摘要gydF4y2Ba
囊性纤维化(CF)患者的气道以中性粒细胞释放大量弹性蛋白酶压倒局部抗蛋白酶屏障为特征。α的吸入gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶(AAT)可恢复蛋白酶-抗蛋白酶平衡,减轻CF气道炎症。本研究的目的是:1)通过两种不同的吸入策略来评估吸入AAT的最佳沉积区域;2)观察吸入AAT 4周对CF患者肺功能、蛋白酶-抗蛋白酶平衡及气道炎症的影响。gydF4y2Ba
在一项前瞻性随机研究中,52名CF患者接受了针对其外周或支气管间室的每日25mg AAT吸入沉积,持续4周。弹性蛋白酶活性、AAT、促炎细胞因子、中性粒细胞、免疫球蛋白G片段水平及免疫球蛋白G数目gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在吸入前后对诱导痰进行评估。gydF4y2Ba
吸入AAT可增加AAT水平,降低弹性蛋白酶活性、中性粒细胞、促炎细胞因子水平和细胞数量gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba.然而,它对肺功能没有影响。外周吸入方式与支气管吸入方式无差异。gydF4y2Ba
总之,虽然未观察到对肺功能的影响,但α后气道炎症明显减轻gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶治疗可能先于肺结构改变。的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶沉积区可能对α起次要作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶吸入治疗囊性纤维化患者。gydF4y2Ba
- αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶gydF4y2Ba
- 囊性纤维化gydF4y2Ba
- 弹性蛋白酶gydF4y2Ba
- interleukin-8gydF4y2Ba
- 中性粒细胞gydF4y2Ba
囊性纤维化(CF)患者死亡的主要原因是由慢性细菌感染和肺的进行性破坏引起的呼吸功能不全gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.由于CF气道上皮细胞的遗传缺陷,CF气道中存在以大量白介素(IL)-8为特征的过度炎症反应。IL-8吸引中性粒细胞到肺,导致慢性气道炎症,中性粒细胞弹性蛋白酶的过度释放压倒了气道的抗蛋白酶屏障gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
中性粒细胞弹性蛋白酶是一种具有广泛底物特异性的丝氨酸蛋白酶,与组织蛋白酶G和蛋白酶3一起作为全活性酶储存在中性粒细胞的嗜蓝性颗粒中gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.除了侵入作为弹性蛋白酶生理目标的微生物外,过量的酶还会破坏宿主化合物和肺结构,包括纤毛gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,弹性蛋白gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,纤连蛋白gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,表面活性剂蛋白A和DgydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,免疫球蛋白gydF4y2Ba9gydF4y2Ba以及中性粒细胞上的细胞表面受体gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba和淋巴细胞gydF4y2Ba12gydF4y2Ba.这种损伤导致粘液纤毛清除减少gydF4y2Ba4gydF4y2Ba以及调理吞噬功能受损gydF4y2Ba11gydF4y2Ba.此外,弹性蛋白酶刺激IL-8等促炎细胞因子的产生gydF4y2Ba13gydF4y2Ba白三烯(LT)BgydF4y2Ba4gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
在健康的肺里αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶(AAT)存在于高浓度和作为抗蛋白酶筛选,以防止自由弹性蛋白酶的有害影响gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.在CF气道,AAT是复杂的gydF4y2Ba16gydF4y2Ba蛋白质水解失活gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,导致蛋白酶与抗蛋白酶之间的不平衡。为了减轻游离弹性蛋白酶对肺结构和宿主防御机制的有害影响,吸入AAT已被提出作为CF患者的治疗策略gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
对于吸入AAT的有效治疗,至关重要的是尽可能高的雾化药物到达肺部的目标区域,并且在对受试者方便的时间内进行吸入。本研究的第一个目的是比较外周和支气管AAT沉积模式。第二个目的是检查吸入4周AAT是否对蛋白酶-抗蛋白酶平衡、中性粒细胞百分比、促炎细胞因子mRNA和蛋白水平、促炎细胞因子的数量有影响gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba以及CF患者痰液中免疫球蛋白(Ig)G片段百分比gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
