摘要
即使在相同的环境中,矽肺发展的个体间差异也已被报道,这表明遗传因素在矽肺病因学中的贡献。本研究的目的是确定是否有任何显著的遗传影响矽肺的发展。此外,哪些基因位点对二氧化硅暴露的肺反应负责?
8株近交系小鼠被用来研究遗传对二氧化硅暴露肺纤维化反应的影响。将最敏感和最耐药菌株进行杂交,进行全基因组QTL连锁分析。以羟脯氨酸为指标,利用毛细管型测序仪进行片段分析,对167个标记基因进行基因型分析。
8个品系小鼠羟脯氨酸含量的平均浓度在品系间存在显著差异。在最敏感的C57BL/6J和最耐药的CBA/J之间进行了育种研究。对接触二氧化硅的交叉队列进行全基因组连锁分析,在第4染色体上发现了显著QTL,在第3和第18染色体上发现了暗示性QTL。
本研究表明,遗传因素可能在纤维肺对二氧化硅的反应中起重要作用;鉴定出1个显著性位点和2个暗示性位点。
矽肺是一种因吸入含有自由晶体二氧化硅的粉尘而引起的职业性肺病。尽管目前的防护设备技术充足,但游离二氧化硅仍然是一种职业性纤维性危害。在美国,据估计有20万矿工和170万非矿工因职业原因接触到吸入二氧化硅1。在晚期,矽肺可合并肺结核、进行性大规模纤维化引起的呼吸衰竭、肺气肿、肺癌等。二氧化硅粉尘的这些不利影响已引起相当多的注意。
关于矽肺的发展,外界因素如持续时间、暴露量和游离晶二氧化硅的含量被认为是矽肺进展的关键决定因素2。然而,一些可能影响矽肺易感性的内在(遗传)因素已被报道。特异性人类白细胞抗原(HLA)单倍型与矽肺的关联已在日本人群中报道3.。在德国人群中,HLA单倍型与煤矿工人尘肺病也有报道4。促炎细胞因子基因多态性的相关性(如。肿瘤坏死因子-α,白细胞介素-1受体)已被报道5–7。除了这些流行病学研究,目前的作者阐明了遗传背景对小鼠矽肺模型炎症和纤维化反应变化的重要性8,9。
本研究的目的是利用近交系小鼠鉴定硅诱导肺纤维化易感性的遗传基础。近交系小鼠为了解决定对复杂疾病过程易感性的遗传和环境因素提供了一个特征良好的动物模型。此外,小鼠被认为是人类疾病过程的优秀模型,因为小鼠和人类基因组之间存在广泛的连锁同源性。
任何遗传影响对二氧化硅的炎症和纤维化反应进行了检测在8株近交系小鼠。在目前的模型中,对导致矽肺的基因进行了全基因组搜索。目前的研究报告了与二氧化钛(TiO)相比,8种小鼠的纤维化反应有显著的遗传影响2)-灌注对照,杂交(F2)小鼠的连锁分析在第4号染色体上发现了显著的数量性状位点(QTL),在第3和18号染色体上发现了暗示性QTL。目前研究的一些结果之前已经报道过9。
材料与方法
动物
以下自交系雄性小鼠(6-8周龄)购自Sankyo Labo Service (Tokyo, Japan)和Clea Japan Inc. (Tokyo, Japan): A/J、AKR/J、Balb/cJ、C3H/HeJ、C57BL/6J、C57BL/10J、CBA/J和DBA/2J。在最敏感和最耐药的小鼠品系之间进行了育种研究。产生了以下组合:雄性F1与最敏感品系的雌性杂交产生回交后代;F1杂交产生F2后代。子代在4周龄时断奶,按性别分开并安置在微型隔离笼中,直到它们达到适当的实验年龄(6-8周)。这些老鼠是按照赫尔辛基公约和福岛医科大学指导方针所规定的动物福利法所制定的标准处理的。
研究设计
Inter-strain比较
8个品系6 ~ 8周龄小鼠麻醉i.p。戊巴比妥和手术后暴露的气管。制备的二氧化硅(0.2 g·kg150 mg·mL1如前所述,经气管内灌注生理盐水8。各品系对照动物饲粮为0.2 g·kg1惰性TiO的2(50 mg·毫升1生理盐水)气管内的。气管内灌注二氧化硅28天后,用Ashcroft评估病理纤维化指标et al。10,并评估每个肺的羟脯氨酸含量。
连锁分析
将杂交(F2)小鼠(6-8周龄)麻醉,并如上所述暴露于二氧化硅中。作为对照,3只最敏感品系小鼠在每次实验中给予0.02 mL气管内盐水。灌注二氧化硅28天后,检测每只小鼠右肺的胶原沉积,提取肾脏的DNA。
肺切片形态学评价
右肺固定,石蜡包埋,水平切片,以4 μm包括大部分实质,苏木精-伊红染色。切片由盲观察人员扫描,在100倍放大下确定每个样品30个野区的纤维化程度,并根据Ashcroft的方法进行半定量分析等。10。样品的值以纤维化指数表示,即每个田的平均纤维化等级。
DNA提取和基因分型
