文摘
成纤维细胞的增长从支气管肺泡灌洗液(BALF)在系统性硬化症患者(SSc)曾被描述。本研究的目的是描述成纤维细胞从BALF和支气管活检SSc牙槽炎患者和控制,分析纤维母细胞增殖,迁移,应力纤维和蛋白多糖生产。
BALF和支气管活检收集从10 SSc和牙槽炎患者和15控制。
观察产物的成纤维细胞BALF的四个病人,尤其是在那些BALF中嗜酸性粒细胞的百分比显著增加,但不是在任何成员的对照组。集落刺激因子的水平,增加关联与BALF中嗜酸性粒细胞的百分比,被发现的病人相比,控制。BALF的成纤维细胞显示一个细长,移动表型和蛋白多糖产量的增加而相应的切片成纤维细胞。
总之,产物的成纤维细胞表型改变报告从支气管肺泡灌洗液中系统性硬化患者牙槽炎和嗜酸性粒细胞的百分比增加支气管肺泡灌洗液。这些发现表明可能eosinophil-fibroblast交互作用在系统性硬化症的肺纤维化。
系统性硬化症(硬皮病;SSc)是一种自身免疫系统疾病的特点是微血管病和皮肤和内脏器官的纤维化。有或没有肺动脉高压肺纤维化,是死亡的主要原因1和严重的患者发病率SSc。间质性肺疾病、纤维化和/或牙槽炎可能会发现在事后剖析考试或高分辨率计算机断层扫描(HRCT)∼90%的病人2。一些研究显示,牙槽炎之前SSc患者和肺纤维化可能由HRCT诊断或支气管肺泡灌洗(BAL)中增加了大量的炎症细胞BAL流体(BALF)表明牙槽炎2。增加中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的百分比已发现与肺一氧化碳扩散能力下降DL,有限公司)2。最近,Bouroset al。3报道称,更高水平的嗜酸性粒细胞BALF中与SSc患者死亡率增加有关。也含有大量的嗜酸性粒细胞与不良预后有关在特发性肺纤维化(IPF)4。
在之前研究当前的作者SSc患者病程短,生产versican biglycan和decorin皮肤成纤维细胞相关的皮肤厚度和回声的变化来衡量超声波5。在哮喘、支气管旁纤维化疾病的特征,增加大量的几种蛋白聚糖报道支气管成纤维细胞的培养基,在其中的一些相关蛋白聚糖也可以代答6。此外,当前作者最近报道说,薄的成纤维细胞,细长的表型可以培养BALF的哮喘患者增加大量的嗜酸性粒细胞7。这些成纤维细胞被激活α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)表达myofibroblasts和显示迁移和蛋白多糖生产相比,增加相应的切片成纤维细胞。成纤维细胞的增长已经注意到患者BALF的SSc活跃的肺部疾病8。据报道这些成纤维细胞有更高的胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达与正常相比,成人肺成纤维细胞从尸体解剖。
细胞因子和生长因子,如endothelin-1和转化生长因子(TGF) -β释放t细胞和内皮细胞,可能有能力激活成纤维细胞增殖和基质生产增加9。集落刺激因子(gm - csf)是一种生长因子,合成和释放特别是嗜酸性粒细胞,内皮细胞和成纤维细胞。gm - csf有能力影响扩散,嗜酸性粒细胞的分化和招聘,也是影响成纤维细胞和内皮细胞,可能导致组织改造和血管生成10。增加BALF的gm - csf水平被发现在间质性肺病患者嗜酸性粒细胞11。
本研究的目的是:1)描述成纤维细胞从BALF和支气管活检获得SSc牙槽炎患者和控制;2)分析细胞内容和BALF中细胞因子的浓度,成纤维细胞增殖,迁移,应力纤维和蛋白多糖生产。
患者和方法
病人
本研究包括在10例(四个男性)29岁- 69岁(平均58岁)遭受SSc和牙槽炎诊断的HRCT(表1所示⇓)。所有患者实现美国风湿病学院标准SSc:四个弥漫性皮肤SSc12和六个皮肤SSc有限。在大多数病人疾病持续时间很短,平均1.5岁,范围0.5 -32年。9名患者的10不吸烟者。没有一个病人接受任何假定的治病的药物。对照组由15名健康,不吸烟24-58年岁的志愿者。控制与肺功能测试和筛选metacholine吸入的剂量测试导致一秒钟用力呼气量下降20%为了排除患有肺病。患者的肺功能评估肺活量(VC)、以干肺活量计,DL,有限公司次呼吸测量的方法。两人都表示为百分数预测价值。参与评估,修改Rodnan皮肤得分。
方法