本研究是一项多中心、随机、开放标签、平行组试验,在以下8个研究中心进行:德国慕尼黑大学(协调研究员M. Griese);德国法兰克福圣伊丽莎白医院内科(J. Bargon);内科(C. von Mallinckrodt)和儿科(H-G。Posselt),法兰克福大学,法兰克福;德国汉诺威汉诺威大学内科(J. Hohlfeld)和儿科(M. Ballmann);德国吉森大学医学院儿科系(H. Lindemann);德国科隆大学儿科系(E. Rietschel)。该研究由德国Frechen的Acromion GmbH进行监测。在研究开始前,根据良好临床实践指南、当地法律、法规和组织,所有参与中心都获得了适当的伦理委员会的书面批准。在进行任何研究程序之前,均获得所有受试者的书面知情同意。gydF4y2Ba
研究人群gydF4y2Ba
纳入标准为:临床症状诊断为CF,汗液试验阳性或疾病诱发突变;年龄≥8岁;一秒钟用力呼气量(FEV)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) >预测值的25%;在就诊1时痰样本中检测到游离弹性蛋白酶活性水平(游离弹性蛋白酶活性水平为2)gydF4y2BasdgydF4y2BaS以上为阴性空白样品);至少三次检测呈阳性gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba既往2年就诊,第1次诱导痰检测阳性;在访问1前2周及研究期间稳定的伴随治疗;以及书面知情同意书。gydF4y2Ba
排除标准:有肺移植史;2年内有肺部手术史;在任何胸外科手术等候名单上;严重伴发疾病(严重恶性疾病,充血性心力衰竭,纽约心脏协会III/IV,肺心病,需要吸氧治疗);重度肝硬化伴腹水、脾功能亢进或III/IV级食管静脉曲张;选择性IgA缺乏症伴抗IgA抗体;筛查前4周内出现活动性肺加重;当前吸烟者;怀孕或哺乳的;作为一个育龄女性,没有足够的避孕措施。gydF4y2Ba
研究大纲gydF4y2Ba
在第一次访视(访视1)时,符合条件的受试者获得一个随机数字。因此,每位受试者都收到了一个单独编程的SMART CARD (Inamed Gmbh, Gmünden,德国),与AKITA®设备(Inamed Gmbh)一起使用,该设备通过支气管或外周沉积确定各自的吸入模式gydF4y2Ba19gydF4y2Ba.在接下来的2周磨合期,受试者每天吸入一次等渗盐水溶液,以适应吸入模式。随访2时,进行基线测量,并在吸入AAT后开始为期4周的治疗期。2周(访视3)和4周(访视4)后,重复所有测量。研究治疗被添加到患者的常规治疗中。仅在医院进行研究访问时进行痰诱导,如下所述。gydF4y2Ba
治疗管理gydF4y2Ba
为了确定AAT沉积的最佳区域,在与吸入装置(AKITA®吸入装置与Pari LC Plus (Pari, Starnberg, Germany)或Pari LC Star喷雾器(Pari)连接的智能卡上以双盲方式编程了两种吸入模式。根据Brand描述的方法,患者被随机分配到支气管沉积组或周围沉积组gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
周围沉积通过缓慢的吸入流量(200 mL·s)实现gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)和根据肺活量测定法测定的个人吸气量计算出的个人吸入量。因此,使用以下公式吸入量gydF4y2Ba19gydF4y2Ba:gydF4y2Ba
2×egydF4y2Ba(-1.5 /吸气量)gydF4y2Ba+ 0.25 (1)gydF4y2Ba
用于周围沉积的喷雾器是Pari LC Star,可提供质量中值直径(MMD)为3.5微米的气溶胶。gydF4y2Ba
支气管沉积是通过非常缓慢的100 mL·s的吸入流量实现的gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba吸入量低,为个人吸气量的60%,最大值0.5 L。使用的喷雾器是Pari LC Plus,产生烟雾浓度为5.0 μ m的气溶胶。这两个星云的外观完全相同。gydF4y2Ba
SMART卡被设定为沉积25mg AAT (Prolastin®;Bayer Corporation, Clayton, NA, USA)在治疗阶段。Prolastin®由人血浆制成,在溶液中主要是单体(>99.5%)。它由纯化的AAT在含有100-210毫米钠,60-180毫米氯化物和15-28毫米磷酸钠的缓冲液中组成。在磨合阶段,根据各自的吸入模式吸入等量的等渗盐水溶液而不是AAT。每日吸入发生在晚上18:00至23:00之间。吸入所需时间为5 ~ 15分钟,取决于患者的肺功能。在智能卡上监测治疗依从性(吸入日期和时间、呼吸次数和每次呼吸的完整性)。gydF4y2Ba
诱导痰gydF4y2Ba
在前一天晚上AAT吸入后,于9点至13点在医院进行研究访问时获得诱导痰。在诱导痰液前,受试者接受物理治疗和肺活量测定,然后吸入两口沙丁胺醇,并使用连接到Pari Master压缩机(Pari)的Pari LC Plus雾化5 mL 5.85%氯化钠溶液15分钟。在痰诱导过程中有一名医生在场。gydF4y2Ba
将混合的痰液分为三个不同的样本:一个用于细菌学(0.5-1 mL),一个用于AAT、弹性蛋白酶、细胞因子和中性粒细胞评估(3 mL),一个用于IgG测定(3 mL)。用于细菌学分析的样品在4°C的温度下连夜运往Max von Pettenkofer研究所,这是德国南部的一个用于研究细菌的参考实验室gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在慕尼黑大学。AAT、弹性蛋白酶、细胞因子、中性粒细胞和IgG分析样品用二硫苏糖醇(DTT;Sputolysin;Calbiochem Biosciences, Beeston, UK),通过Nitex凝视过滤器(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)过滤,并用Hanks溶液清洗。痰悬液500倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃静置10 min,上清液4000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置20分钟。