摘要gydF4y2Ba
绵羊肺腺癌(OPA)是一种肺癌,与人以细支气管肺泡成分为主的肺炎型混合侵袭性腺癌惊人地相似。研究了OPA中的端粒酶活性以及激酶Akt在端粒酶激活和细胞增殖调控中的潜在参与。gydF4y2Ba
肺组织取自组织病理学诊断为OPA的绵羊或对照组。获得上皮细胞培养物gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba来自肺组织。端粒酶活性用端粒重复扩增法测定。Western blotting检测Akt磷酸化水平。gydF4y2Ba
端粒酶活性在OPA肺组织中明显高于对照组肺组织。在肿瘤来源的12个原代细胞培养物中有8个(67%)检测到高端粒酶活性。在27个肿瘤中有10个(37%)肿瘤中发现磷酸化Akt的高水平表达,在肿瘤来源的原代细胞培养中,Akt的激活因表皮生长因子刺激而消失。gydF4y2Ba
端粒酶活化发生在羊肺腺癌肿瘤细胞中,可能部分归因于Akt活化。端粒酶可能抑制细胞衰老,并有助于肿瘤细胞在细支气管肺泡成分混合腺癌的积累。进一步的工作是必要的,以确定肿瘤端粒酶激活的替代信号通路。gydF4y2Ba
- 一种蛋白激酶gydF4y2Ba
- 支气管肺泡癌gydF4y2Ba
- 雅格西克特绵羊逆转录病毒gydF4y2Ba
- 肺癌gydF4y2Ba
- 端粒酶gydF4y2Ba
- ⅱ型pneumocytegydF4y2Ba
在发达国家,肺癌是癌症死亡的主要原因。非小细胞肺癌约占肺癌的80%,腺癌是最常见的细胞类型,占所有肺癌病例的40%。肺腺癌可表现为肺型腺癌(P-ADC),其典型影像学特征为弥漫性或弥散性肺泡凝露,伴或不伴空气支气管造影,显示肺右向左分流,同时肺中有腺癌肿瘤细胞的证据gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。P-ADC的组织学类型可能包括细支气管肺泡癌(BAC),其定义为一种单纯细支气管肺泡生长模式的腺癌,没有基质、血管或胸膜侵犯的证据gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,或更常见的混合型腺癌,主要是细支气管肺泡成分和乳头状或腺泡浸润成分gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
绵羊肺腺癌(OPA)是一种自然发生的肺癌,在绵羊感染雅格西克特绵羊逆转录病毒(JSRV)时自发发生,并可通过实验接种该病毒的羔羊繁殖gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。它在肺周围呈播散型生长。OPA是一种混合型腺癌,含有相当比例的BAC成分,并伴有乳头状和腺泡状生长模式gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。OPA也与人类P-ADC具有显著的临床和放射学同源性,包括进行性肺内扩散和缺乏远端胸外转移gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,从而为周围型肺癌特别是P-ADC提供了一种独特的自然且可复制的动物模型。gydF4y2Ba
与之前的研究相反,这些研究的重点是确定JSRV结构蛋白在啮齿动物中的致癌特性gydF4y2Ba5gydF4y2Ba本研究的目的是确定发生在自发肿瘤中的致病过程gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。可能涉及肿瘤形成的机制包括致癌突变导致的广泛细胞分裂、细胞衰老的失活、肿瘤抑制途径或可能阻止潜在癌细胞增殖或诱导其死亡的凋亡机制gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。细胞衰老是一个被描述得最多的过程gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba,即在培养物中生长的原代正常细胞不会无限增殖,而是退出细胞周期(在快速增殖一段时间后),以响应包括端粒功能失调在内的多种调控机制gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。最近,细胞衰老也得到证实gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba在恶性前期细胞中,但不是恶性细胞,这表明它可能是一种重要的抗癌防御gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
