抽象的
重复的低剂量过敏原吸入挑战模拟自然过敏原暴露,为哮喘的早期触发机制提供了一个模型。目前的作者进行了一项对照研究,以评估呼出一氧化氮组分变化的时间进程(Fe,不)和尿路气道炎症的生物标志物。
8名轻度过敏性哮喘患者分别用稀释剂和过敏原完成了2个7天重复的低剂量激发期。受试者在纳入时无症状,并在未暴露于特定过敏原时进行调查。随访肺功能和症状Fe,不尿液介质与气道对组胺和腺苷反应性的变化相关。
尽管肺功能没有变化(强迫呼气量在一秒平均值±扫描电镜下降0.3±0.7与0.6±1.0%,对于稀释剂和过敏原,分别没有哮喘症状,反复过敏原暴露与稀释剂相比,组胺响应性的显着增加(2.3倍剂量),早期和逐渐增加Fe,不肥大细胞标志物9α11β-前列腺素F也有小幅增加2腺苷后的挑战。
总之,一系列测量呼出的一氧化氮组分有可能为早期发现出现的气道炎症和随后气道对组织胺高反应性变化提供非常敏感的策略。
重复的低剂量过敏原吸入挑战已经被介绍作为一种模拟和标准化自然暴露于环境过敏原的方法1.在这一挑战环境中,特应患者的哮喘患者对固定剂量的过敏原吸入,滴答物,以引起最小的支气管混凝土,并在连续4-10天每天施用一次1–6.该过程产生了气道高反应性(AHR)的明显增加,以直接支气管收缩剂1–6.AHR的增加发生在只有少数哮喘症状被报告的受试者。因此,挑战模型特别适合于研究AHR发展的早期事件,AHR是哮喘表型的主要特征。吸入糖皮质激素对低剂量激发过程诱导的AHR和痰嗜酸性粒细胞增多的影响支持了模型的相关性7,8.
然而,到目前为止,这种特定模型中的气道炎症机制的调查一直是有限的,外周血中的发现很大程度上是负面的5,7,9.在稀释剂控制的挑战评估中,诱导痰中嗜酸性粒细胞、白细胞介素-5和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的百分比显示增加2,对支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的早期影响也有报道9,10..目前研究的目的是进一步表征反复低剂量过敏原挑战对气道炎症的发展的影响。主要终点是建立呼出的一氧化氮部分之间存在关联(Fe,不)在重复低剂量过敏原暴露期间的气道反应性变化。这将提供关于是否有关的证据Fe,不是气道炎症的适当早期标记,可在哮喘的症状加剧之前。以前的数据建议增加Fe,不在低剂量过敏原暴露期间8,但在那项研究中Fe,不与甲素的气道反应性的增加无关,也不是稀释剂的控制。
作为炎症的次级替代标志物,尿液水平e4(LTE.4)以及尿中前列腺素D的水平2代谢物,9α11β-Prostaglandin f2(PGF2),用作肥大细胞激活的特定标记11..例如,在传统的高剂量过敏原刺激中,过敏原诱导的早期和晚期哮喘反应与尿中9α11β-PGF水平的增加有关212..虽然已经显示出嗜酸性粒细胞的活化在低剂量攻击中发生2,7,8在美国,对肥大细胞的激活研究较少。越来越明显的是,嗜酸性粒细胞在哮喘气道炎症中的致病作用尚不明确13..目前作者假设肥大细胞的启动在AHR的发育过程中发生,并且测量尿液排泄的9α11β-PGF2可以验证这个假设。作为另一种测试肥大细胞是否被激活的尝试,该方案中包括了腺苷5 ' -单磷酸(AMP)的挑战。AMP是一种间接支气管收缩剂,主要作用于肥大细胞,导致支气管收缩介质的释放14.–16..对AMP的响应性提出与气道炎症更密切地关联,而不是直接支气管机构(如甲素)的挑战17..人群研究表明,对常见空气变应原的敏感性和AMP的反应性之间的关系18..低剂量过敏原激发程序对AMP反应性的影响以前没有得到评估。
因此,采用两期交叉设计,对花粉或动物皮屑过敏且目前无哮喘症状的受试者分别暴露于低剂量吸入性变应原及其稀释剂,连续7个工作日。在两个挑战期前后评估组胺和AMP的支气管反应性;尿介质代谢物也进行了测定Fe,不分别在各个时期进行。此外,对照组的8名健康个体使用相同的研究方案进行稀释试验,以确定基线Fe,不随着时间的推移,在轻度哮喘受试者和健康个体之间的值和尿液标记物有所不同。