然后将上清液与蛋白酶抑制剂(0.5 mM EDTA, 500µM Pefabloc (Merck, Darmstadt, Germany), 5µM E-64, 50µM Bestatin (Roche, Basel, Switzerland))混合,以阻断游离弹性蛋白酶活性并避免gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba蛋白质水解。等分的上清液在-70°C冷冻,直到最终分析。用细胞球制备细胞旋载片,每片使用20万个细胞。May-Grünwald-Giemsa染色共分化细胞≥400个。用台盼蓝染料排斥试验评价其活性。剩余的细胞悬浮在Hanks缓冲液中4°C,立即进行流式细胞术处理。gydF4y2Ba
ELISA法测定AAT水平。根据Hilliard所描述的标准方案,用显色法分析了自由弹性蛋白酶活性的水平gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba.的数量gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba根据HogardtgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
流式细胞术gydF4y2Ba
使用cd45 -异源藻蓝蛋白(APC)小鼠IgG1 (Pharmingen, Heidelberg, Germany)和小鼠IgG1-APC (Immunotech, Marseille, France)作为同型对照。计算使用Cell Quest分析软件(Cell Quest Pro;Becton-Dickinson,海德堡,德国)。再悬浮的痰细胞用人IgG阻断20分钟,以避免非特异性结合。然后用单克隆抗体孵育40 min,洗涤2次,最后用流式细胞仪(FACS Calibur;Becton-Dickinson)gydF4y2Ba22gydF4y2Ba.在研究之前,中性粒细胞和肺泡巨噬细胞之间的区分是优化的。中性粒细胞的门控是基于光散射特性和CD45阳性表达。在目前的实验环境中,巨噬细胞比CF患者痰液中大量的凋亡或死亡细胞更不受干扰。因此,碘化丙啶(5 μg·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba;Sigma, St Louis, MO, USA)和Annexin v -荧光素异硫氰酸酯(5 μg·mL)gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba,稀释1/100;Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany)用于区分完整的存活白细胞(Annexin VgydF4y2Ba-gydF4y2BaπgydF4y2Ba-gydF4y2Ba细胞凋亡(Annexin V .gydF4y2Ba+gydF4y2BaπgydF4y2Ba-gydF4y2Ba)和坏死(膜联蛋白VgydF4y2Ba+gydF4y2BaπgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)细胞。分析中只包括存活的中性粒细胞。这些门用于分析每个样本中的10,000个中性粒细胞。gydF4y2Ba
免疫球蛋白GgydF4y2Ba
对于IgG片段的鉴定,根据Fick的方法进行了改进gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba是使用。用蛋白酶抑制剂预处理的共10µL的痰上清液冻干,溶解在20µL的样品缓冲液中,在70°C下还原10分钟(NuPAGE还原型剂;Invitrogen, Madison, WI, USA)。样品,连同500 μ L抗氧化剂(NuPAGE抗氧化剂;用10% Bis-Tris Gel进行电泳,以500 ng人IgG为标准品。评价了人白细胞弹性蛋白酶(HLE)对IgG的影响gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba从人血清(Sigma)中分离出500 ng IgG与HLE (40 U·mL)孵育gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba;EPC, St. Louis, MO, USA)在37°C下放置2小时。将蛋白质转移到硝化纤维膜上(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)进行半干Western blotting (Xcell II blot)。IgG片段用2.5µL特异性山羊抗人IgG抗体孵育12 h鉴定。化学发光强化信号后,用计算密度计(Fluor-S MultiImager;BioRad, Richmond, CA, USA),并使用Quantity One (BioRad)进行半定量分析。为了检测凝胶之间对应的蛋白斑点,将所有印迹进行堆叠,并根据分子量进行斑点匹配。gydF4y2Ba
细胞因子蛋白水平gydF4y2Ba
根据制造商说明书(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA),用夹心ELISA法分析痰上清液中IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-1β水平。LTB水平gydF4y2Ba4gydF4y2Ba根据制造商说明书(Amersham Pharmacia Biotech),用夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测痰液上清。检出限为3.5 pg·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2BaIL-8为0.12 pg·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2BaTNF-α为1 pg·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba为1.25 pg·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba对于LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba.此外,以相同稀释度对痰样本进行DTT预处理和未进行DTT预处理时,分析痰中细胞因子水平。gydF4y2Ba