细胞衰老主要是由端粒酶调控的,端粒酶是一种核糖核蛋白酶,能够稳定端粒的长度gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba端粒的合成和现有端粒的延长。端粒酶激活被认为是肿瘤细胞逃脱细胞衰老并获得增加的增殖能力所必需的gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。端粒酶逆转录酶(TERT)催化亚基是端粒酶活性的主要决定因素gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。TERT的激活已经在人类癌细胞系和包括肺癌在内的肿瘤中得到了很好的证实gydF4y2Ba10gydF4y2Ba而在大多数正常体细胞中,端粒酶活性受到抑制。端粒酶活性的复杂调控可能包括Akt通过TERT磷酸化(P)的磷脂酰肌醇-3 ' -激酶(PI3K)途径gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。Akt参与调控细胞存活和细胞周期进程,在包括肺癌在内的多种人类肿瘤中被组成性激活gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
在本研究中,端粒酶活性的增加在肿瘤和来自OPA的肿瘤细胞的原代培养中得到证实,这表明抑制细胞衰老可能参与了肿瘤的发生和肺内肿瘤细胞的聚集。接下来的研究表明,调控激酶Akt在OPA肿瘤中被组成性激活,而在来自OPA的原代培养物中调控异常,这表明Akt可能参与了部分肿瘤中端粒酶的激活。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
肺组织gydF4y2Ba
立即收集肺组织gydF4y2Ba事后剖析gydF4y2Ba来自体重减轻、吐气困难和大量的肺分泌物,提示有外环脂肪酸或没有外环脂肪酸迹象的绵羊。组织切片取样并在-70°C保存,直到使用或固定在福尔马林中进行组织病理学检查。根据2004年世界卫生组织的分类,这些组织被分为肿瘤肺和非肿瘤肺(或对照)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
肺泡上皮II型细胞的培养gydF4y2Ba
从羊肺中分离出肿瘤细胞和正常ii型肺细胞,并对其进行鉴定。简单地说,组织样本在Eagle 's最低必要培养基(Eurobio, Courtaboeuf, France)中4°C消化过夜,培养基中含有0.025%胶原酶I, 10 μg·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba脱氧核糖核酸酶,1 mg·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba蛋白酶XIV (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France), 50 μg·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba链霉素,50u·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba青霉素50 μg·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba庆大霉素2.5 μg·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba两性霉素B和100 U·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba制霉菌素。然后将细胞均质,并通过40 μm过滤器过滤,以消除细胞碎片。在430×离心10分钟后gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下,肺细胞在选择性上皮细胞培养基中被胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白涂层板上(Quantum 286;PAA实验室,Pasching,奥地利)含有5 ng·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba肝细胞生长因子10 ng·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba角质细胞生长因子(Abcys,巴黎,法国)。来自OPA肿瘤(n = 12)和非肿瘤肺(n = 4)的细胞分别被称为肿瘤细胞和对照细胞。gydF4y2Ba
绵羊逆转录病毒前病毒DNA的检测gydF4y2Ba
根据供应商(Qbiogene, Carlsbad, CA, USA)的建议,使用Fastprep设备制备肺肿瘤和对照肺的总基因组DNA。采用半巢式PCR方法检测前病毒DNA。简单地说,反应混合物含有500 ng总基因组DNA, 50 μL 1×缓冲液(1.5 mM MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 67 mM Tris-HCl (pH 8.8), 16 mM (NHgydF4y2Ba4gydF4y2Ba)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba, 0.01%吐温20),每个脱氧核苷酸三磷酸0.2 mM,每个引物0.2 mM和1.25 U Taq聚合酶(Eurobio)。第一轮PCR采用引物JSRV42 (sense), 5 ' -CTTTGTATTTCCCTGTGTCG-3 ',对应核苷酸7041-7060gydF4y2BaenvgydF4y2BaJSRV基因组序列的基因(GenBank登录号gydF4y2BaAF105220gydF4y2Ba)和JSRV53(反义),5 ' - ggattcttacacaatcac -3 ',分别对应于JSRV基因组序列长末端重复序列(LTR) U3区的7381-7362核苷酸。第二轮PCR采用JSRV基因组序列LTR U3区核苷酸7366-7346对应的5 ' -CACCGGATTCTTATATAATC-3 '的JSRV42和JSRV52(反义)1-5 μL PCR产物进行。PCR反应进行如下:95℃下5 min, 95℃下30 s, 50℃下30 s, 72℃下1 min, 35个循环,95℃下最终延伸10 min。gydF4y2Ba