方法
主题
本研究招募了8名非吸烟受试者,他们因接触花粉或动物皮屑而有哮喘症状史(表1)⇓).他们需要阳性筛选组胺攻击,诱惑剂量导致迫使呼气量20%(PD)20.)40-2,090μg和对桦树花粉,蒂莫西草花粉和/或动物剥皮的阳性皮肤试验,但不要沉没尘螨。调查花粉敏感的受试者在花粉季节外进行调查,对动物剥皮敏感的受试者没有自己的宠物,并被要求严格避免动物接触。因此,在进入研究时,受试者是无症状的,它们的哮喘稳定,过去4周没有呼吸道感染。他们的唯一药物偶尔会使用β2- 一个角度。通过考虑每个人的过敏原进行筛选过敏原挑战。受试者的电流敏感度表示为PD20.(表1⇓).8名受试者中有4人表现出双重反应(早期和晚期)。
包括一个没有过敏或哮喘历史的一组八个非墨镜,年龄和性匹配的健康对照受试者(七个女性和一个雄性;年龄24-43 Yrs;平均(范围)基线强制呼气量一秒钟(FEV1) 106(93-125)%)。所有对照组皮肤点刺试验均为阴性,组胺筛选试验(PD)呈阴性20.>2,090μg)。
该研究议定书由Karolinska医院当地伦理委员会批准(瑞典斯德哥尔摩; DNR:98:248),所有科目都提供了他们的知情同意。所有八个哮喘受试者和八个对照受试者完成了这项研究。
研究设计
筛查变应原激发4周后,哮喘受试者分别进入两期、交叉重复的低剂量吸入激发过敏原和稀释剂。表2列出了研究方案的概要⇓.
正如目前作者对低剂量挑战的原始描述1提示气道反应性的增加可能需要几周的时间来解决,因此决定在第一阶段进行稀释剂单盲激发,然后在4周洗脱后进行过敏原激发。然而,受试者,研究技术员测量Fe,不,分析尿液介质的研究人员不知道预定义的序列,研究程序在各自期间是相同的。
首先,通过AMP挑战,在第二天进行组胺挑战。周末之后,总是从星期一开始,重复的低剂量过敏原/稀释剂(AG / DIL)吸入时期开始。在最后一天的AG / DIL吸入后,第二天进行了第二个组胺挑战,第二天进行了第二个放大器吸入挑战。
对照组的受试者接受同样的程序,但只接受稀释剂的挑战。
吸入的挑战
所有挑战日在早上(07:30-08:00 h)同时向诊所报告给诊所。β2-激发前8小时内不允许激动剂使用。以FEV测定肺功能1肺活量计(Vitalograph MDI Compact;Förbandsmaterial,斯德哥尔摩,瑞典)和基线,定义为三个记录中最好的,必须≥70%。过敏原、组胺和AMP激发试验采用剂量计控制的喷射雾化剂(Spira Elektro 2;呼吸护理中心,Hameenlinna,芬兰)19..挑战从吸入稀释剂开始。提供FEV1没有改变> 10%,开始与相应的活性物质的上升剂量支气管扩张,并开始后稀释剂FEV1值作为基线。在筛选过敏原挑战中,累积过敏原剂量增加半对数(范围7 - 7100 SQ Aquagen)TM值;每15分钟吸入Alk,哥本哈根,丹麦,直到FEV落下20%1获得了。对组胺(由卡罗林斯卡医院药房制备的二磷酸组胺)的支气管反应性进行了类似的评估,但剂量每三分钟增加一次。两种浓度(1.6 mg·mL−1和16 mg·毫升−1),并使用不同次数的呼吸来增加激动剂的累积剂量(范围11 - 2090 μg)19..AMP挑战采用每5分钟加倍浓度(1.56-400 mg·mL)的方案−1;Sigma化学公司,美国密苏里州圣路易斯)20..PD20.过敏原、组胺和AMP的值由对数剂量-反应曲线线性插值计算。
低剂量过敏原吸入刺激
导致FEV早期下降的过敏原剂量1(PD∼5%5)是通过筛查每个个体的过敏原挑战确定的(表1⇑).过敏原Pd.5然后作为一个单一的挑战,每天连续7个工作日,周末休息(表2⇑).哮喘患者在各自的挑战期吸入稀释剂的次数与过敏原剂量相同,而对照组受试者吸入稀释剂的次数为三次。吸入前和吸入后15分钟分别记录肺活量。患者在研究期间记录了早上和晚上的呼气流量峰值(PEFR)值(德国Hoechberg Jaegher电子峰值流量计),并被要求在出现哮喘症状时做进一步记录。日间和夜间哮喘症状评分(0 =无症状;1 =轻度症状;2 =中度症状;3 =严重症状)和短效β2-激动剂的使用也记录在每个研究日。