从每个表型动物的肾脏中提取DNA,并准备进行PCR。PCR反应在96孔板中进行,总体积为15.0 μL,其中:1 μL DNA (4 ng);1.5 μL 10×反应缓冲液;1.5 μL 25mm MgCl2;1.5 μL 2.5 mM脱氧核苷酸三磷酸(脱氧-腺苷、-胞苷、-鸟苷和-胸苷三磷酸的等量混合物);0.3 μL 10 mM引物(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA);0.6 U Taq聚合酶;然后加入蒸馏水。从网站上选择了C57BL/6J和CBA/J祖细胞之间的简单序列长度多态性(SSLPs)引物12。
PCR扩增包括10个循环(94°C for 15s, 55°C for 15s, 72°C for 30s),然后94°C变性步骤12 min,然后20个循环(89°C for 15s, 55°C for 15s, 72°C for 30s),最后72°C延伸步骤10 min。聚合PCR产物与310基因分析仪标准溶液(Gene Scan 400HD ROX 0.5μL,去离子甲酰胺12μL)混合,95℃变性2 min。这个样品在冰上迅速冷却,直到装载到机器上。处理后的PCR产物用ABI PRISM 310遗传分析仪和基因扫描程序(应用生物系统公司)进行分析。
菌株间比较的统计分析
暴露的影响(二氧化硅与TiO2)和肺反应应变的评估采用双因素方差分析13。Tukey's test被用于后验均值比较。在后验比较二氧化硅暴露小鼠C57BL/6J、CBA/J和B6CBAF1/J的羟脯氨酸含量,由于各组小鼠数量不同,采用Dunnett’s t3检验13。采用非参数斯皮尔曼秩相关法比较了二氧化硅对肺反应的应变分布模式(SDPs)与二氧化硅的SDPs。p<0.05时接受显著性。
连锁分析
对117只F2小鼠中的25只表型高应答小鼠(n = 13)和无应答小鼠(n = 12)进行基因分型,完成整个基因组的扫描13。对每个SSLP标记和SSLP之间的10厘摩根间隔执行间隔分析。通过使用自由、加性、隐性和显性回归模型进行区间分析,评估每个假定QTL的优势属性。计算各关联的回归和显著性,似然比卡方统计量。通过将整个F2队列包括在选择性基因分型鉴定的染色体中,进一步分析假定的qtl。使用Map Manager QTX对表型和基因型数据进行置换试验,以经验方法建立所有QTL作图结果的显著性阈值14并遵循丘吉尔和多吉的方法15。对于基因组扫描,进行了10,000个排列,以建立显著的提示连锁阈值。这些值与Lander和Kruglyak提出的全基因组概率相对应16。
结果
以肺羟脯氨酸含量和病理纤维化指标作为肺纤维化的指标。两项指标的方差分析均显示,与TiO相比,应变(p<0.001和p<0.0025)和暴露(p<0.0005, p<0.0005)对二氧化硅暴露组羟脯氨酸平均比值(p<0.0005)和病理纤维化指数(p<0.0005)的交互作用具有显著影响2暴露的老鼠。
二氧化硅暴露小鼠8个品系羟脯氨酸含量的品系分布规律如图1所示⇓。8个品系小鼠中,C57BL/6J的羟脯氨酸含量最高,CBA/J最低。多重比较的Tukey's试验显示显着的纤维反应间的差异。C57BL/6J与Balb/cJ、C57BL/6J与CBA/J菌株间差异显著(p<0.05)。除CBA/J小鼠外,其他二氧化硅暴露菌株的羟脯氨酸含量均显著高于CBA/J小鼠(p<0.05)。
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/28/5/1013/F1.medium.gif)
8只小鼠气管内灌注二氧化硅28天后肺羟脯氨酸含量的比值。数据以平均值+表示se。#: n = 8;¶: n = 12;+: n = 16;§:与Balb/cJ有显著差异;ƒ:与CBA明显不同;*: p < 0.05与控制。
8株二氧化硅暴露小鼠病理纤维化指标的应变分布规律如图2所示⇓。8株小鼠病理纤维化指数以A/J最高,CBA/J最低。多重比较的Tukey's试验显示显着的纤维反应间的差异。A/J、AKR/J和CBA/J菌株间差异显著(p<0.05)。除CBA/J小鼠外,其他硅暴露菌株的病理纤维化指数均显著高于CBA/J小鼠(p<0.05)。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/28/5/1013/F2.medium.gif)