落下帷幕进行知情同意后,与100 - 150毫升(5−7×20毫升)的0.9%氯化钠溶液。恢复灌洗液的体积变化26.5 -70毫升。洗胃后,支气管活检被从中央支气管肺的一部分九病人和所有控件。年级牙槽炎,BALF细胞计数差进行cytospin May-Grunewald-Giemsa准备染色的方法。总共400个细胞被同一个人统计(m .称)。HRCT扫描被打入“蒙蔽”观察者(s . Ellis)评估肺毛玻璃样阴影的百分比(GGO)和网状物,以及地区GGO和网状。此外,对于这三个模式方面的疾病的严重程度得分区域涉及的数量(最小值0;马克斯6)。扫描被分为六个区域,三个为每个肺:低于肺静脉汇合;肺部静脉之间的融合和船底座;以上船底座(表2所示⇓)。
纤维母细胞文化的建立、BALF和活检在25厘米孵化2组织培养瓶Dulbeco修改鹰的介质(σ化学品,圣路易斯,密苏里州,美国)补充10%胎牛血清(美国UT Hyclone,洛根),l-glutamin(2毫米;西格玛化学品)、两性霉素B(μg·5毫升−1)和庆大霉素(μg·50毫升−1)。烧瓶是储存在37°C调湿细胞孵化器有限公司为5%2和95%的气氛。汇合的时候,细胞从瓶底放松治疗0.05%胰蛋白酶对70年代和分为两个新瓶。
浓度的BALF中两种细胞因子与ELISA分析;gm - csf和内皮素(ET) 1。ELISA方法是Quantikine(研发系统,阿宾顿,英国)。测试的检测极限是0.26 pg·毫升−1gm - csf和1.0 pg·毫升−1ET-1。
增殖、迁移和形态描述
成纤维细胞的增长能力是评估72 h后用结晶紫如前所述7。30000年迁移试验,成纤维细胞被播种,允许在一个圆柱体坚持6 h通常用于克隆,置于一个室。汽缸摘除和成纤维细胞被允许迁移48 h。30分钟的细胞被固定在1%戊二醛,结晶紫染色2 h的0.5%和清洗。200个细胞的距离计算通过测量距离移除柱面的边界。用结晶紫形态进行了描述13。细胞形状记录长度的比值与200个细胞的宽度。
应力纤维
应力纤维分析,细胞被固定在4%多聚甲醛在PBS。permeabilisation后0.5% Triton x - 100和阻止1%牛血清白蛋白(BSA)在PBS, Alexa的细胞被孵化萤石®488 phalloidin探针(分子探针、莱顿、荷兰)稀释在阻止缓冲区。荧光显微镜用于研究细胞13。
α-SMA组织化学染色
α-SMA组织化学染色,老鼠单克隆抗体人类α-SMA (M0851;Alvsjo Dako, Dakopatts AB,瑞典),其次是Alexa萤石®584山羊anti-mouse免疫球蛋白G(分子探针)13。
免疫印迹
细胞溶解产物分离了4 - 12% Bis-Tris凝胶(表达载体,乌普萨拉,瑞典)3 - (N吗啉代)丙烷磺酸running-buffer。分离蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜和孵化主要抗体α-SMA (DAKO、斯特鲁普、丹麦)。第二个辣根过氧化物酶标记rabbit-antimouse (DAKO)使用抗体和乐队的强度使用Gel-Pro进行分析TM分析器软件(美国马里兰州银泉的媒体控制论,)14。
蛋白多糖生产
支流文化在段落三到六被贴上μCi·100毫升−1(媒介35硫酸24 h。使用离子交换凝胶蛋白聚糖是孤立的6并进一步分为decorin biglycan,硫酸乙酰肝素蛋白多糖和versican钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳6和蛋白质的数量计算每μg使用BSA方法。
统计数据
两组之间的显著差异水平计算使用Mann-Whitney紫外线测试未配对的观察。变量之间的关系进行了计算与斯皮尔曼′年代ρ相关性。
道德的考虑
这项研究是审查和批准的当地伦理委员会(Nr路193 - 01年)患者和控制。
结果
BALF细胞的状况