测量呼出空气中的一氧化氮
Fe,不根据美国胸部社会发布的在线一氧化氮(NO)测量的建议测量21.,使用镜头原型无系统(斯德哥尔摩,瑞典),包括CLD 77 AM化学发光分析仪(Eco Physics AG,Durnten,瑞士);灵敏度0.1 PPB NO;上升时间0-90%<0.1 s;样品流速110毫升·min−1;来自吹口的滞后时间0.7 s)用于在线NO测量,以及用于监测流量和压力的气压表。呼气速率(250 mL·s)−1)在呼气5 cm H时通过视觉反馈保持恒定2O通过线性流电阻(汉斯鲁道夫公司,堪萨斯城,KS,美国)。在每个研究阶段之前,使用质量流量控制的认证校准气体(库存浓度为2ppm NO in N)稀释剂进行两点校准2;AGA AB, Älvsjö,瑞典)。
尿液分析
AMP挑战天,尿液收集到达之前开始的挑战和1 h后剂量的AMP。同样,pre-dose尿液样本获得挑战天每个重复低剂量期间1和7,而post-dose样本被吸入后30分钟。将样品进行冷冻处理,提取9α11β-PGF2和LTE4采用经过验证的半自动酶免疫分析法(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)22.,23..
统计分析
对于主要结果,八个受试者的样本量基于当前作者自己的测量,允许检测到50%增加Fe,不与80%的功率和α = 0.05。这与Kharitonov的出版是一致的et al。24.关于重复性和样本量的估计Fe,不测量。
几何平均pd的计算20.,PD.10.(过敏原剂导致FEV的早期秋季1约为10%)和PD5值是在对数转换的原始数据上执行的。肺功能、NO值、尿介质数据均为正态分布,采用方差分析和配对t检验对不同时期、不同治疗组进行比较。数据一般以平均值±表示扫描电镜.当p值<0.05时,认为差异显著。
结果
肺功能
重复的低剂量过敏原攻击在受试者中没有影响哮喘的基线肺功能。因此,FEV.1在低剂量过敏原吸入前的每一天获得的值与稀释时期期间的值不同(图1A⇓).在整个研究中,各组胺和腺苷挑战日的基线值也稳定,并且在访问之间没有显着的变化(p = 0.16)。
在低剂量过敏原刺激后,没有受试者出现早期哮喘反应。组均值为FEV变化1图1b显示了每个挑战日的情况⇑与均值±扫描电镜在FEV的直接落下1过敏原激发期为0.6±1.0%,稀释期为0.3±0.7%。此外,根据PEFR测量和症状报告,在各自的挑战期,没有受试者表现出临床上显著的肺功能晚期下降(数据未显示)。
健康对照组肺功能正常,在观察期间(FEV)无变化1104±13.6与攻毒第1天和第7天的pred分别为105±13.9%,p = 0.39)。
症状
没有受试者报告任何夜间哮喘或使用β的症状2在一个挑战期间的角度。在稀释时期,没有主题报告哮喘的任何症状(症状得分= 0),而在低剂量过敏原期间,四个受试者在偶尔的日期报告了轻度症状(症状得分= 1)(组意味着±扫描电镜症状得分:0.16±0.07)。
气道对组胺的反应性
重复的低剂量过敏原吸入产生了所有八个受试者在所有八个受试者中对组胺的气道反应的增加(图2⇓).几何平均组胺PD存在显着减少20.在过敏原期间(以前724(324-1,622)μg与316后(166 - 603)µg;P <0.01),对应2.3倍剂量。相反,组胺PD20.是否不受反复剂量稀释剂(457 (178 - 1175)g)的影响与562(302-1,047)μg之后;p = 0.48;无花果。 2⇓).两期组胺反应性无差异(p>0.05),组胺PD的变化20.在挑战期之间显着差异(对数移位组胺PD20.-0.36与过敏原和稀释剂分别为0.09;p < 0.01)。
