文摘
4抑制磷酸二酯酶(PDE)变弱中性粒细胞炎症慢性阻塞性肺疾病。本研究的目的是审查的疗效和机制PDE4抑制β的块粘连2整合素内皮counterligand。
多形核白细胞(中性粒细胞(中性粒细胞)是独立于人类接受任何药物治疗。附着力被髓过氧物酶活性分析。的影响cilomilast±氟替卡松加沙美特罗在以下决定:1)表面CD11b表达式;2)粘附;3)细胞内的环磷酸腺苷(营)浓度;和4)细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2-mediated集团IVA-phospholipase2(gIVA-PLA2)磷酸化由于白三烯(LT) B4或肿瘤坏死因子(TNF) -α激活。
cilomilast或rolipram±氟替卡松加沙美特罗concentration-related LTB的封锁造成的4counterligand全身的附着力,但没有影响TNF-α-activated中性粒细胞。类似的增加细胞内营浓度与LTB中性粒细胞激活4和TNF-α是由1μM cilomilast和0.1μM氟替卡松加沙美特罗。Upregulation表面CD11b表达和ERK-1/2磷酸化被cilomilast或rolipram±氟替卡松加沙美特罗供LTB中性粒细胞激活4,但不是由TNF-α细胞刺激。gIVA-PLA Cilomilast±氟替卡松加沙美特罗也阻塞2磷酸化LTB造成的4但不是TNF-α。
总之,目前的研究表明,白三烯B4和肿瘤坏死factor-α上调环磷酸腺苷。然而,环磷酸腺苷并不阻止β2整合素粘附肿瘤坏死factor-α所致。这是得出的结论是,肿瘤坏死factor-α防止抑制细胞外signal-regulated kinase-1/2-mediated集团IVA-phospholipase2激活,对β至关重要2整合素在多形核白细胞粘附。
环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)可分为11个家庭PDE酶(PDE1-PDE11),八30多个不同的亚型,产生能够代谢和停用天然的第二信使核苷酸,3′,5′环腺苷酸(cAMP)1- - - - - -3。亚型中,选择性PDE4酶水解阵营和环鸟苷酸的亲和力较低1- - - - - -3。由于明显的PDE同功酶,预期,许多细胞类型表达超过一个PDE,这些酶之间的不同的内容不同的细胞和组织4。最近,四个基因型PDE4已确定(PDE4A-PDE4D);PDE4A, PDE4B在几个炎症细胞和PDE4D尤其丰富,包括中性粒细胞(多形核白细胞(中性粒细胞))5,6,嗜酸性粒细胞5,7、巨噬细胞8,9和单核细胞10,11。然而,PDE4的作用在调节细胞功能尚未完全建立。
豚鼠腹腔嗜酸性粒细胞主要表达膜结合PDE4,而人类嗜酸性粒细胞表达PDE4和PDE7作为细胞内同功酶12。PDE同功酶在人类中性粒细胞不完全的特征;然而,PDE4似乎专门细胞内,PDE4似乎是唯一PDE同工酶表达的活动状态在人类中性粒细胞12。
PDE4的抑制性影响嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的差别在对这些基因的功能,即。细胞粘附颗粒分泌、CD11b表达式和脱落l-selectin,先前已报告5,13。PDE4A内局部粒细胞的胞质颗粒,主要转移到质膜,以应对formyl-Met-Leu-Phe (FMLP)激活;一些PDE4胞吐在激活状态5。在活的有机体内的抑制作用的研究已经证明rolipram内皮轮回的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞14,15。其他研究已经表明,抑制PDE4导致hyperreactive气道平滑肌的松弛和中介由炎症细胞释放的封锁15,16。
