相同的方式作出反应。虽然不是完美的替代品,但gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba全血试验(WBA)试图保留细胞因子反应和细胞活力所必需的各种血细胞相互作用,可能是一种合适的替代方法gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。与鼻腔灌洗或诱导痰生产不同,用于测定的血量是不变的,这允许确定准确的总细胞计数。全血分析的几种实现已用于检查对各种制剂和条件的免疫反应,包括热源gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba脓毒症,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba传染病gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,过敏原gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba以及其他环境因素gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。使用类似于这项研究的方法,WoutersgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba评估了正常、未暴露的志愿者体内和受试者之间WBA的变异,发现与受试者之间的变异相比,受试者内部的变异相对较低,特别是IL-1β和IL-6。这两种细胞因子在LPS刺激分别为12.5和100 ng·mL时的个体内差异gydF4y2Ba1gydF4y2BaIL-1β为0.15、0.18,IL-6为0.14、0.12。与其他研究一样,全血对炎症剂LPS和可德兰的反应呈剂量-反应关系。在分析的四种细胞因子中,IL-1β和IL-6的反应最为一致gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
本作者实验室先前的研究表明,在接触有机粉尘之前耐受内毒素的小鼠在吸入暴露于颗粒粉尘后,与naïve小鼠相比,肺部炎症反应减少gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。这种现象在之前的文献中已经报道过gydF4y2Ba28gydF4y2Ba被称为内毒素或LPS的“耐受性”或“适应性”gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。本研究评估WBA反应作为有机粉尘暴露的生物标志物,并使用内毒素耐受小鼠作为通过日常职业暴露对内毒素耐受的工人的模型。这些实验试图测试暴露在猪禁闭设施有机粉尘中的小鼠是否比假暴露的动物对内毒素有更强烈的全血细胞因子反应,以及小鼠全血细胞因子反应是否受到刺激gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba随着内毒素兴奋剂浓度的增加而增加gydF4y2Ba31gydF4y2Ba。第二个目的是确定使用WBA评估的LPS耐受是否导致反应性降低。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
动物gydF4y2Ba
雄性,6周大的C3HeB/FeJ小鼠(Jackson实验室,Bar Harbor, ME, USA)被安置在美国实验动物护理认证协会认可的啮齿动物养殖室内。所有方案均由爱荷华大学(爱荷华市,IA,美国)机构动物护理和使用委员会审查和批准。在实验开始前,小鼠被隔离了12天。保留四只小鼠作为哨兵,在实验开始和结束时进行尸体解剖,以验证动物健康。32只小鼠被分为两个暴露组:虚假暴露组,接受雾化盐水;有机粉尘暴露组,暴露于从集中饲养猪的动物饲养操作(CAFO)收集的粉尘的雾化提取物中(CAFO粉尘)。为当前研究选择的小鼠品系先前在有机粉尘暴露模型中被定性为“内毒素敏感”gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
诱导脂多糖耐受性gydF4y2Ba
如前所述,在每个暴露组的一半小鼠中诱导内毒素耐受性gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。简言之,小鼠每天接受腹腔注射(gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)不断增加剂量的注射gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaO111:B4内毒素(Sigma,圣路易斯,密苏里州,美国)如下。第1天:100 μg·kggydF4y2Ba1gydF4y2Ba;第2天:500 μg·kggydF4y2Ba1gydF4y2Ba;第三天:1000 μg·kggydF4y2Ba1gydF4y2Ba;第四天:5000 μg·kggydF4y2Ba1gydF4y2Ba。原液内毒素浓度通过动态显色鲎试剂(LAL)测定(BioWhittaker Inc., Walkersville, MD, USA)确定。其余16只对照小鼠以类似的方式注射无热原生理盐水。gydF4y2Ba
猪CAFO粉尘提取物gydF4y2Ba
灰尘样本是从爱荷华州东部的猪CAFO通过吸尘垂直表面与采样真空获得的。以100 mg·mL的浓度制备粉尘提取物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在无菌生理盐水中。首先通过涡旋2分钟来洗脱灰尘,然后在实验室旋转器上在环境温度下摇晃1小时。不溶性颗粒以3350 ×离心换液2次去除gydF4y2BaggydF4y2Ba每次15分钟。将最终上清液调整至pH 7.2。gydF4y2Ba
曝光gydF4y2Ba
小鼠被置于全身暴露室中gydF4y2Ba33gydF4y2Ba4小时后雾化盐水(n = 16)或雾化CAFO粉尘提取物(n = 16)。在每个暴露组中,有一半小鼠来自诱导耐受(LPS)gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)组,其余为对照组(生理盐水gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)。气溶胶是由六喷嘴的Collison喷雾器(华大基因公司,Waltham, MA, USA)产生的,空气供应为138千帕gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。排气流量为22.5 L·mingydF4y2Ba1gydF4y2Ba。进入暴露室的被动气流通过有机蒸汽筒和P100颗粒过滤器(North Safety Products, Cranston, RI, USA)过滤。暴露室内的内毒素浓度是通过每小时收集15分钟的47毫米玻璃纤维过滤器收集的空气样本来测量的。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗液和全血采集gydF4y2Ba