呼出不
该集团Fe,不在最后过敏原后24.7±2.3 ppb之前从8.6±1.4 ppb增加到14.7±2.3 ppb(P <0.05;图3⇓).相比之下,没有重大变化Fe,不稀释期间(9.8±1.7 ppb前)与10.4±1.6之后;p> 0.05)。然而,当对个体评估时,过敏原期间没有水平的变化与组胺PD的相应减少没有显着的数学相关性20.值(r = 0.394; p = 0.33)。
逐渐增加水平Fe,不在低剂量过敏原期间的呼气空气中,与水平保持稳定的稀释剂时期相比(图4⇓).的水平Fe,不在健康对照组中也是稳定的(图4⇓).然而,平均水平Fe,不在观察期间,健康对照组与哮喘受试者相比显著降低(p<0.05;图4⇓).
有趣的是,个体内变异系数Fe,不哮喘受试者在过敏原刺激期间为20.7(6.7-37)%,在稀释期间为12.8(6.7-31)%,与变异性系数相似Fe,不在健康受试者(14.2(9.2-25)%)。
气道对腺苷的反应性
虽然所有具有哮喘的哮喘受试者对组胺具有高反应性,但只有四个产生了PD20.对于1,600 mg·ml的amp−1包容性。在这些受试者中,与稀释期相比,在重复过敏原攻击后,对AMP 48小时的反应性没有显着增加(对偶尔PD20.AMP分别为-0.37和0.17,分别在过敏原和稀释剂后;p = 0.14)。可以计算PD10.7名受试者使用AMP,但在过敏原期AMP反应性的变化与稀释期无显著差异(log shift PD)10.AMP -0.18与变应原和稀释剂后分别为0.17;p = 0.06)。
尿介质
尿9α11β-PGF的基线早晨浓度2和LTE4在两个挑战期间保持不受影响(表3)⇓).然而,哮喘受试者尿液中9α11β-PGF的基线浓度显著较高2(图。5A⇓)和LTE.4(图5B⇓)与健康对照组进行比较。
在第1天和第7天的过敏原刺激后,两种介质的尿排泄量均无增加(表3)⇑).然而,9α11β-PGF的尿液排泄增加2在反复过敏原末端的腺苷挑战后,但在稀释剂期结束时(表3⇑).LTE尿路水平4在两次腺苷挑战后没有改变(表3⇑).
讨论
本研究记录了轻度哮喘患者在9天内7次重复低剂量过敏原暴露后气道对组胺的反应性增加。同时,受试者没有哮喘症状,也不需要使用救援支气管扩张剂药物。此外,尽管受试者基线气道直径没有变化,但气道反应性增加。因此,这项研究进一步表明,低剂量过敏原激发法非常适合研究过敏性气道炎症的早期事件和AHR的相关机制。与以往大多数使用不同方案的低剂量过敏原挑战的研究不同,目前的作者包括一个稀释期,因为根据疾病的自然进程,哮喘受试者可能显示气道反应性和炎症的自发变异性增加。此外,还包括一组在类似挑战期间吸入稀释剂的健康个人。另一项提高模型分辨率的措施是尽量减少研究过敏原的意外环境暴露。因此,本文作者在非季节进行了研究,并特别排除了屋尘螨过敏的受试者,因为消除这种特定的自然暴露非常困难,并可能在许多研究中引入了混杂的炎症背景触发器。
研究中的主要发现是在重复的低剂量过敏原曝光期间呼出空气中没有水平的逐步增加。因此,平均值Fe,不过敏原挑战后几乎翻了一番,而水平Fe,不在同一受试者中对稀释剂反复挑战,在反复挑战后保持不变和稳定。目前的发现证实并扩展了一组调查人员的报告,在重复低剂量过敏原挑战后增加呼出的呼出量没有水平8,25..然而,呼出的增加没有与其中一项研究中的甲素增加到甲磺酸的增加25..由于本研究的受试者没有哮喘症状,也没有肺功能的变化,这一发现支持了增加的假设Fe,不可能是气道炎症增加的早期和非常敏感的迹象。已经记录了测量Fe,不间隔4 - 8周可改善吸入类固醇的剂量,以达到哮喘控制26..早期的和渐进的上升Fe,不在过敏原挑战期开始后的几天内被发现。这表明监测Fe,不如果有机会在病情恶化达到“不可逆转点”(到目前为止没有任何治疗能够消除病情恶化)之前进行治疗,则每天进行治疗可能是早期发现病情恶化的一种策略27..