8株小鼠气管内注射二氧化硅28天后的纤维化指数。值为平均值+se。#:n= 12;¶: n = 8;+: n = 16;§:与AKR显著不同;ƒ:与Balb/cJ有显著差异;# #:与CBA明显不同。*:与自己的对照组相比,纤维化显著增加p<0.05。
由于选择任何表型进行连锁分析,研究必须具有高度的可重复性和定量17,选择羟脯氨酸作为肺纤维化的标志物。从对羟脯氨酸的研究结果来看,C57BL/6J为敏感株,CBA/J为耐药株。为了了解二氧化硅暴露易感性的遗传模式,从易感C57BL/6J和耐药CBA/J小鼠杂交衍生的F1小鼠对二氧化硅暴露的反应进行了表型分析。与TiO相比2-暴露对照动物,F1小鼠对二氧化硅暴露的反应范围介于C57BL/6J和CBA/J祖鼠之间(图3)⇓)。F1小鼠与C57BL/6J、CBA/J小鼠的平均反应差异有统计学意义(p<0.05)。
![图3 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/28/5/1013/F3.medium.gif)
a) CBA/J小鼠(n = 10)和b) C57BL/6J小鼠(n = 23)及其子代每肺羟脯氨酸含量的频率分布(%对照)。雄性CBA/J小鼠与雌性C57BL/6小鼠杂交,得到c) B6CBAF1杂种(n = 48)。雄性B6CBAF1小鼠与雌性C57BL/6J小鼠杂交,得到d) B6BX小鼠(n = 74)。然后将B6BX小鼠杂交产生e) B6CBAF2 (n = 119)。
一项全基因组连锁分析被启动,以确定QTL的染色体位置,这控制了对气管内二氧化硅暴露的敏感性。为了使实验误差最小化18在连锁分析研究中,使用生理盐水作为二氧化硅灌注的对照。分析的第一步是选择25个表型极端的F2应答者(50个减数分裂),在167个SSLP标记上进行基因分型,以95%的置信度提供对小鼠基因组的完全覆盖12,14。利用自由回归模型进行区间分析,在染色体3 (D3mit57.1)、4 (D4Mit9.1)、5 (D5Mit309.1、D5Mit277.1)、6 (D6Mit274.1)、10 (D10Mit230.1)、11 (D11Mit289.1)、14 (D14Mit98.1)和18 (D18Mit177.1;图4⇓)。
通过对25 F2队列(50减数分裂)的选择性基因分型,对数量性状位点(QTL)进行全基因组搜索,即。对气管内二氧化硅灌注反应最高和最低的患者。A) -f):染色体1-19;t):染色体x。cM:厘米器官;····:0;——:提示联动阈值;- - -:联动重要阈值。通过基因组扫描确定的3,4,6,10,11,14和18染色体上的假定QTL被整个F2队列进一步分析。
通过F2队列(n = 117只动物,234次减数分裂)对每个假定的QTL进行进一步分析。只有4号染色体QTL通过排列试验显示了统计学上显著的连锁(图5)⇓)。该QTL解释的总性状方差(在D4Mit9.1)为9%。在分析其余F2动物后,第3和第18染色体上的QTL超过了提示连锁的阈值。这些QTL所解释的总性状方差为D3Mit319和D18Mit177.1,分别为~ 7%和6%。由于C57BL/6J和CBA/J之间没有商业sslp,因此没有进行进一步的间隔分析。
![图5 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/28/5/1013/F5.medium.gif)
二氧化硅灌注,肺羟脯氨酸含量(对照%)表型与染色体上多态简单序列长度多态性标记a) 3, b) 4和c) 18相关的卡方似然比。通过简单线性回归进行内部映射,——:提示连锁阈值;- - -:联动重要阈值。
讨论
暴露于二氧化硅颗粒和矽肺之间的明确病理联系自古以来就已得到澄清。流行病学研究还表明,接触二氧化硅的时间和数量以及游离晶二氧化硅的含量是矽肺进展的最关键决定因素2。然而,即使在相同的环境中,矽肺的发展也存在个体间的差异。例如,在日本人群中已经报道了特定HLA单倍型与矽肺的相关性3.。然而,所有个体间的差异不能完全归因于主要的组织相容性复合体(MHC)。因此,在矽肺小鼠模型中,必须检查包括MHC在内的遗传因素。因此,目前的作者假设遗传背景对小鼠吸入二氧化硅引起的炎症和肺纤维化的变化有显著影响。