暴露后1小时(吸入暴露开始后5小时),对动物进行麻醉、安乐死和心脏穿刺放血以获得肝素化全血。收集暴露组所有动物的血液并保存在4°C下。为了获得足够的WBA血液,必须从单个小鼠身上收集血液。采血后立即取支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞总数和分化计数及细胞因子分析。用无菌、无热原生理盐水在25cmh的压力下灌洗肺gydF4y2Ba2gydF4y2BaO在1毫升增量,总容量为4毫升。BALF保存在4°C,收集后尽快处理。BALF以200×离心5 mingydF4y2BaggydF4y2Ba将所得上清液滗出,分成等体积的等份,-80℃冷冻,用于细胞因子分析。剩余的细胞颗粒重新悬浮在RPMI介质中,并制备总细胞计数和差异细胞计数。使用改进的Neubauer血细胞计(Reichert, Buffalo, NY, USA)进行总计数,并使用Diff快速染色组(Harleco, Gibbstown, NY, USA)进行染色,通过显微镜进行鉴别计数。gydF4y2Ba
全血化验gydF4y2Ba
全血样本由内毒素耐受组和暴露组收集,用等量生理盐水稀释。将稀释后的全血按900 μL双等份抽入组织培养管。在每管中加入100 μL LPS刺激细胞因子释放:高剂量LPS刺激剂(100 ng·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),低脂多糖刺激(10 ng·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和生理盐水对照。LPS是从BioWhittaker公司购买的冻干提取物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba血清型O55: B5。装有血液和兴奋剂的试管在37°C、95%湿度和5%二氧化碳的条件下孵育。孵育5 h或18 h后,每管加500 μL生理盐水,1000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。将所得的血浆上清液换瓶保存于-80°C,直至细胞因子分析。gydF4y2Ba
ELISA和鲎鲎试剂测定gydF4y2Ba
使用市售ELISA试剂盒(BioSource International, Camarillo, CA, USA)测定支气管肺泡灌洗液(BAL)上清和WBA血浆样品中的小鼠IL-6和TNF-α细胞因子浓度。空气过滤器样品的内毒素浓度用动力学显色LAL法测定,如前所述gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
统计方法gydF4y2Ba
主要因变量包括有或没有LPS刺激的BAL总细胞数和差异细胞数、BALF细胞因子浓度以及WBA细胞因子的产生。对于WBA,通过从相应的LPS刺激结果中减去非刺激对照组来计算净诱导细胞因子的产生。采用非配对t检验分析BALF数据。p≤0.01时比较被认为具有显著性。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
曝光gydF4y2Ba
暴露于CAFO粉尘提取物的内毒素浓度平均为28.4±4.1 μg·mgydF4y2Ba3gydF4y2Ba。这个浓度相当于490 ng·kg的身体负担gydF4y2Ba1gydF4y2Ba欧盟(4900公斤gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),这是在没有任何暴露控制的CAFO中工作8小时的工人肺负担的10倍gydF4y2Ba34gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗液分析结果gydF4y2Ba
与假暴露组相比,暴露于CAFO粉尘的两组观察到总细胞数和中性粒细胞计数以及细胞因子浓度显著升高(p<0.001;图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。暴露在CAFO灰尘中的小鼠的BAL细胞总量远高于假暴露组的平均值(p<0.001;图1一个gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。这种反应以中性粒细胞的涌入为标志,导致在暴露于CAFO灰尘的小鼠中,中性粒细胞从对照组的1%增加到97%。图1 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba说明中性粒细胞浓度由230细胞·mL增加gydF4y2Ba1gydF4y2Ba对照组为160万细胞·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba暴露在CAFO灰尘中的小鼠。gydF4y2Ba
耐受LPS和暴露于CAFO粉尘的动物BALF总细胞显著降低(1.13×106gydF4y2Ba与gydF4y2Ba1.61×106细胞·毫升gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;P <0.001)和中性粒细胞(1.08×106gydF4y2Ba与gydF4y2Ba1.59×106细胞·毫升gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;P <0.001),与接受相同暴露但不耐受的动物相比(图1agydF4y2Ba⇑gydF4y2Bab).此外,如图1c所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba根据IL-6释放量(3,400gydF4y2Ba与gydF4y2Ba1100 pg·毫升gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;p < 0.001)。两组间TNF-α无差异(图1dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。然而,TNF-α反应非常高(> 17000 pg·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)对暴露在CAFO粉尘中的耐受组和不耐受组进行了测试。在对照组(假暴露)耐受组和非耐受组之间,肺部炎症反应没有显著差异。gydF4y2Ba
全血化验gydF4y2Ba