目前作者最近证明rolipram, PDE4抑制剂,块的合成半胱氨酰白三烯(LT) C4由FMLP∼50%,嗜酸性粒细胞激活17。与氟替卡松加沙美特罗Co-incubation协同抑制这种反应引起的17。现在的作者也表明,βrolipram块2-integrin-mediated人类嗜酸性粒细胞粘附eotaxin所引起的,但不是interleukin-5-mediated粘连在体外18。除了添加剂的封锁造成的氟替卡松加沙美特罗粘连由eotaxin, G-protein-activating趋化因子,嗜酸性粒细胞18。其他调查也表明,抑制PDE4减弱小鼠气道高反应性和气道炎症敏感19,20.。几项研究已经证明了衰减的气道炎症和气道反应性氟替卡松加沙美特罗与糖皮质激素的相互作用和steroid-sparing茶碱的影响21,22;然而,对βPDE4的作用机制2-integrin-mediated在人类中性粒细胞粘附。
在最近的研究中,比较PDE4的抑制作用抑制了单独使用cilomilastβcilomilast结合氟替卡松加沙美特罗2-integrin-mediated粘连引起的肿瘤坏死因子(TNF) -α或LTB4在人类中性粒细胞在体外。
方法
隔离的嗜酸性粒细胞,中性粒细胞
嗜酸性粒细胞是孤立的从18岁人类受试者(20-45岁年),如前所述23。从所有的志愿者通知书面同意了。所有的受试者收到任何药物治疗≥4周之前的研究。
嗜酸性粒细胞被孤立immunomagnetic消耗使用人类的中性粒细胞嗜酸性粒细胞浓缩设备(公元前干细胞技术,温哥华,加拿大)。纯度≥98%,作为评估Wright-Giemsa染色。
中性粒细胞被聚蔗糖沉降分离,并通过淋巴细胞离心分离介质(密度1.077±0.002 g·毫升1;美国阿灵顿高地,Amersham IL)。细胞颗粒含有中性粒细胞在汉克的resuspended平衡盐溶液(hbs)缓冲+ Ca2 +/ 0.2%牛血清白蛋白(BSA)和> 99%可行,评估通过台盼蓝染料排斥。
β2-Integrin-dependent中性粒细胞的粘附ICAM-1和BSA-coated微型板块井
测量中性粒细胞粘附:验证BSA的代理
微型板块井被涂上一层50μL可溶性细胞间粘附分子1 (ICAM)或BSA溶解在涂层缓冲区和孵化一夜之间在4°C和缓冲区使用前清洗24。粘附是评估剩余髓过氧化酶(MPO)贴壁细胞的活性。中性粒细胞(4×104/ 100μL哈佛商学院/ 0.1%明胶)添加到涂层微型板块井和允许定居在冰上10分钟。与10细胞被激活6米FMLP 37°C。15分钟后,井与哈佛商学院轻轻洗板机,100μL哈佛商学院/ 0.1%明胶添加到井中。MPO衬底(100μL;0.01% H2O20.167 mg·毫升1O-dianizidine盐酸盐,0.5%溴化hexadecyltrimethylammonium在50 mM磷酸钾缓冲,pH值5.5)被添加到每个。30分钟后,终止反应是通过添加50μL 2 M H2所以4。一个标准曲线为每个使用串行稀释测定生成的原始细胞悬液。吸光度测量在405 nm (Thermomax;美国分子设备,门洛帕克,CA)。没有发现MPO活性反应浮在表面的游离(ICAM-1或BSA),确认MPO并不存在,因为自发的中性粒细胞脱粒。先前的调查建立的时间和浓度FMLP用于这项研究是激活粒细胞粘附的最优选择24。
时间进程和量效曲线的影响cilomilast和/或氟替卡松加沙美特罗β2-integrin-mediated粘连引起的107M LTB4或30 ng·毫升1为后续研究TNF-α生成(见下文)。这些浓度的LTB4和TNF-α那些近似最大β2整合素粘附(见结果)。
封锁刺激β2-integrin-mediated附着力
鼠标屏蔽效果的单克隆抗体(mab)针对α-CD11aα-CD11b,α-CD18,α-CD49d调节β2-integrin-mediated粘连造成FMLP激活了。BSA作为ICAM-1替代蛋白质用于所有后续实验因为类似的模式的附着力和粘附的封锁已经在这项研究进行验证。
PDE4活性测定
PDE4活性在静止的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞被修改的方法分析了汤普森和阿普曼25和赖特等。26。细胞(2×106细胞)治疗与缓冲单独或106M cilomilast独自(30分钟)。enzyme-containing分数分别在200年的最后一卷μL包含0.5μM营(28000 cpm (3H]营)和孵化为30分钟37°C。反应混合物被添加50μL终止0.2盐酸。进一步水解5′- (3H] AMP (3H]腺苷,被添加方便Crotalus atrox蛇毒。交联葡聚糖的洗出液25列添加到闪烁的鸡尾酒,和放射性计数用贝克曼液体闪烁计数器。PDE4活性表达为femtomoles每分钟每百万细胞(fmol·分钟1·106细胞1)。