首先,为了解决这个问题,研究了近交系小鼠对二氧化硅暴露的相对敏感性。近交过程导致了几乎所有位点的遗传同质性,不同自交系小鼠在同一位点上的不同等位基因可能是同质的。一般来说,进化差异较大的菌株比亲缘关系密切的菌株多态性程度更大。因此,这些特征使得研究表型生理和/或毒理学反应的遗传基础成为可能。也就是说,如果在筛选一些近交系以提供足够的物种变异后,在所选择的表型中发现了差异,那么可以得出结论,一个或多个位点有助于在菌株之间观察到遗传差异17。本研究评估了8种小鼠暴露于气管内二氧化硅灌注后的纤维化反应,这些小鼠是根据它们不同的谱系和遗传研究中的常用方法选择的。对二氧化硅暴露的纤维化反应的显著株间变异(遗传)支持了近亲繁殖小鼠对二氧化硅暴露的易感性具有显著遗传成分的假设。
其次,为了确定二氧化硅暴露易感性是显性性状还是隐性性状,测定了二氧化硅暴露B6CBAF1/J小鼠的羟脯氨酸含量。虽然B6CBAF1/J小鼠的羟脯氨酸含量与硅暴露的C57BL/6J和CBA/J小鼠不同,但F1表型表现出显性性状的完全表型,该模型的遗传模式似乎比较复杂。遗传模式的进一步特征将需要在分离的回交和交叉群体中进行正式的分离分析,这些群体来自于先前由Kleeberger进行的C57BL/6J和CBA/J小鼠et al。18。
第三,为了进一步探索矽肺易感性的遗传基础,对CBA/J和C57BL/6J品系产生的大F2小鼠群体进行了QTL分析。在这项研究中,在染色体4上发现了一个显著的矽肺易感性QTL,在染色体3和18上也发现了两个有启发性的QTL。
有几项研究使用小鼠近交系来鉴定肺纤维化的易感基因。哈斯顿和同事19,20.在辐射诱导的肺纤维化模型中鉴定了两个遗传位点,17号染色体(MHC)和11号染色体。这些QTL与臭氧和特定物质敏感性的QTL几乎重叠19,21,领着哈斯顿et al。22提出在小鼠肺纤维化模型中常见的遗传影响。
在目前的研究中,在4号染色体上发现了一个显著的QTL,其峰值似然比出现在微卫星标记处D4Mit9.1(位于着丝粒远端44.5 cM处)以及在染色体3和18中鉴定出的两个qtl。在博莱霉素和辐射诱导的肺纤维化小鼠模型中,这些QTL与其他QTL不同。目前的结果表明,不同的机制可能在肺纤维化的病理生理机制中发挥作用。与博莱霉素和辐射不同,二氧化硅结晶是一种无机粉尘,可引起肺内肉芽肿反应。这一因素可能引起不同的肺病理生理机制,并产生不同的结果。
在4号染色体QTL中有几个候选基因,包括致癌基因小君,胰岛素样生长因子结合蛋白样1 (Igfbp-1),磷脂酶A2激活蛋白也和周期蛋白依赖性激酶cdkn2a。致癌基因小君对p21有转录调节作用,并参与细胞有丝分裂反应和生长23。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)和胰岛素生长因子(IGFs)被认为是肺纤维化的致病因子。一些IGFBPs作为IGF的调节因子,也在特发性肺纤维化组织中被检测到24。尽管Igfbp-1根据目前的数据尚未澄清,它可能是几个重要的候选基因之一。其他候选基因,如也和cdkn2,也是转录因子,在细胞周期机制中发挥重要作用。18号染色体QTL周围的候选基因包括成纤维细胞生长因子-1 (fgf-1发芽的同源物4 (Spry4;果蝇)和肺腺瘤易感性-9 (pas9)。的功能fgf-1是否与肝纤维化过程有关25。Spry4是一种细胞内成纤维细胞生长因子受体拮抗剂,在强力霉素诱导系统控制下表达于胎儿肺上皮细胞。这些因素在矽肺中均有提示,其在矽肺模型中的作用值得进一步研究。
在Ohtsuka之前的研究中等。9表型性状的遗传表明,该矽肺模型是一个多遗传模型,而不是单一遗传模型。在本研究中,三个QTL解释的总性状方差之和为23%。这些结果表明遗传因素对注入二氧化硅的响应有重要贡献。
总之,在气管内灌注二氧化硅的肺反应中存在显著的应变间变化。由此,目前的作者得出结论,对二氧化硅的纤维化反应有显著的遗传影响。此外,F2的全基因组连锁分析分别在第4号染色体和第3号和第18号染色体上发现了矽肺的显著数量性状位点。这是首次证明矽肺易感性的候选位点。几个有趣的候选基因(如。fgf,igfbpl-1)已在相关区域内观察到,这些基因的多态性需要进一步分析。未来的方法将是对8种小鼠的候选基因进行比较测序。对已鉴定的数量性状位点进行细化,将有助于了解宿主对二氧化硅暴露的反应机制,并为鉴定可能面临二氧化硅暴露不良影响风险的遗传易感个体提供一种潜在手段。
- 收到了2005年11月11日。
- 接受2006年6月29日
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