细胞因子mRNA水平gydF4y2Ba
采用实时定量RT-PCR系统(Icycler;Biorad, Hercules, CA, USA)根据制造商的说明。使用以下正向(F)和反向(R)引物对。IL-8F: TCTTGGCAGCCTTCCTGATT;IL-8R: TCCAGACAGAGCTCTCTTCCATC;肿瘤坏死因子-αF: AGGAACAGCACAGGCCTTAGTG;肿瘤坏死因子-αR: AAGACCCCTCCCAGATAGATGG;il - 1βF: CAGGGACAGGATATGGAGCAA;IL-1βR: ATGTACCAGTTGGGGAACTG。诱导痰细胞用Trizol LS试剂(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)裂解。 Total RNA (200–500 ng) was isolated according to the manufacturer's instructions and reverse transcribed into cDNA. Expression levels of cytokines were determined in duplicate by real-time RT-PCR using SYBR green and the iCycler iQ detection system (Biorad). Threshold cycle values for genes of interest were normalised to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and used to calculate the relative quantity of mRNA expression.
统计数据gydF4y2Ba
主要分析人群为改良意向治疗(mITT)人群,包括所有接受任何剂量研究药物(AAT)并至少进行过一次主要疗效变量评估的随机受试者。gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba诱导痰中游离弹性蛋白酶活性基线值(来访2)。诱导痰中游离弹性蛋白酶活性从基线值到终点值的主要疗效比较采用双向ANCOVA,以治疗组和中心为固定因素(主要效应模型),诱导痰中游离弹性蛋白酶活性基线值为mITT人群的协变量。基于gydF4y2BasdgydF4y2Ba如前所述,痰中弹性蛋白酶活性水平gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,计算每个治疗组24名受试者的样本量,以检测诱导痰中自由弹性蛋白酶活性的变化gydF4y2BasdgydF4y2Ba5%的双面阿尔法和80%的幂。所有进一步的计算都是以探索性的方式进行的,包括对联合沉积组进行前后比较的总体治疗效果的评估(多重比较的Wilcoxon和符号校正Bonferroni检验)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
研究种群、沉积方式和安全性gydF4y2Ba
本研究共纳入72例CF受试者。共有37名受试者被随机分为外周沉积组和支气管沉积组(图1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).8名受试者在AAT治疗前的磨合阶段因以下协议违反而退出:无法产生痰(2名患者),纳入研究后诊断为IgA缺乏症(1名患者),由于个人呼吸模式(1名患者)而无法使用AKITA®设备进行每日吸入(1名患者),以及因个人原因撤回同意或停止研究(4名受试者)。另外5名患者因其他规程违反而被排除在研究之外。因此,59名受试者接受了至少一剂量的研究药物,并对安全性和意向治疗(ITT)分析有效。7名受试者因主要疗效变量(诱导痰中游离弹性蛋白酶活性)数据缺失或无效,未产生痰液或无法进行痰液分析而被排除。剩余的受试者组(mITT组)在研究前被定义为主要分析人群。因此,分析基于28名使用吸入进行外周沉积的受试者和24名使用吸入进行支气管沉积的受试者。两个沉积组的基线特征无统计学差异(表1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).电子记录的研究药物依从性良好。gydF4y2Ba
周围沉积组出现不良事件的受试者数量为30例中的10例(治疗期28例中的7例),支气管沉积组出现不良事件的受试者数量为29例中的13例(治疗期24例中的8例)。除一例严重不良事件(鼻窦炎)外,其他所有不良事件均为轻度或中度。未发生严重不良事件。到研究结束时,所有不良事件均得到解决或改善。每组有3名受试者发生药物相关不良事件。其中之一(疲劳)可归因于吸入操作或生理盐水,因为它已经发生在磨合阶段。支气管沉积组出现2例其他药物相关不良事件(疲劳和咯血),外周沉积组出现3例(瘙痒、流感样疾病、胃肠道疼痛)。gydF4y2Ba
在AAT吸入基线时或吸入2周和4周后,外周和支气管沉积组在自由弹性蛋白酶活性、AAT水平、中性粒细胞百分比、gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba痰计数、细胞因子水平、IgG片段(表2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),肺功能(FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,功能肺活量,最大呼气流量为肺活量的25%),加重次数和总体不良反应率(数据未显示)。由于所分析的任何参数都没有发现外周或支气管AAT沉积部位之间的差异,因此通过结合两个沉积组并进行前后比较,在探索性分析中评估吸入AAT的总体效果。gydF4y2Ba
αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶和自由弹性蛋白酶活性gydF4y2Ba
25mg AAT治疗后2周(p<0.001)和4周后AAT浓度增加(p<0.001;图2一个gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba治疗4周后诱导痰中游离弹性蛋白酶活性水平略有降低(p<0.05;图2 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).此外,治疗4周后吸入AAT可降低痰中性粒细胞百分比(p<0.05;图3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)及减gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba治疗4周后计数(p<0.05;图3 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),而FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba没有改变(图3cgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
综上所述,这些数据表明4周αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶吸入可减少囊性纤维化患者的气道炎症。虽然未观察到对肺功能的影响,但气道炎症的减轻可能先于肺结构的改变。更长时间的安慰剂对照研究,旨在沉积最佳量的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba将抗胰蛋白酶注入囊性纤维化患者的肺部是值得进行的。gydF4y2Ba
促炎细胞因子gydF4y2Ba
DTT治疗对IL-8、TNF-α、IL-1β和LTB无显著影响gydF4y2Ba4gydF4y2Ba级别(数据未显示)。痰中IL-8蛋白水平(图4agydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba), IL-1β(图4b .gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba), TNF-α(图4cgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)及LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba(图4 dgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)和痰中IL-8 mRNA水平(图5agydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba), IL-1β(图5b .gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)和TNF-α(图5cgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)在吸入AAT 2周和4周后与基线相比显著下降。IL-8 (r = 0.48, p<0.01)、IL-1β (r = 0.39, p<0.05)、TNF-α (r = 0.4, p<0.05)、LTB4 (r = 0.45, p<0.05)蛋白水平的变化及中性粒细胞的变化(r = 0.52, p<0.01)与游离弹性蛋白酶水平的变化呈正相关。gydF4y2Ba
免疫球蛋白GgydF4y2Ba
发现cf相关蛋白酶将IgG裂解为两个抗原结合片段(F(ab))gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和可结晶碎片(Fc)gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba.在本研究CF患者的痰样本中,在还原条件下检测到26 kDa、32 kDa、36 kDa、43 kDa和54 kDa的IgG条带(图6)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).根据先前的研究分析蛋白裂解的IgG片段gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba29gydF4y2Ba其中,26kda条带对应于IgG轻链的还原形式,32kda条带对应于裂解的IgG Fc片段gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba43-kDa带到裂解的F(ab)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba片段gydF4y2Ba28gydF4y2Ba.36kda波段无法识别。54-kDa条带是168 kDa的常规IgG重链的还原形式gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba29gydF4y2Ba.HLE将IgG裂解成F(ab)处理IgGgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和Fc片段。吸入AAT 4周后,54-kDa IgG的百分比显著增加(图7agydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),而其他IgG条带未见明显变化。在AAT治疗前后,54-kDa IgG的百分比与痰中自由弹性蛋白酶活性水平呈负相关(图7bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