结果SSc患者被发现在50%的成纤维细胞活检和BALF中45%。相比之下,产物的成纤维细胞活检从控制在82%,但发现没有增长获得了从BALF的任何控件(表2⇑)。BALF中细胞总数-12年所有SSc患者为0.5×106(中位数2.5×106;表2⇑)与0.8 - -2.8×106(中位数1.05×106)控制(p = 0.14)。微分项SSc患者BALF划分根据BALF的成纤维细胞的增长和在控制如图1所示⇓。SSc患者增加的嗜酸性粒细胞的百分比(中位数2.0%;p < 0.01)和中性粒细胞(中位数9.0%;p < 0.05),而与控件(平均分别为0%和1%),而没有发现显著差异在淋巴细胞的百分比。嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞百分比高,尤其是在患者BALF中纤维母细胞生长(表2⇑)。之间没有相关性中性粒细胞和嗜酸性粒细胞和VC的百分比DL,有限公司。的两名患者BALF嗜酸性粒细胞的百分比增加但没有发现纤维母细胞生长的两个最严重影响患者,明显降低肺功能尽管疾病持续时间短。评估后,患者治疗1年,与环磷酰胺四,五个咪唑硫嘌呤和应用波生坦。1年治疗后肺功能如表1所示⇑。VC和DL,有限公司中位数73之前和85和73%和65% pred pred治疗后1年治疗后7例可评价的。
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/3/446/F1.medium.gif)
微分项(均值和扫描电镜)的支气管肺泡灌洗液(BALF)在9个系统性硬化症(SSc)患者牙槽炎和13个控制。患者分为根据增长(n = 4)或没有增长(n = 5) BALF的成纤维细胞。液体从一个病人被丢弃,因为污染。▒:嗜酸性粒细胞;░:中性粒细胞;▓:淋巴细胞;□:巨噬细胞。
水平的gm - csf和ET-1 BALF中
浓度的gm - csf BALF病人比对照组高(p < 0.02)。嗜酸性粒细胞的百分比之间的相关性被发现和gm - csf(图。2⇓;p < 0.01;ρ= 0.81)。中性粒细胞的百分比与gm - csf。gm - csf修正为嗜酸性粒细胞的百分比时,患者成纤维细胞的增长(n = 4)值高于患者没有增长(n = 3;p < 0.05)。两名患者和9个控制没有嗜酸性粒细胞,因此,gm - csf与嗜酸性粒细胞比率无法计算。总蛋白浓度增加的病人相比,控制,如预期(p < 0.01),但没有相关的嗜酸性粒细胞水平。没有发现显著差异在ET-1 BALF浓度;浓度被认为是中位数2.25(范围0 - 7.9)pg·毫升−1在病人和3.0 pg·毫升(1.15 - -9.5)−1在控制(数据未显示)。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/3/446/F2.medium.gif)
集落刺激因子(gm - csf)浓度之间的相关性和嗜酸性粒细胞的百分比在支气管肺泡灌洗液(BALF)九系统性硬化症患者,牙槽炎。从BALF○:患者成纤维细胞的增长;•:患者BALF的纤维母细胞生长。
描述BALF的成纤维细胞
SSc的成纤维细胞培养BALF倾向于迁移距离较长(中位数477μm;n = 3)比活检成纤维细胞(中位数386μm;图3⇓)。成纤维细胞的伸长的程度,取决于细胞长度宽度的比值,计算。BALF成纤维细胞显示薄细长的表现型(比中值6.93;n = 3),相比活检的成纤维细胞培养(比中值3.1;n = 3)。成纤维细胞被染色,使应力纤维可见。BALF中纤维母细胞,长纤维被证实含有长,厚f -肌动蛋白束(图4⇓),在相应的活检未见成纤维细胞(图4 b⇓)。myofibroblast标记的存在在完整细胞培养α-SMA如图4所示⇓BALF和dα-SMA显示无显著区别,biopsy-derived成纤维细胞,用免疫印迹(平均55 - 57·μg强度−1蛋白质,分别)。高72 - h BALF扩散成纤维细胞(中位数2.05;n = 3)比活检发现了成纤维细胞(1.44;n = 3)。生产实验、decorin versican和perlecan BALF成纤维细胞和相应的切片成纤维细胞在一个SSc病人如图5所示⇓。所有四个蛋白聚糖,BALF的产量更高的成纤维细胞活检成纤维细胞。
![图3 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/3/446/F3.medium.gif)
迁移的成纤维细胞培养的支气管肺泡灌洗液(BALF)和支气管活检在系统性硬化症(SSc)牙槽炎患者。- - -:中位数的值。
![图4 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/3/446/F4.medium.gif)