流cytometicβ细胞表面表达的分析2整合素粘附
中性粒细胞是pre-incubated 10-10年-10年6M cilomilast(30分钟)和/或107M氟替卡松加沙美特罗(5分钟)激活前107M LTB4(15分钟)或30 ng·毫升1TNF-α(30分钟),另外300μL冷fluorescence-activated细胞分选仪(流式细胞仪)缓冲区(PBS南BSA为1%和0.1%3解决方案)。细胞颗粒与流式细胞仪缓冲区之前洗一次孵化4μL CD11b马伯(美国马单子叶植物,沃本),或isotype-matched控制抗体在4°C (Ab) 60分钟。与流式细胞仪缓冲洗两次后,细胞被孵化与过度的fluorescein-5-isothiocyanate-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(Ig) 30分钟在4°C。此后,300μL 1%多聚甲醛是添加到细胞颗粒保持在4°C,直到分析。流式细胞术是由FACScan(美国BD生物科学,山景,CA)和平均荧光强度是决定从每个样本≥5000个细胞。
PDE4 -和β的影响2肾上腺素能受体抑制中性粒细胞粘附ICAM-1代理蛋白质
排除可能的脱靶行动cilomilast,中性粒细胞pre-incubated与10-10年米到106M cilomilast或rolipram 30分钟和/或107M氟替卡松加沙美特罗与10 5分钟前激活7M LTB4,30 ng·毫升1TNF-α或缓冲控制在37°C。附着力试验进行。
测定细胞内营的浓度
营地被electroimmunoassay试验(试验设计,安阿伯市,美国)。中性粒细胞(2.5×105每干预细胞)是pre-incubated 10-10年-10年6M cilomilast和/或107氟替卡松加沙美特罗激活前107M LTB4,30 ng·毫升1TNF-α或缓冲控制在37°C。每个细胞颗粒治疗0.1 M盐酸细胞溶菌作用,和200年μL para-nitrophenyl磷酸盐添加底物。营地的浓度是阅读在405 nm和标表示为皮摩尔/ 2.5×105细胞(pmol·2.5×105细胞1)。
免疫印迹分析:gIVA-PLA ERK-1/2的磷酸化2和Raf-1
中性粒细胞与要么pre-incubated 10-10年-10年6M cilomilast rolipram和/或107氟替卡松加沙美特罗激活前107M LTB4,30 ng·毫升1TNF-α,或缓冲控制在37°C,细胞和颗粒细胞溶解于70年μL中断的缓冲区。上层清液(65μL)是与14混合μL×6样品缓冲和煮5分钟。样品受到钠十二烷基sulphate-polyacrylamide使用10%的丙烯酰胺凝胶电泳凝胶减少条件下和electrotransfer的蛋白质是使用半干系统实现。膜阻止了1% BSA在Tris-buffered盐水+ 0.1% Tween-20 (TBS-T)缓冲60分钟前添加2μg·毫升1anti-phosphorylated细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2 Ab(美国WI Promega,麦迪逊)或2μg·毫升1anti-phosphorylated集团IVA-phospholipase2(gIVA-PLA2)Ab (Ser505;细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)或2μg·毫升1anti-phospho-Raf Ab (Ser259;细胞信号技术)。与TBS-T洗涤后,膜被孵化1:3,000稀释的山羊anti-rabbit Ig共轭和辣根过氧化物酶(Amersham)由一个增强化学发光分析系统。
统计分析