本研究还表明,甚至温和未经治疗的哮喘的受试者均具有更高的基线水平Fe,不比一群健康的控制者在稀释期间,哮喘受试者仍然有稳定水平Fe,不日常变异性与健康对照的变异相似。相比之下,在过敏原期间,可变性Fe,不水平增加,表明气道炎症增加的另一个早期迹象可能会增加日常变异性Fe,不.
该研究的第二个终点是评估监测LTE尿水平的有效性4肥大细胞标志物9α11β-PGF2.发现,当在10天期间进行四次评估时,与健康对照相比,哮喘受试者在尿液中的两种介质的基线水平升高。虽然差异很小,但它是显着的,并且表明通过进行重复的采样,即使在相对较小的受试者中,也可以检测差异。大多数未能在泌尿LTE中找到显着差异的研究4在健康受试者和具有轻度哮喘的受试者之间比较了由单一测量组成的横截面数据,这显然不足以检测小差异28..
然而,在哮喘受试者中,在过敏原刺激期间,两种介质的基线尿排泄量均无进行性变化。在组水平上发现的唯一显著差异是9α11β-PGF的增加2在过敏原期48小时后AMP激发后排泄。尿9 11αβpgf2是最灵敏的检测肥大细胞激活的方法11..因此,发现9α11β-PGF增加2在过敏原期间支持肥大细胞的灌注或增加肥大细胞的浸润,特别是随着AMP的剂量在此之前和之后相似。提高肥大细胞活化的目前的观察结果可能涉及另一种低剂量过敏原攻击研究中痰中含量增加的甲基族细胞数量增加的报告2顺便说一句,这是唯一一项使用稀释剂作为对照的研究。诚然,目前的作者观察到AMP对前列腺素D的影响2(PGD2)释放很小,需要进一步的研究来建立这种机制。随着AMP挑衅在上次过敏原吸入后48小时进行,也可能存在增加肥大细胞活化的峰值。另外,考虑到预定的PD5剂量仅导致FEV小幅下降1可以想到,较大的重复过敏原剂量可能产生尿记标记物或气道反应性的显着变化。
肥大细胞产物PGD适度增加的原因之一2在目前的研究中,可能与使用的方案获得的AMP相对不敏感有关。因此,8名受试者中只有4人出现帕金森病20.服用AMP由于AMP挑战被认为对哮喘非常有针对性,令人有点惊讶的是,在轻度哮喘组中,只有一半的受试者对AMP表现出显著的反应。然而,目前的AMP挑战方案可能不是最佳方案。
显然,目前的数据支持得出的结论Fe,不是比尿LTE更敏感、更早期的气道炎症标志物吗4.事实上,可能有一个机制解释的水平不变的尿LTE4在目前的研究中。因此,最近在外周肺模型中观察到NO特异性地抑制变应原诱导的白三烯释放29..在早期气道炎症过程中一氧化氮水平的升高可能是一种重要的保护机制,旨在限制炎症的发展。
总之,虽然关于一氧化氮主要是促进或抗炎的辩论,但目前的研究无疑是支持呼出一氧化氮馏分的频繁连续测量有可能提供非常敏感的早期检测策略气道炎症。此外,低剂量过敏原挑战模型30.在没有基线支气管收缩和持续哮喘症状的情况下,为安全、可控的气道高反应性和气道炎症机制的研究提供了机会。
致谢
作者谨感谢A. Guhl、I. Delin、M. Andersson、B. Rasberg、H. Blomqvist和C. Larsson提供的技术援助。
- 收到了2005年12月14日。
- 接受2006年2月14日。
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