吸入AAT的有效治疗至关重要的是,尽可能高的雾化药物到达肺内的目标区域。在以前的研究中,已经确定了允许优先将吸入药物靶向CF患者肺部特定区域的气溶胶和呼吸特征gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba.据作者所知,这是第一个研究CF患者肺部外周和支气管沉积部位之间药物疗效可能存在差异的研究。已知和固定量的AAT沉积在每个患者的气道中,完全由AKITA®设备控制。据推测,更多的外周AAT沉积可能优于支气管沉积。然而,两种沉积模式在自由弹性蛋白酶活性水平和其他几个参数的变化方面没有发现显著差异。gydF4y2Ba
尽管AAT治疗后游离弹性蛋白酶活性水平有轻微变化,但通过诱导痰中中性粒细胞和促炎细胞因子分析,AAT的吸入显著降低了气道炎症。最近的研究表明AAT作为一种抗炎调节剂的作用gydF4y2Ba31gydF4y2Ba独立于它的抗蛋白酶作用。AAT抑制脂多糖(LPS)诱导的单核细胞TNF-α和IL-1β的释放,剂量依赖性地抑制中性粒细胞IL-8的释放gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba.此外,LPS刺激后灌注AAT可阻止LPS诱导的IL-8产生gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba31gydF4y2Ba.目前CF患者吸入AAT后痰蛋白和IL-1β、TNF-α mRNA水平明显下降。因此,推测吸入AAT可能抑制lps诱导的上皮细胞和肺泡巨噬细胞产生TNF-α和IL-1βgydF4y2Ba32gydF4y2Ba,从而减轻CF患者的肺部炎症。其他丝氨酸蛋白酶的抑制作用也被吸入AAT中和,如蛋白酶3,可能导致吸入AAT对弹性蛋白酶活性水平的微小影响与对炎症参数的明显影响之间的差异。gydF4y2Ba
研究发现,吸入4周AAT可减少CF气道的中性粒细胞炎症,这与慢性呼吸道炎大鼠模型一致gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba肺部感染gydF4y2Ba33gydF4y2Ba雾化后的AAT减少了肺中性粒细胞和细菌数量gydF4y2Ba33gydF4y2Ba.在McElvaney的一项研究中gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba研究发现,CF患者吸入雾化AAT可增加支气管肺泡灌洗液(BAL)中AAT水平,降低弹性蛋白酶活性水平。与对McElvaney的研究相反gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba在本研究的患者中,吸入AAT并没有显著降低弹性蛋白酶活性水平。这种差异可能是由于使用的材料,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba落下帷幕gydF4y2Ba与gydF4y2Ba诱导痰。与BAL上清液相比,诱导痰是一个更复杂的基质,包含大量破碎和坏死的中性粒细胞,包括大量的中性粒细胞弹性蛋白酶。因此,本研究中所有的痰样本都是通过明确的诱导技术获得的,运到中心实验室并在标准化条件下进行分析。然而,gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba诱导痰标本的操作,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba混合和离心,可能导致细胞内弹性蛋白酶释放到痰上清。因此,据推测,中和所有蛋白酶存在于痰样本gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba与BAL液上清液相比,需要更多的抗蛋白酶。乍一看,使用BAL来评估CF患者的抗蛋白酶治疗效果可能更可取。而CF患者痰液中弹性蛋白酶和中性粒细胞较BAL丰富gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba.此外,必须记住BAL也反映肺泡腔室,CF肺病主要局限于支气管和细支气管腔室。gydF4y2Ba
马丁gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba37gydF4y2Ba检查了吸入重组羊AAT对CF患者的影响,并使用自发咳痰分析游离弹性酶、AAT、髓过氧化物酶和IL-8水平。尽管使用了较高剂量的AAT,并且与作者的观察结果一致,但吸入AAT不能完全中和痰中的游离弹性蛋白酶。沉积方式和顺应性不受控制。与目前的研究结果一致,在接受AAT治疗后,CF患者痰液中作为中性粒细胞标志物的髓过氧化物酶水平较低。中性粒细胞百分比和gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba没有对计数进行分析。gydF4y2Ba
已知CF蛋白酶能将IgG裂解成F(ab)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和Fc片段导致完整的IgG蛋白缺乏和功能受损的IgG裂解片段的积累gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba.这些IgG片段影响中性粒细胞的功能gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba通过损害细菌诱导的趋化性gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,氧化爆发gydF4y2Ba27gydF4y2Ba还有酶的释放gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,导致调理吞噬功能缺陷gydF4y2Ba23gydF4y2Ba.在本研究中,痰中高弹性蛋白酶活性水平与完整(54 kDa) IgG蛋白减少有关,而吸入AAT与CF气道中完整IgG蛋白增加有关。同样,菲克gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba发现CF患者BAL中完整的IgG蛋白与游离弹性蛋白酶活性呈负相关。目前CF患者经AAT治疗后痰中IgG裂解片段(12-43 kDa)不变。肺泡吞噬细胞去除降解的IgG片段可能解释了这一现象。gydF4y2Ba