数据表示为±扫描电镜在每一个组。学生的学习任务是用于比较两个配对组。在多个比较,差异量效曲线为同一个受体激动剂或抑制剂Bonferroni调整后进行比较。超过两个团体间的变异测试使用方差分析以及Fisher防护水平低的差异测试。一个假定值< 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
相等的绑定ICAM-1和BSA的代理
中性粒细胞绑定ICAM-1——或者BSA-coated微型板块井
证实该方法的等效性测量的中性粒细胞粘附ICAM-1,中性粒细胞的粘附BSA的替代蛋白Ig表生的比较。中性粒细胞的数量坚持ICAM-1——或者BSA-coated井相当,化验的测量残余MPO和FMLP激活后(图1所示⇓)。与anti-CD11b Pre-incubation的中性粒细胞(Mac-1α-chain,出现在中性粒细胞)或anti-CD18(常见的β2链)专门和粘附BSA和ICAM-1同样阻塞。无论是马伯针对CD11a(白细胞的α-chain关联antigen-1)和CD49d(α-chain antigen-4很晚,不存在中性粒细胞)阻塞粘附FMLP所致。这些数据表明,结扎的BSA的模式类似于ICAM-1,因此适用于测量β2整合素粘附。因此,所有后续实验,BSA是用作ICAM-1代孕蛋白质24,27,28。
单克隆抗体的影响(mAb)针对β1/β2整合蛋白在formyl-Met-Leu-Phe (FMLP)刺激中性粒细胞粘附牛血清白蛋白(BSA)——(▒)或细胞间粘附分子(ICAM) 1-coated(□)微型板块井。Polymorphonucleates与最优浓度pre-incubated马伯对β1——或β2整合蛋白或同形像控制和激活106M FMLP BSA -或者ICAM-1-coated井15分钟。中性粒细胞粘附一样残髓过氧化物酶活性测定的方法部分中描述。每个点代表均值±扫描电镜。
PDE4活动:中性粒细胞与嗜酸性粒细胞
作为参考,PDE4活动在新鲜分离中性粒细胞和嗜酸性粒细胞是测量。发现PDE4活性在静止中性粒细胞∼10倍大于PDE4活动在人类嗜酸性粒细胞(图。2⇓)。PDE4活性在中性粒细胞是192±96.3 fmol·分钟1·106细胞1与16.2±10.0 fmol·分钟1·106细胞1嗜酸性粒细胞(p < 0.001)。然而,106M cilomilast,最集中在后续的研究中,使用完全抑制中性粒细胞和嗜酸性粒细胞PDE4活性。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/28/5/920/F2.medium.gif)
定量的磷酸二酯酶(PDE) 4活动。孤立的人多形核白细胞(中性粒细胞;▒)或嗜酸性粒细胞(EOS;□)处理缓冲区单独或与106M cilomilast (CLM)和PDE4活性测定的方法部分中描述。PDE4活性表达为fmol·分钟1·106细胞1和数据显示为±扫描电镜三个独立的实验。* * *:p<0.001如果中性粒细胞与黎明的女神。
LTB的动力学和浓度效应4和TNF-αβ2-integrin-mediated附着力
动力学的中性粒细胞粘附BSA-coated微型板块井以应对LTB4然后TNF-α激活被确定。粘连引起的LTB4(图3⇓)和TNF-α(图3 b⇓)增加浓度的方式。最大粘附的细胞激活发生在15分钟107M LTB4在≥25分钟激活后30 ng·毫升1TNF-α(图3 c⇓)。LTB这些时间和浓度4和TNF-α用于所有后续实验。
动力学和白三烯的浓度效应(LT) B4和肿瘤坏死因子(TNF) -α附着力。多形核白细胞(中性粒细胞)活性随着浓度的LTB415分钟(* *:p < 0.01 > 109M LTB4与控制)或b) TNF-α附着力试验(前30分钟* *:p < 0.01 > 10 ng·毫升1TNF-α与控制)。c)时间进程为TNF-α——或者LTB附着力4激活中性粒细胞。未经处理的中性粒细胞被添加到牛血清albumin-coated井和激活LTB的最佳浓度4(▪;107米)或TNF-α(♦;30 ng·毫升1)在不同时期。附着力测量的函数残髓过氧物酶的活动。数据表示为±扫描电镜六个独立的实验。
LTB效果4和TNF-αCD11b表面表达:封锁cilomilast和/或氟替卡松加沙美特罗