细胞增殖试验gydF4y2Ba
细胞数量采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2-5-二苯基溴化四氮唑(MTT)法测定。简单来说,5000个细胞·井gydF4y2Ba1gydF4y2Ba将其镀于96孔板中,在37℃、5%的二氧化碳气氛中孵育96小时。MTT被推荐用于MTT细胞增殖检测试剂盒(Chemicon, Temecula, CA, USA)。每孔加入MTT (10 μL), 37°C孵育4 h。在100 μL 1N异丙醇/0.04N HCl中溶解后,使用Wallac Victor II设备(perkins - elmer, Wellesley, MA, USA)在595 nm处读取吸光度。每次测量重复三次。gydF4y2Ba
流式细胞术gydF4y2Ba
碘化丙啶染色后,用流式细胞仪分析细胞核DNA含量,定量测定细胞周期。简单地说,1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba用胰蛋白酶解离后收集细胞,PBS洗涤两次,然后用70%乙醇在-20℃固定。清洗一次后,用1 mg·mL处理细胞gydF4y2Ba1gydF4y2Ba核糖核酸酶A (Sigma-Aldrich)在4℃下孵育30 min,用20 μg碘化丙啶(Sigma-Aldrich)孵育,流式细胞仪分析。使用FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)和488 nm氩离子激光分析>万次事件的DNA含量。gydF4y2Ba
端粒酶活性测定gydF4y2Ba
冷冻组织或细胞在250µl冰冷的1×3-((3-胆酰胺丙基)二乙基氨基)-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)裂解缓冲液(Intergen公司,Purchase, NY, USA)中裂解,并使用Fastprep设备粉碎。裂解物在冰上孵育30分钟,然后在18000 ×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置30分钟。收集上清液,用改良的Lowry蛋白测定法测定蛋白浓度(Perbio Science, Brébières,法国)。端粒酶活性采用端粒重复扩增协议(TRAP)方法,使用TRAP-eze ELISA端粒酶检测试剂盒(Intergen公司),按照制造商的建议进行检测。简单地说,使用了200 ng总蛋白。以不含蛋白质的裂解液为阴性对照。含有端粒酶活性的对照细胞提取物和含有8个端粒重复序列的合成寡核苷酸(随试剂盒提供)被用作阳性对照。对于每个细胞样品,还制备了热灭活(85°C下10分钟)的阴性对照样品。PCR扩增后,TRAP产物溶解在12%的聚丙烯酰胺凝胶上,并用1:10 000 SYBR Gold (Molecular Probes (Invitrogen), Eugene, OR, USA)进行观察。每个反应的扩增效率使用所提供的形成36-bp条带的内对照寡核苷酸来确定。使用半定量ELISA方法评估端粒酶活性,并表示为样品中端粒酶活性与端粒酶阳性对照细胞中端粒酶活性的比值。 All experiments were performed at least in duplicate. Measurements were reported as mean±扫描电镜gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
磷酸化Akt、总Akt和衣壳蛋白的免疫检测gydF4y2Ba
冷冻组织或细胞在250 μL裂解液(0.5M Tris pH 8.0, 10%甘油,150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 1 mM Na)中裂解gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba签证官gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,苯甲基磺酰氟1 mM, 10 μg·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba亮抑酶肽,10μg·毫升gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抑肽蛋白),用Fastprep系统设备(Qbiogene)均质,并在冰上孵育30分钟。