目前的研究有几个局限性。由于主要目的是评估两种沉积模式之间的疗效差异,因此没有包括安慰剂对照组,这在很大程度上限制了从数据中得出的结论。为了进一步研究吸入AAT对CF患者的影响,安慰剂对照组是必不可少的。虽然与目前的蛋白水解性气道损伤概念非常一致,但目前研究中观察到的AAT吸入的特定影响可能是非特异性的。gydF4y2Ba
两种选择的呼吸方式来获得更外围或中心的沉积,估计仍有30%的重叠。因此,在两种呼吸模式下,吸入药物的很大一部分沉积在小气道中是无法避免的。因此,不能完全排除两种呼吸方式AAT治疗效果差异不大可能是由于AAT在两种情况下都沉积在小气道。gydF4y2Ba
此外,在研究开始前进行的样本量计算是基于Döring和同事之前的观察gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba但在本研究中发现的弹性蛋白酶活性水平和弹性蛋白酶变化明显较低。基于现在的平均值±gydF4y2BasdgydF4y2Ba一项新的研究旨在检测痰中自由弹性蛋白酶活性从30µg·mL下降gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba至15µg·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba如果能量为80%,则每组需要约60个CF受试者。AAT治疗4周后痰中仍可检测到游离弹性蛋白酶活性。由于电子监测依从性良好,可以排除吸入性不足的情况。由于在足够的吸入时间内提供几倍大剂量的AAT在技术上是可行的,因此AAT在肺中的沉积量>25 mg可能是合理的。gydF4y2Ba
图8gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba总结了游离弹性蛋白酶在CF患者气道中的作用。生理上,弹性蛋白酶是复杂和中和的AAT。由于CF气道弹性蛋白酶/AAT不平衡,自由弹性蛋白酶活性以多种方式破坏肺环境。弹性蛋白酶通过切割中性粒细胞上的补体受体1和巨噬细胞上的磷脂酰丝氨酸受体(未显示)来损害先天免疫反应,从而减少细菌杀伤和凋亡细胞的清除。弹性蛋白酶触发支气管上皮细胞产生IL-8gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.释放的IL-8反过来诱导中性粒细胞分泌弹性蛋白酶,并将中性粒细胞吸引到肺。弹性蛋白酶通过将IgG裂解为F(ab)而损害适应性免疫gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和Fc片段gydF4y2Ba23gydF4y2Ba.肺部宿主防御功能受损导致CF气道内细菌数量增加。最后,肺结构的慢性蛋白水解损伤导致CF患者的支气管扩张和肺破坏。gydF4y2Ba
![图1 -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/2/240/F1.medium.gif)
图中为患者选择算法。CF:囊性纤维化;ITT公司:意向处理;mITT:修改后的ITT。gydF4y2Ba
![图2 -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/2/240/F2.medium.gif)
α水平gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶(AAT)和自由弹性蛋白酶活性。a)在磨合期结束时(基线)以及吸入AAT 2周和4周后,AAT的痰液水平和b)自由弹性蛋白酶活性水平。p值显示为与基线的比较(符号测试和Bonferroni校正)。条形代表平均值+gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba.gydF4y2BansgydF4y2Ba:不重要的。* * *: p < 0.001;*: p < 0.05。gydF4y2Ba
中性粒细胞,gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba还有肺功能。a)中性粒细胞百分比,b)gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Bac) 1秒用力呼气量(FEV)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)在磨合期结束(基线)和α 2周和4周后gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶吸入。cfu:菌落形成单位。p值显示为与基线的比较(符号测试和Bonferroni校正)。条形代表平均值+gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba.gydF4y2BansgydF4y2Ba:不重要的;% pred: %预测。*: p < 0.05。gydF4y2Ba
![图4 -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/2/240/F4.medium.gif)