LTB的影响4(图4⇓)和TNF-α(图4 b⇓)表面上表达CD11b人类中性粒细胞进一步检查。刺激与LTB4增加了表面CD11b表达式116±18特定的荧光强度(SFI);p < 0.05与如果细胞)和91.8±29 SFI细胞激活TNF-α(p < 0.05)与如果细胞)。预处理的中性粒细胞107M cilomilast减毒CD11b表达式29.4±12 SFI (p < 0.05与LTB4进一步激活细胞)和11.7±21 SFI细胞预处理与106M cilomilast (p < 0.01)与LTB4激活细胞)。相比之下,cilomilast没有造成明显影响调节CD11b表达式TNF-α刺激在任何浓度(图4 b⇓)。不管是单纯的氟替卡松加沙美特罗还是cilomilast和氟替卡松加沙美特罗有添加剂的抑制作用在中性粒细胞刺激CD11b表达式。
cilomilast效果(CLM)和/或氟替卡松加沙美特罗(SALM)表面CD11b的表情。多形核白细胞(中性粒细胞)pre-incubated与108-10年6M CLM (░), 107M SALM独自,或CLM + 107M SALM(▒)激活的)前107M白三烯(LT) B415分钟或b) 30 ng·毫升1肿瘤坏死因子(TNF) -α30分钟在37°C。表面CD11b表达式分析了通过流式细胞术和数据表示为特定的荧光强度(SFI);平均荧光强度-如果控制)。LTB *: p < 0.054激活中性粒细胞(没有CLM,没有SALM)与107M CLM + LTB4有或没有SALM;* *:p < 0.01十6M CLM + LTB4有或没有SALM。p =ns对于TNF-α-activated中性粒细胞与所有的治疗和浓度。
粘附的封锁LTB所致4或TNF-α
随后,LTB的效果4和TNF-αβ2-integrin-mediated粘附BSA-coated微型板块井前后接触cilomilast和/或氟替卡松加沙美特罗被检查。粘连引起的LTB4激活为29.4±5.3%,下降到16.2±2.8%的细胞治疗108M cilomilast(图5⇓;p < 0.05), 10后15.0±4.27%7M cilomilast (p < 0.05)与LTB4激活细胞),10后11.3±2.2%6M cilomilast (p < 0.01)与LTB4激活细胞)。氟替卡松加沙美特罗没有造成β的封锁2-integrin-mediated附着力。添加cilomilast没有造成增加氟替卡松加沙美特罗(与独自cilomilast)β的封锁2-integrin-mediated粘附LTB所致4在任何浓度(图5⇓)。
影响磷酸二酯酶(PDE) 4抑制剂(cilomilast (CLM)或rolipram)和/或氟替卡松加沙美特罗(SALM)刺激附着力。多形核白细胞(中性粒细胞)pre-incubated) CLM和/或SALM或b) rolipram和/或SALM激活前107M白三烯(LT) B4(a和b) 15分钟或30 ng·毫升1肿瘤坏死因子(TNF) -α(c和d) 30分钟在37°c。附着力测量的函数残髓过氧物酶的活动。数据表示为±扫描电镜六个独立的实验。•:LTB4;○:SALM;▴:控制;♦:CLM孤独;▪:CLM + 107M SALM;▾:TNF-α;⋄:rolipram孤独;□:rolipram + 107M SALM。*:p < 0.05;* *:p < 0.01与LTB4激活中性粒细胞(没有CLM,没有SALM)。p=nsTNF-α-activated中性粒细胞(没有CLM,没有SALM)与CLM或CLM + SALM浓度。
造成最大附着力TNF-α几乎比得上LTB引起的4(20.5±1.5%)。LTB相比4然而,预处理与cilomilast单独或氟替卡松加沙美特罗+ cilomilast没有抑制作用在中性粒细胞粘附ICAM-1代理为中性粒细胞激活蛋白TNF-α(图5 b⇑)。
相同的实验重复与不同的中性粒细胞治疗rolipram单独或rolipram +氟替卡松加沙美特罗。结果与同cilomilast或cilomilast +氟替卡松加沙美特罗(图5度⇑和d)。
cilomilast效果和氟替卡松加沙美特罗刺激细胞内营的浓度