裂解液在18000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba将50 μg蛋白质在12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离,转移到0.2 μ m的硝化纤维膜上(Biorad Laboratories, marne -la- coquette, France)。在室温(20°C)下,用25 mM Tris (pH 7.6)/0.15 M NaCl/0.05% Tween 20 (TSBT)含5%脱脂干牛奶预孵育1小时。在TSBT中洗涤三次后,膜在4°C下与1:10 00稀释的兔抗P-Akt(丝氨酸473)多克隆抗体或总Akt (Cell signaling, Danvers, MA, USA)在含有5%牛血清白蛋白的TSBT中稀释过夜。为了检测衣壳抗原蛋白,将膜与1:10 000稀释的兔抗JSRV衣壳蛋白多克隆抗体在室温下孵育1小时(由美国科罗拉多州科林斯堡科罗拉多州立大学微生物学、免疫学和病理学学系J.C. De Martini慷慨提供)。膜在室温下用TBST洗涤3次5分钟,并在室温下用含有5%脱脂干牛奶(1:10 0 000)的TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白G (Sigma-Aldrich)孵育1小时。使用增效化学发光检测试剂盒(Perbio Science)检测免疫反应条带,使用Un-Scan-It软件(Silk Scientific Corporation, Orem, UT, USA)进行量化,并与A549对照细胞相比以百分比表达。P-Akt表达的测量结果为均数±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba。凝胶上的蛋白质量由针对β-肌动蛋白的小鼠单克隆抗体(Sigma-Adlrich)对肌动蛋白(Sigma-Aldrich)的免疫检测控制。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
使用Mann-Whitney u检验比较肿瘤和非肿瘤样品中的端粒酶活性和P-Akt表达。除非另有详细说明,否则试验是双尾的。只有p值<0.05被认为是显著的。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
肿瘤的特征gydF4y2Ba
肺组织取自OPA肿瘤和非肿瘤对照肺。所有肿瘤的组织病理学检查均证实了OPA(伴有细支气管肺泡成分的侵袭性混合腺癌,与腺泡和/或乳头状生长模式相关)的诊断,而所有对照肺均证实无肿瘤。此外,肺组织评估了JSRV原病毒和衣壳抗原蛋白的存在。通过PCR分析,12个肿瘤肺中有11个(92%)检测到JSRV前病毒DNA, 4个对照肺中没有检测到。同样,通过Western blot分析,12个OPA肺中有12个检测到JSRV衣壳蛋白,但4个对照肺中没有检测到JSRV衣壳蛋白。gydF4y2Ba
肿瘤中的端粒酶活性gydF4y2Ba
作为研究端粒酶激活参与OPA的第一种方法,使用TRAP法测量了来自OPA肿瘤(n = 12)和非肿瘤对照肺(n = 4)的肺组织中的端粒酶活性。如图1a所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,聚合酶链反应产物显示为聚丙烯酰胺凝胶上的DNA阶梯,表明所有OPA样本(n = 12)均存在端粒酶活性,但对照肺的样本均无端粒酶活性。ELISA半定量结果显示,与对照肺相比,OPA组织的端粒酶活性显著升高(p = 0.03(单侧Mann-Whitney检验);图1 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).因此,这些结果表明,在JSRV感染被证实的肿瘤(有细支气管肺泡成分的侵袭性混合腺癌)中存在高端粒酶活性。gydF4y2Ba
肿瘤细胞培养的特征gydF4y2Ba
下一个目标是证明在整个肿瘤中观察到的端粒酶活性可归因于肿瘤细胞gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba(并且不伴有肿瘤肺中的非肿瘤细胞)。原代培养来自肿瘤(n = 12)和对照肺(n = 4)。这些细胞使用针对ii型肺细胞特定标记物(表面活性剂蛋白A和C)的抗体和透射电镜进行免疫细胞化学鉴定。正如预期的那样,来自肿瘤和正常肺的原代细胞显示出典型的上皮细胞的立方形态。表面活性剂蛋白A和C在>95%的细胞中表达,证实了培养物的纯度,并且在所有传代中都保持纯度。通过PCR分析,在来自所有OPA肺的细胞培养物中检测到JSRV基因组,但在来自对照组肺的对照ii型肺细胞中没有检测到JSRV基因组。来自肿瘤的培养细胞可以维持7到10个传代,而对照细胞只能维持2到3个传代。gydF4y2Ba