促炎细胞因子。a)白介素(IL)-8, b) IL-1β, c)肿瘤坏死因子-α和d)白三烯b的蛋白质水平gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在磨合期结束(基线)和α 2周和4周后的痰上清液中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶吸入。*: p < 0.05;* *: p < 0.01。gydF4y2Ba
促炎细胞因子。a)白细胞介素(IL)-8, b) IL-1β和c)肿瘤坏死因子-α在磨合期结束(基线)和α 2周和4周后痰细胞微球中的mRNA水平gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶吸入。感兴趣基因的阈值循环值归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),并用于计算mRNA表达的相对量。p值显示为与基线的比较(符号测试和Bonferroni校正)。条形代表平均值+gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba.*: p < 0.05;* *: p < 0.01。gydF4y2Ba
囊性纤维化(CF)患者痰中免疫球蛋白(Ig)G的检测。1例典型CF患者在α治疗4周前(通道1)和后(通道2)痰中IgG片段减少gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶吸入与500ng人IgG(通道3)和500ng人IgG治疗比较gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba用40u的人白细胞弹性蛋白酶(HLE)在37°C (lane 4)处理2小时。用HLE处理IgG将IgG裂解成两个抗原结合体(F(ab))gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和可结晶(Fc)碎片。gydF4y2Ba
免疫球蛋白(Ig) g54 - kda片段和游离弹性蛋白酶活性水平。a)囊性纤维化(CF)患者在磨合期结束时(基线)以及吸入25mg α 2周和4周后诱导痰中54-kDa IgG的百分比gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶(AAT),每日一次。条形代表平均值+gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba.p值显示为与基线的比较(符号测试和Bonferroni校正)。gydF4y2BansgydF4y2Ba:不重要的。* *: p < 0.01。b)磨合期结束时CF患者诱导痰中54-kDa IgG百分比与游离弹性蛋白酶活性水平的相关性(〇;r = -0.49, p<0.05), AAT吸入4周后(•;R = -0.43, p<0.05)。54-kDa IgG表示为检测到的总IgG的百分比。相关性计算采用Spearman rho检验。gydF4y2Ba
弹性蛋白酶在囊性纤维化(CF)气道中的作用。在白介素(IL)-8刺激下,人白细胞弹性蛋白酶(HLE)被中性粒细胞释放到气道中(1),在气道中HLE被α复合和中和gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶(AAT;2).由于CF气道HLE/AAT失衡,游离HLE以多种方式破坏肺环境(3-8)。HLE通过切割中性粒细胞上的补体受体1 (CR1)来削弱先天免疫反应(3),从而减少细菌杀灭。此外,HLE触发支气管上皮细胞产生IL-8(4)。释放的IL-8从循环中通过内皮细胞吸引大量中性粒细胞到肺泡间隙(5)。HLE通过将免疫球蛋白G切割成F来损害适应性免疫(ab)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受损的宿主防御导致损伤肺组织的细菌数量增加(7)。最后,肺结构的多重蛋白水解损伤导致CF患者的支气管扩张和肺破坏(8)。外源性补充AAT可能减弱这些有害过程。此外,AAT可以作为一种抗炎药,独立于其抗蛋白酶活性,通过降低CF气道中的游离IL-8水平(9)。gydF4y2Ba
主要分析人群的患者特征和依从性(改良意向治疗人群)gydF4y2Ba
测量外周和支气管沉积组的变量,以及α 4周后从基线到终点的变化gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶(AAT)吸入gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
对于αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶研究组作者要感谢:J. Bargon,内科,圣伊丽莎白医院,法兰克福,德国;法兰克福大学内科C. von Mallinckrodt教授和儿科H.G. Posselt教授;德国汉诺威大学内科系J. Hohlfeld和儿科系M. Ballmann;德国吉森大学儿科系H. Lindemann;和德国科隆大学儿科系E. Rietschel。作者还想感谢J. Humphries在研究设计方面的熟练建议和B. Sommerauer的生物特征分析。还要感谢B. Müllinger、G. schuch (Inamed, Gmünden,德国)、S. Gruschka和A. Schams(德国慕尼黑儿童大学医院)提供的出色技术援助。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
编辑评论见第229页。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba二零零六年四月五日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba二零零六年十月十日。gydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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