评估潜在PDE4 /β之间的关系2肾上腺素受体抑制粘附刺激,刺激细胞的浓度的营地进行分析存在cilomilast孤独,独自氟替卡松加沙美特罗,cilomilast +氟替卡松加沙美特罗。基线细胞内营浓度(之前cilomilast±氟替卡松加沙美特罗)对所有治疗组是无关紧要的。细胞内营是0.19±0.04 pmol·2.5×105细胞1为缓冲,仅0.29±。04 pmol·2.5×105细胞1治疗后与LTB4单独和0.14±。01 pmol·2.5×105细胞1对中性粒细胞激活TNF-α(p =ns所有的比较)。添加cilomilast增加细胞内营浓度的方式(图6所示⇓)。10点8M cilomilast营地浓度为0.38±0.08 pmol·2.5×105细胞1;经过107M cilomilast是0.78±0.10 pmol·2.5×105细胞1(p < 0.05与缓冲控制);和中性粒细胞治疗106M cilomilast是1.69±0.24 pmol·2.5×105细胞1(p < 0.01与缓冲控制)。相比之下,暴露在107M氟替卡松加沙美特罗独自一人没有造成增加细胞内营(p =ns)。
cilomilast效果(CLM)和/或在胞内环腺苷酸氟替卡松加沙美特罗(SALM)(营)浓度。多形核白细胞(中性粒细胞)pre-incubated与10-10年-10年6M CLM(♦)或CLM + 107与10 M SALM之前激活7M白三烯(LT) B415分钟或30 ng·毫升1肿瘤坏死因子(TNF) -α30分钟在37°C和测量细胞内营的浓度。□:CLM + SALM + LTB4;▵:CLM + SALM + TNF-α;▪:CLM + LTB4;▴:CLM + TNF-α;⋄:CLM + SALM;•:SALM孤单。* *:p < 0.01十6M CLM + LTB4激活中性粒细胞与106M CLM-alone-treated中性粒细胞;#:中性粒细胞接受10 p < 0.016M CLM + 107M SALM + LTB4与106M CLM + LTB4,没有SALM;¶:p<0.01中性粒细胞治疗106M CLM + 107M SALM + TNF-α与106M CLM + TNF-α,没有SALM。数据(n = 4)表示为±扫描电镜在pmol·2.5×105细胞1。
氟替卡松加沙美特罗的Co-incubation 10-10年-10年6M cilomilast添加剂增加细胞内营浓度引起的。预处理≥108M cilomilast单独或cilomilast +氟替卡松加沙美特罗营地浓度的增加增强中性粒细胞随后LTB处理4或TNF-α。对中性粒细胞治疗106M cilomilast + LTB4,营地增加了1.6倍,2.8±0.73 pmol·2.5×105细胞1(p < 0.01与106M cilomilast孤独;图6⇑)。Pre-incubation氟替卡松加沙美特罗+ 10的中性粒细胞6M cilomilast + LTB4进一步增强细胞内营浓度4.5±1.3 pmol·2.5×105细胞1从10∼,增长了1.6倍6M cilomilast + LTB4没有氟替卡松加沙美特罗(p < 0.01)。
活化的中性粒细胞cilomilast + TNF-α引起可比阵营浓度相比,中性粒细胞增加cilomilast +氟替卡松加沙美特罗或cilomilast + LTB对待4(p =ns)。氟替卡松加沙美特罗+ cilomilast + TNF-α营水平增加从2.1±0.36 pmol·2.5×105细胞1对中性粒细胞治疗106M cilomilast + TNF-α没有氟替卡松加沙美特罗3.8±0.40 pmol·2.5×105细胞1(p < 0.01)。
激活ERK-1/2 gIVA-PLA2由LTB4和TNF-α:cilomilast效果和/或氟替卡松加沙美特罗