为了评估来自肿瘤和对照肺的细胞培养物的生物学相关性,分析了肿瘤细胞和对照细胞在整个细胞周期中的增殖和分布。使用MTT试验,结果表明,与来自对照肺的ii型肺细胞相比,来自肺肿瘤的细胞表现出显著的增殖优势(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).同样,流式细胞术细胞周期分析表明,肿瘤细胞培养中S期细胞的比例(17±3.2%)高于对照ii型肺细胞(8.5±1.9%)。gydF4y2Ba
肿瘤细胞培养中的端粒酶活性gydF4y2Ba
为了证明在整个肿瘤中观察到的端粒酶活性可归因于肿瘤细胞gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba端粒酶活性在来自肿瘤和对照的原代细胞培养物中进行了评估。使用TRAP法和ELISA法对端粒酶活性进行半定量测量,结果显示,与对照组ii型肺细胞相比,在12个肿瘤原代培养物中有8个(67%)的端粒酶活性水平特别高(图1c)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).令人惊讶的是,在肿瘤细胞培养的12个细胞中,有4个(33%)没有发现端粒酶活性(在整个肿瘤中检测到端粒酶活性)。因此,这些结果表明,在大多数肺肿瘤细胞培养物中存在高水平的端粒酶活性,并表明在整个肿瘤中观察到的端粒酶活性确实归因于肿瘤细胞gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba在大多数肿瘤中gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
肿瘤细胞培养中Akt调控异常gydF4y2Ba
端粒酶活性的调控是复杂的,可能涉及通过Akt激酶的磷酸化激活TERT。为了确定端粒酶激活是否与Akt通路有关,我们在opa来源的细胞培养中研究了Akt丝氨酸473的磷酸化状态。来自肿瘤和正常肺的ii型肺细胞在缺乏生长因子的情况下培养24小时,然后暴露于或不暴露于100 ng·mLgydF4y2Ba1gydF4y2Ba表皮生长因子(EGF),一种已知的哺乳动物细胞中Akt的激活物,作用30分钟。通过Western blotting在来自肺肿瘤的未刺激细胞和对照ii型肺细胞中检测到类似的P-Akt中度表达(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),表明培养条件(包括剥夺生长因子)可能导致未刺激细胞中Akt的基础磷酸化和激活。然而,EGF刺激gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba导致Akt激活在对照细胞中显著增加,而来源于肺肿瘤的细胞对EGF刺激无反应(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).这些结果表明,在OPA细胞培养中,EGF-Akt通路调控异常,Akt在肿瘤细胞培养中缺乏对生长因子刺激的激活。gydF4y2Ba
Akt在肿瘤中的活化gydF4y2Ba
为了进一步表征Akt在OPA中的调控异常,接下来用Western blotting分析研究了Akt在全肿瘤(n = 27)和正常肺组织(n = 14)中的激活,并以人类A549上皮细胞为参考。如图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba在27例OPA肿瘤中有10例(37%)显示P-Akt显著表达,14例对照肺中无P-Akt表达(表1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),而总Akt和actin的表达在两组间相似。因此Akt被激活,可能参与了相当一部分OPA肿瘤的端粒酶激活。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在本研究中,端粒酶在OPA中被激活,OPA是一种混合型肺腺癌,具有突出的细支气管肺泡成分。端粒酶激活在肿瘤中被证明,以及在这些肿瘤衍生的上皮细胞培养中被证明。接下来,研究了作为端粒酶潜在激活剂的调控激酶Akt的激活,结果表明Akt确实在一定比例的肿瘤中被激活。综上所述,这些结果表明,在OPA中,细胞衰老的抑制可能参与了肿瘤的发生和肿瘤细胞在肺内的聚集,Akt激活可能参与了部分肿瘤的端粒酶激活。gydF4y2Ba
P-ADC与其他类型的非小细胞肺癌有几个不同之处,包括女性发病率较高,吸烟的作用较小,缺乏远处转移扩散和对EGF酪氨酸激酶抑制剂的敏感性较高。P-ADC的临床综合征仍然是非小细胞肺癌的罕见表现,阻碍了研究。gydF4y2Ba