图2显示了先前描述的动物聚集血的WBA结果gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。全血孵育5或18 hgydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba刺激或低或高脂多糖刺激。在大多数情况下,细胞因子的释放增加gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba增加内毒素刺激。在5和18小时时间点,非耐受的CAFO粉尘暴露小鼠的IL-6细胞因子释放高于假暴露小鼠,但TNF-α没有。在5小时和18小时的时间点上,与暴露于CAFO粉尘提取物之前耐受LPS的动物相比,耐受LPS的动物的IL-6反应显著降低。与BALF一样,这种差异在假暴露组中通常没有反映出来。暴露(虚假)之间的响应模式gydF4y2Ba与gydF4y2BaCAFO粉尘)和耐受性(生理盐水gydF4y2Ba与gydF4y2BaTNF-α的LPS组表明,未暴露于CAFO粉尘的动物对LPS刺激的反应更强。这可能是由于暴露于CAFO粉尘的小鼠TNF-α反应在5小时前达到峰值。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
暴露于吸入猪CAFO粉尘的小鼠出现了严重的肺部炎症反应,表现为BALF细胞增加了40倍(耐受组增加了30倍),中性粒细胞增加了6500倍(耐受组增加了8500倍),两种作为炎症标志物的细胞因子增加了250倍:TNF-α和IL-6。与前哨动物相比,吸入雾化无热原盐水的假暴露小鼠在这些结果变量上没有表现出任何变化。gydF4y2Ba
本研究表明,在吸入暴露于猪CAFO粉尘之前耐受内毒素的小鼠BALF中总细胞和中性粒细胞显著减少。这些小鼠对WBA的反应也不如接受相同暴露的非耐受小鼠强烈。暴露组之间的易感性差异是明显的,与假暴露组相比,CAFO粉尘暴露组的WBA IL-6细胞因子反应更大。在WBA孵育5小时后,TNF-α也发现了同样的效果,但程度较低,但在18小时后没有发现。这可能是由于检测的时间,因为TNF-α的产生峰值远早于IL-6gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。此外,在人体WBA研究中,TNF-α的产生在个体内部和个体之间变化更大gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。这些数据表明,WBA可以作为暴露效应和诱导耐受所致敏感性降低的生物标志物,并表明IL-6可能是这种效应的更可靠的标记物。gydF4y2Ba
内毒素暴露量是CAFO工作人员的10倍gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba。尽管引起反应的暴露量存在差异,但WBA也可能适用于人类吸入暴露研究。众所周知,在职业和实验环境中,个体对吸入有机粉尘和LPS的反应各不相同gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba。这种差异的性质可能与信号转导途径中的因素有关,从内毒素到toll样受体(TLR)4gydF4y2Ba通过gydF4y2Balps结合蛋白,CD14和MD2gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。另一个重要因素可能是对LPS免疫反应的遗传决定因素。TLR4多态性可能解释了这种变异的部分原因,但其他基因似乎也起着重要作用gydF4y2Ba37gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba39gydF4y2Ba。凉亭gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba40gydF4y2Ba发现两种常见的TLR4突变(Asp299Gly和Thr399Ile)与人类吸入LPS的反应降低有关。将野生型等位基因插入具有上述TLR4突变的个体的原代气道上皮细胞或肺泡巨噬细胞培养物中可以逆转这一效应gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。这种变异也可能取决于内毒素(细胞结合的)类型gydF4y2Ba与gydF4y2Ba提纯的)暴露在空气中gydF4y2Ba41gydF4y2Ba以及已经存在的哮喘等疾病gydF4y2Ba42gydF4y2Ba。全血gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba刺激试验试图通过维持“完整”的细胞环境来解释这种可变性;因此,它可以很好地预测个体对各种环境和微生物因子的免疫反应gydF4y2Ba43gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
在cafo、谷物粉尘或堆肥设施或蔬菜清洗作业中暴露于高内毒素的工人可能对内毒素产生耐受性。这在棉花和纺织工人的“周一早晨热”中表现得很明显,那些在一周早些时候接触内毒素的人(gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba周末休息后)的呼吸道症状会比这周晚些时候更严重gydF4y2Ba44gydF4y2Ba。这项研究的数据表明,在棉花的WBA中细胞因子的产生会在工作周的过程中减少。gydF4y2Ba
之前的一些研究试图验证WBAgydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba。伍特斯gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba确定LPS和β-葡聚糖刺激下WBA的个体间变异性比个体内变异性更显著。WBA是一种可靠的、可重复的个体反应性测量方法。然而,该研究使用的是未暴露的正常受试者,因此无法推断WBA用于炎症剂暴露的生物监测的效用。其他研究描述了lps诱导的培养细胞(包括单核细胞和淋巴细胞)的细胞因子反应,但没有研究WBAgydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba。职业诱导的LPS耐受在WBA中的作用尚未得到充分的探讨。gydF4y2Ba
总之,目前在小鼠吸入暴露模型中的研究表明,全血分析可作为暴露的生物标志物,并可替代各种非特异性或更具侵入性且不适用于大规模、基于人群的职业暴露研究的方法。需要对人体暴露模型进行进一步研究,以证实这些发现。目前作者的实验室正在进行一项这样的研究。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者感谢乌得勒支大学(荷兰乌得勒支)的G. Doekes的有益建议。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2004年8月4日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba二六年二月十三日。gydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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