下一步是确定LTB是否4介导粘附的β2整合素在中性粒细胞介导通过ERK-1/2 gIVA-PLA2通路。LTB激活的细胞4激活ERK-1和gIVA-PLA造成的2磷酸化,被106M cilomilast,通过免疫印迹分析评估(无花果7⇓和8⇓)。Co-incubation中性粒细胞与氟替卡松加沙美特罗单独或结合cilomilast没有造成进一步抑制ERK-1和gIVA-PLA2磷酸化LTB造成的4。ERK-2是既定的磷酸化,即使在静止状态(图7所示⇓)。磷酸化的重要upregulation ERK-2激活后要么LTB还没有建立起来4或TNF-α。相同的模式ERK-1/2磷酸化的封锁了cilomilast或rolipram单独或结合氟替卡松加沙美特罗(图7所示⇓)。
磷酸二酯酶4抑制剂的抑制作用(cilomilast (CLM)或rolipram)和/或氟替卡松加沙美特罗(SALM)细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2磷酸化(磷酸盐)。一位代表ERK-1/2磷酸盐引起的白三烯(LT) B4或肿瘤坏死因子(TNF) -α-stimulated多形核白细胞(中性粒细胞)10的存在与否6M cilomilast (a)或rolipram (b)和/或107M SALM。中性粒细胞治疗细胞溶解和受到10%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳,其次是使用特定ERK-1/2 anti-phosphorylation抗体免疫印迹分析。证实了平等的示例加载使用总anti-ERK-1/2抗体。
影响cilomilast (CLM)和/或在集团IVA-phospholipase氟替卡松加沙美特罗(SALM)2(gIVA-PLA2)和Raf-1磷酸化(磷酸盐)。一位代表gIVA-PLA2磷酸化和b)造成Raf-1磷酸化白三烯(LT) b4或肿瘤坏死因子(TNF) -α-stimulated多形核白细胞(中性粒细胞)10的存在与否6M CLM和/或107M SALM。中性粒细胞治疗细胞溶解和受到10%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳,紧随其后的是免疫印迹分析使用anti-phosphorylation Ser505-specific gIVA-PLA2抗体(Ab) (a)和anti-phosphorylation Ser259 Raf-1 Ab (b)。总anti-gIVA-PLA证实了平等的示例加载使用2Ab。
在额外的实验中,gIVA-PLA TNF-α对ERK-1/2-mediated磷酸化的影响2是检查。像LTB4,TNF-αERK-1的磷酸化和下游gIVA-PLA引起的2;然而,治疗cilomilast单独和/或氟替卡松加沙美特罗并没有有效地阻止ERK-1或gIVA-PLA2磷酸化TNF-α激活所致。因此,中性粒细胞与cilomilast预处理+β2受体激动剂表现出类似和大幅增加LTB治疗后细胞内营4或TNF-α,下游抑制ERK和gIVA-PLA2磷酸化被TNF-α治疗预防。这些数据表明,TNF-α防止基本ERK-mediated通路的封锁必要cAMP-mediated信号转化为β的封锁2整合素粘附。
最后一系列实验测试的假设营激活引起的TNF-α不是阻塞粘连,因为TNF-α同时有效的阻止Raf-1磷酸化(图8 b⇑)。LTB Raf-1在场4——TNF-α-activated中性粒细胞和磷酸化相对与cilomilast两组治疗后。
讨论
当前的研究的目标是确定以下几点:1)营地PDE4抑制降解的封锁是否会引起β的封锁2-integrin-mediated附着力;和2)信号通路参与cAMP-mediated upregulation的整合素在中性粒细胞粘附。
PDE4抑制剂导致concentration-related抑制作用对中性粒细胞粘附与LTB刺激4与细胞因子,但不是TNF-α。整合素抑制粘附LTB所致4没有进一步增强β2肾上腺素能受体刺激(图5所示⇑),尽管增强细胞内营的生产(图6所示⇑)。
本研究的数据表明,中性粒细胞显著表达PDE4的浓度大于嗜酸性粒细胞(图2所示⇑)在相同的人类的捐助者。cilomilast的抑制效果,无论是单独或结合氟替卡松加沙美特罗,β2LTB -integrin-mediated粘连引起的两个受体激动剂4和TNF-α在人类中性粒细胞,也被调查。发现cilomilast,负责具体PDE4抑制剂阻断PDE4活动休息粒细胞(图2所示⇑)和增加细胞内营浓度(图。6⇑);因此抑制ERK-1-mediated gIVA-PLA2磷酸化LTB造成的4活化的中性粒细胞(图8所示⇑)。抑制gIVA-PLA2磷酸化了的表达调节表面CD11b(图4所示⇑)和防止粘连由β2整合素(图5所示⇑)。