选择OPA作为P-ADC的模型,是因为它与人类疾病有许多共同的关键特征,包括类似的进行性呼吸困难的临床和放射学表现,以及大量的支气管;多灶性肺部疾病伴肺泡实变和结节;几乎完全相同的病理gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。与BAC中的肿瘤细胞一样,OPA中的肿瘤细胞来源于ii型肺细胞,在较小程度上来源于Clara细胞。人类和绵羊肿瘤的BAC成分均以鳞状扩散为特征,肿瘤细胞沿肺泡间隔生长;与罕见的纯BAC不同,细支气管肺泡组分混合腺癌包括间质、血管和/或胸膜侵犯,以及相关的腺泡和主要乳头状生长模式gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。有证据表明,OPA在免疫组织化学上与人类混合BAC相似gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,表达细胞角蛋白7,核表达甲状腺转录因子-1,缺乏细胞角蛋白20,并通过电镜观察(数据未显示)。与之前关于OPA的工作相反,在这些工作中,研究主要是在用JSRV基因表达载体转染的永生细胞系或啮齿动物成纤维细胞中进行的gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba在本研究中,有可能从自然发生的肿瘤和对照肺中获得原代细胞培养。致病因子JSRV的基因组前病毒DNA仅在肿瘤细胞中检测到。此外,来自OPA肿瘤的细胞表达表面活性剂肺相关蛋白A和C (ii型肺细胞的标记物)和甲状腺转录因子-1,表明它们的特异性表型得以维持gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。重要的是,端粒酶激活的一致结果在肿瘤和来自肿瘤的上皮细胞培养中同时获得,无疑增加了目前观察的生物学相关性。gydF4y2Ba
与对照组非肿瘤肺相比,OPA肺肿瘤中端粒酶活性较高。在所有的OPA肿瘤中检测到端粒酶活性,可能是由于肿瘤细胞内的端粒酶激活。作为位于肿瘤内的细胞,而不是癌细胞gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba如支气管黏膜淋巴细胞gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,也可能表达端粒酶活性,原代细胞培养来源于相同的肺肿瘤;端粒酶活性在三分之二来源于肿瘤的上皮细胞培养物中被发现,因此表明在整个肿瘤中观察到的端粒酶活性至少部分归因于肿瘤细胞gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba。在端粒酶阳性肿瘤细胞培养物中,三分之一未发现端粒酶活性;本文作者假设,如先前报道的那样,浸润肿瘤的活化淋巴细胞或其他炎症细胞可能是这种情况下端粒酶活性的原因gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。端粒酶激活的替代途径是否也有助于在端粒酶阴性的肿瘤细胞培养中逃避细胞衰老仍有待确定gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。相反,在对照肺组织和细胞培养中发现端粒酶活性低,可能是由于ii型肺细胞亚群具有自我更新能力,被认为在损伤后修复肺泡上皮gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。另外,对照组肺中的端粒酶活性可能是由于非肿瘤肺中的淋巴细胞被激活,这是自然繁殖动物中常见的各种临床下感染的结果,尽管本研究中对对照组肺的病理分析并没有表明这一点。gydF4y2Ba
OPA中端粒酶的激活提示细胞衰老的抑制可能参与了肿瘤的发生,并参与了肿瘤细胞沿肺泡间隔积聚的过程。端粒终止真核染色体并参与染色体完整性。正常体细胞的端粒持续缩短最终导致细胞增殖的停滞,这是一种被称为细胞衰老的生理过程,它控制细胞寿命并限制细胞分裂的数量gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。端粒酶活性的激活主要依赖于其催化亚基TERT,有助于端粒长度的维持和细胞衰老的抑制,从而导致细胞永生化和癌症gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。因此,在OPA中发现端粒长度保持不变(数据未显示)。除了其酶活性外,TERT亚基可能通过与端粒直接相互作用来增强基因组稳定性gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,可能参与p53诱导的细胞凋亡的调控gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。端粒酶激活是癌发生的早期事件,伴随着p53过表达,视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)失活和b细胞白血病/淋巴瘤2基因产物(Bcl-2)/Bcl-2相关X蛋白(Bax)在高侵袭性支气管病变前(从中度发育不良水平开始)比例的降低,表明端粒酶激活、增殖和抗凋亡之间存在耦合gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。尽管端粒酶激活在包括肺癌在内的多种人类癌症中都有描述gydF4y2Ba10gydF4y2Ba在P-ADC和具有BAC特征的混合腺癌中尚未得到广泛的研究。通过非定量方法评估,10例人BAC中有4例检测到端粒酶活性,表现为孤立结节gydF4y2Ba25gydF4y2Ba97%的外周性和小型非粘液性BACgydF4y2Ba26gydF4y2Ba,但这类肿瘤可能不能代表临床定义的P-ADCgydF4y2Ba1gydF4y2Ba。有趣的是,端粒酶激活本身并不足以转化人类细胞gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。P-ADC和OPA也可能发生细胞衰老抑制以外的机制(如细胞凋亡抑制或细胞增殖的解除),这可以通过观察到与对照细胞相比,肿瘤来源的细胞培养物的增殖增加来证明。gydF4y2Ba