应力纤维(f -肌动蛋白束沾AlexaFluor®488 phalloidin)在成纤维细胞培养)支气管肺泡灌洗液(BALF)和b)在系统性硬化症患者支气管活检。α-Smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)成纤维细胞从c) BALF和d)支气管活检与老鼠单克隆抗体α-SMA紧随其后AlexaFluor®584山羊antimouse免疫球蛋白G。
蛋白聚糖的生产,实验(•)decorin (○) versican(▵)和perlecan(▾),在成纤维细胞培养从支气管肺泡灌洗液(BALF)和系统性硬化症(SSc)患者的活检。DPM:衰变·分钟−1。
值得注意的是,SSc的支气管活检患者的成纤维细胞显示没有区别于控制扩散,迁移,细胞表型或蛋白多糖生产。
讨论
本研究旨在描述BALF-derived SSc牙槽炎患者的成纤维细胞。它表明:1)这些成纤维细胞不同于那些通过支气管活检在形态和迁移能力和产生细胞外基质蛋白聚糖;2)从BALF纤维母细胞生长与BALF的嗜酸性粒细胞数量增加有关;和3)的嗜酸性粒细胞BALF积极与BALF的gm - csf水平相关。
获得成纤维细胞来自两BAL和支气管肺组织活检进行。开放肺活检是更可取的但与重要的发病率有关,thorascopic活检。因为健康对照组也包括在这项研究中这不是一个选择。活检取样是一个复杂的过程受到多种因素的影响,如本地化的活检,不得代表完整的肺。这个问题与活检构成最大的缺点之一。产物的成纤维细胞活检中发现50%的SSc患者与纤维母细胞相比,结果在82%的控制。造成这种差距的原因还不清楚,但也发现类似的结果在哮喘患者,产物的成纤维细胞在55%的活检(未发表的观察)。当前作者推测,活检肺成纤维细胞,成纤维细胞可能代表居民住宅的数量成纤维细胞或组织的当地环境可能有利于产物的增加这些成纤维细胞在细胞培养期间健康对照组。与正常的肺成纤维细胞相似15积极,活检SSc患者的成纤维细胞染色α-SMA,功能类似于健康对照组切片成纤维细胞。
在目前的研究中,结果α-SMA-positive成纤维细胞的观察BALF SSc和牙槽炎,患者而不是控制。这些观察结果证实先前的报道与人类平滑肌细胞分化成纤维细胞的生长特性从BALF 19 SSc的病人而不是一个对照组的成员8。BALF成纤维细胞的特征是一个细长的,移动的表现型,长,相应延长的肌动蛋白束,发现哮喘患者7。支持一个更移动BALF成纤维细胞与活检相比,成纤维细胞的表型是最近发现的增加表达的小鸟苷三磷酸酶RhoA Rac1,来诱导应力纤维和焦粘连SSc和哮喘病人14。此外,增加生产BALF成纤维细胞的细胞外基质蛋白聚糖与活检相比,成纤维细胞表明BALF成纤维细胞可能代表一个可能的来源增加细胞外基质堆积和纤维化,不仅在SSc还在哮喘7。然而,BALF SSc患者成纤维细胞不同于那些从哮喘病人获得细胞骨架和食腐动物蛋白质的蛋白质表达模式,提出额外的差异在SSc纤维化的发病机理和机制14。
成纤维细胞的细胞起源BALF还不清楚。他们可能代表分化居民从间质成纤维细胞或其他细胞类型分化转移的结果16。最后,他们可能由造血干细胞,如前所述纤维细胞被不同的趋化现象的物质17。纤维细胞都循环细胞表达造血的标记,如表面标记CD34、CD45和科学家趋化因子受体4以及间质胶原蛋白我和α-SMA等标记。几个因素,如。白介素(IL) 1 TGF-β趋化因子和血清淀粉样蛋白P (SAP),调节纤维细胞的外观和功能18。在TGF-β面前,纤维细胞分化假设myofibroblast表型表达α-SMA19。小鼠模型的过敏性哮喘、循环纤维细胞被证明是招募到支气管组织接触过敏原,分化成myofibroblasts20.。