目前的数据表明,该屏蔽效应cilomilast±氟替卡松加沙美特罗β2-integrin-mediated粘附的LTB4激活中性粒细胞对应于一个类似细胞表面的封锁CD11b表达式(图。4⇑)和ERK-1-mediated gIVA-PLA2磷酸化(图8所示⇑)。ERK-2,有趣的是,这是既定的表达,没有出现调节中性粒细胞粘附(图7所示⇑)。
中性粒细胞激活TNF-αβ2整合素粘附与LTB4相对增加,细胞内营与cilomilast治疗后,但很少或根本没有抑制ERK-1或gIVA-PLA2磷酸化(无花果7⇑和8⇑)。因此,这些数据表明,TNF-α防止抑制cAMP-mediated ERK-1活化,进一步防止下游gIVA-PLA抑制2磷酸化。当前作者曾表明gIVA-PLA2整合素粘附磷酸化是一个重要的一步29日。因此,TNF-α阻止gIV-PLA抑制的能力2磷酸化赋予独特的电阻的细胞因子阻断β衰减2整合素粘附。
重要的是要考虑一些当前研究的局限性。目前获得的数据,在使用人类细胞,只能获得在体外。β之间的直接交互2受体激动剂和PDE4抑制剂在活的有机体内不能准确地评估。尽管如此,目前的数据显示实质性差异的能力PDE4抑制剂阻止TNF-αLTB4全身的附着力的β2整合素在中性粒细胞。在目前的调查,PDE4抑制剂的影响±氟替卡松加沙美特罗ERK-1/2刺激,而目前的作者曾导致gIVA-PLA磷酸化2在人类嗜酸性粒细胞,检查17。目前的数据明显表明直接抑制ERK-1 PDE4的磷酸化和β之间的关系2整合素粘附供LTB中性粒细胞激活4,但这不是TNF-α。然而,目前的研究并没有探讨所有可能的抑制途径。具体来说,p38增殖作用的潜在作用蛋白激酶没有检查,这个同种型持续表达其磷酸化状态,不调节β2整合素在嗜酸性粒细胞30.。很可能其他抑制通路在调节β也可以活跃2整合素,如。phosphatidylinositide 3-kinase。在先前的研究中,G-protein-mediated粘连已被证明是由ERK-1/2-gIVA-PLA规定2交互18,30.。在目前的研究中,一个明确的关系已被证明ERK-1/2 gIVA-PLA2全身的附着力LTB所致4。封锁这个PDE4磷酸化的抑制也阻止了附着力。显然,有一个限制的数量的组合实验,可以在一个单一的执行研究。然而,目前的数据表明,块整合素粘附的能力是直接刺激依赖和对应ERK-1-mediated gIVA-PLA2磷酸化。应该注意的是,PDE4抑制中性粒细胞粘附的治疗效果和transendothelial迁移不能从目前的预测研究。然而,TNF-α-induced cAMP-mediated造成的粘附机制差别阻力对这些表明,激活的情况下,在很大程度上,决定anti-neutrophilic疗法的疗效。
总之,人们发现肿瘤坏死factor-α防止环腺monophosphate-induced抑制细胞外signal-regulated激酶磷酸化,进一步阻止β的封锁2整合素粘附。相比之下,白三烯B4激活多形核白细胞与可比增长引发的环磷酸腺苷cilomilast演示了两种抑制细胞外signal-regulated激酶1和细胞外signal-regulated kinase-1/2-mediated集团IVA-phospholipase2磷酸化和β的封锁2整合素粘附。细胞外的机制signal-regulated kinase-1/2-mediated集团IVA-phospholipase2导致β2整合素粘附仍是未定义的。因此,而肿瘤坏死factor-α激活细胞已确认为耐火材料环腺monophosphate-initiatedβ的封锁2整合素粘附,这发生的确切机制还不能被定义。这些数据却表明,β的封锁2多形核白细胞极度取决于整合素粘附在激活的模式。
- 收到了2006年2月24日。
- 接受2006年6月13日。
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