端粒酶活性的复杂调控涉及多个途径,包括Akt对TERT的磷酸化和激活gydF4y2Ba11gydF4y2Ba是一种参与调节癌症特征过程的激酶,如细胞增殖和存活、细胞大小、对营养可用性的反应、血管生成和组织侵袭gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。Akt过表达可转化NIH3T3细胞,提示Akt是一种潜在的致癌基因gydF4y2Ba29gydF4y2Ba。研究了Akt在端粒酶激活中的潜在作用,并在OPA肿瘤中观察到EGF-Akt通路的失调。因此,Akt激活在很大比例的OPA肿瘤中存在,但在对照肺中没有。与对照细胞相比(EGF刺激显著诱导Akt磷酸化),肿瘤细胞培养中Akt活化不足,表明肿瘤细胞中EGF - Akt通路调控异常。Akt激活的基础水平在肿瘤细胞培养物和非肿瘤肺细胞培养物中是相当的,这一发现可能与细胞培养的人为因素有关(剥夺生长因子或更换培养基可能导致Akt在肿瘤细胞培养物和非肿瘤细胞培养物中适度激活gydF4y2Ba28gydF4y2Ba).综上所述,目前的结果表明Akt激活可能参与了OPA中端粒酶的激活和细胞衰老的调控,正如最近在具有BAC特征的人混合腺癌中显示的那样gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。替代途径,如ras -丝裂原激活蛋白激酶激酶(MEK) -丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径gydF4y2Ba15gydF4y2Ba也可能参与该肿瘤的端粒酶调控,因为Akt激活并没有在所有端粒酶阳性肿瘤中发现。gydF4y2Ba
一些研究已经确定了编码JSRV包膜的基因(gydF4y2BaenvgydF4y2Ba), OPA的致病因子,作为一种潜在的致癌基因,并已表明其过度表达足以转化啮齿动物成纤维细胞gydF4y2Ba31gydF4y2Ba和上皮细胞系gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。JSRV转染gydF4y2BaenvgydF4y2Ba在哺乳动物细胞中诱导Akt的组成性激活;使用pi3k - Akt -哺乳动物雷帕霉素靶点通路的化学抑制剂的研究进一步证明了Akt和Ras-MEK-MAPK通路在jsrv诱导的细胞转化中的核心作用gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,尽管Akt在自然发生的OPA中激活的确切机制仍是未知的。gydF4y2Ba
最近,激活突变的EGF受体(EGFR)互斥K-gydF4y2Ba拉gydF4y2Ba在肺腺癌中已经报道了突变,特别是显著的非粘液性BAC成分,并且可能与EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼的临床反应有关gydF4y2Ba33gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba35gydF4y2Ba。EGFR的激活与下游信号通路的激活相关,包括该肿瘤中的PI3K-Akt和ras - mek细胞外信号调节激酶通路gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。此外,Akt磷酸化增加(不受EGFR酪氨酸激酶抑制剂的抑制)已被证实gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba在特定的腺癌细胞亚群中,尽管与亲本细胞系相比,EGFR基因突变缺失,但这些细胞系已经对吉非替尼产生了天然抗性gydF4y2Ba37gydF4y2Ba。因此,这些观察结果表明PI3K-Akt通路的组成性激活可能独立于EGFR突变而发生,并且可能是肺腺癌的一个有吸引力的治疗靶点。目前正在进行研究,以确定来自OPA的细胞中EGF-Akt通路的失调是否与EGFR基因突变类似。gydF4y2Ba
总之,已经证明端粒酶激活发生在羊肺腺癌肿瘤细胞中,并可能部分归因于Akt的激活。端粒酶激活可能通过抑制细胞衰老来促进肺内肿瘤细胞的积累。通过端粒酶特异性抑制和/或调节Akt通路,可以预见未来伴有细支气管肺泡癌特征的人肺炎型腺癌的治疗策略。绵羊肺腺癌为治疗这种不治之症的创新方法的疗效的临床前评估提供了一个有吸引力的模型。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2005年10月26日gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2006年1月23日gydF4y2Ba
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参考文献gydF4y2Ba
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