在目前的研究中,指出,成纤维细胞可以从患者BALF培养的嗜酸性粒细胞水平增加,以类似的方式在哮喘病人以前观察到7。虽然高嗜酸性粒细胞计数BALF和结果之间的联系的成纤维细胞是不清楚,嗜酸性粒细胞和成纤维细胞之间的相互作用进行了研究在体外,显示一个潜在的pro-fibrotic联络。首先,在共培养模型,嗜酸性粒细胞刺激纤维母细胞增生,胶原蛋白生产和晶格收缩,至少部分由TGF-β介导的21。其次,嗜酸性粒细胞存储和释放TGF-β,这已被证明诱导myofibroblast分化成纤维细胞和上皮细胞10,16。有趣的是,gm - csf源自人类肺成纤维细胞增强嗜酸性粒细胞的生存在体外22和gm - csf添加到fibroblast-eosinophil培养调节嗜酸性粒细胞密度和功能23。嗜酸性粒细胞被认为是重要的组织在哮喘和改造也在间质性肺疾病中发挥作用10。关于SSc,增加血清嗜酸性粒细胞阳离子蛋白指示嗜酸性粒细胞激活与肺功能下降有关24。然而,嗜酸性粒细胞的作用在SSc纤维化的发病机制还有待阐明。因此,它不知道嗜酸性粒细胞是否支持招聘和成纤维细胞和纤维细胞的分化成myofibroblasts或者,相反,是否激活成纤维细胞释放趋化因子和细胞因子,如eotaxins和致使支持招聘和/或嗜酸性粒细胞的生存。
在目前的研究中,结果BALF的成纤维细胞与成纤维细胞表型观察患者增加嗜酸性粒细胞计数和BALF中gm - csf含量增加。同样,gm - csf含量增加的IPF患者BALF中观察到与嗜酸性粒细胞增多有关11。这些发现可能解释为gm - csf对嗜酸性粒细胞的影响生存或eosinophil-specific招聘25,这是反映在观察gm - csf和嗜酸性粒细胞之间的关系而不是中性粒细胞。感兴趣的SSc的肝纤维化发病机制的概念在HRCT上BALF中性粒细胞与纤维化的程度,而嗜酸性粒细胞的百分比与GGO的程度,代表牙槽炎认为SSc纤维化发展之前26。大多数病人在本研究疾病持续时间短,相对保存完好的VC(平均70%),表明限制肺纤维化发展能力还没有发生。
gm - csf的上下文中研究纤维化发展特别是在哮喘和IPF,暗示pro-fibrotic gm - csf的效果27,如。adenoviral vector-mediated的gm - csf基因转移据报道诱导大鼠肺嗜酸性粒细胞和纤维化和BALF TGF-β含量明显增加28。直到最近,gm - csf尚未在SSc的背景下进行研究。表达式的gm - csf receptor-α确诊SSc皮肤成纤维细胞在体外文化和gm - csf有抑制作用我蛋白质和胶原蛋白mRNA生产,建议一个相当anti-fibrotic效果29日。相比之下,此前数据显示增加患者BALF SSc的gm - csf水平与嗜酸性粒细胞和产物的增加增加有关proteoglycan-producing成纤维细胞与移动表型建议更pro-fibrotic gm - csf的函数。gm - csf因此可以参与招聘的炎症细胞,嗜酸性粒细胞和/或肺间质纤维细胞。然而,需要进一步的研究来解决gm - csf对嗜酸性粒细胞和纤维母细胞相互作用的确切机制,阐明gm - csf SSc的发病机理中的作用。
目前的研究表明,两种不同类型的成纤维细胞共存的患者的支气管树SSc:“正常”居民肺成纤维细胞,通过支气管活检和proteoglycan-producing成纤维细胞与高嗜酸性粒细胞计数和BALF中gm - csf含量增加。大胆的,这些BALF成纤维细胞可能来源于循环纤维细胞。令人惊讶的是,没有发现增长的两个最严重影响患者高嗜酸性粒细胞计数,其中一个还可能影响慢性阻塞性肺疾病的评价HRCT扫描。因此,gm - csf以外的因素可能是重要的促进成纤维细胞在BALF SSc的病人,如。SAP,据报道在血清因子,抑制纤维细胞分化30.。SSc SAP患者血清水平较低,表明低水平的SAP可能增加导致纤维化的病理过程。SSc群体内的变异很大,可能反映了广泛的疾病表现SSc。
总之,系统性硬化病是一种罕见的疾病,早期诊断困难,有一个广泛的疾病谱系,这妨碍了研究早期的疾病过程。材料目前的研究虽小和解释结果是困难的,结果可能表明eosinophil-fibroblast交互可以组织改造过程中一个重要的角色的肺纤维化系统性硬化症。增加死亡率Bouros报道et al。3系统性硬化患者和高支气管肺泡灌洗嗜酸性粒细胞和上面的结果要求进一步研究阐明嗜酸性粒细胞的作用,eosinophil-fibroblast硬皮病肺纤维化的发病机制的相互作用。
确认
作者要感谢d Wuttge eosinophil-fibroblast互动价值的讨论。
- 收到了2005年11月16日。
- 接受2006年11月4日。
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