抽象
半乳凝素-1和-3调节上皮细胞增殖/细胞凋亡和中性粒细胞活化,和在肺癌和哮喘有牵连。在慢性阻塞性肺疾病(COPD),其特征在于上皮改变和中性粒细胞浸润半乳凝素的作用,仍然是未知的。
在本研究中,半乳凝素-1和-3表达通过免疫组织学在肺标本来自八个重度COPD患者的支气管上皮评估,并与九个非吸烟者和六个吸烟者不COPD相比较。调查结果与上皮细胞增殖(Ki-67的),组织炎症和肺功能。
与不吸烟者和吸烟者相比,COPD患者的小气道上皮galectin-3免疫染色仅增加。相比之下,galectin-1只在吸烟者的小气道中显著升高。与吸烟者相比,COPD患者小气道的Ki-67+上皮细胞和中性粒细胞增加。此外,上皮内中性粒细胞在小气道中与Ki-67+上皮细胞相关,并与一秒钟用力呼气容积/用力肺活量比相关。但与半乳糖凝集素的表达无相关性。
本研究支持远端气道是检测慢性阻塞性肺疾病变化的重要部位这一假设。在重症患者中,galectin-3在小气道上皮细胞表达增加,中性粒细胞增多,这与上皮细胞增殖和气道阻塞有关。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见的疾病,其特征主要是易感吸烟者发生的不可逆气道阻塞1。<1?显示= [到]>在该疾病的过程中,COPD气道中性粒细胞,巨噬细胞和T细胞(特别是CD8 +)通过粘附分子,如细胞间粘附分子1或CXC趋化因子的上调渗透受体32,3。然而,参与招聘的白细胞,中性粒细胞特别是,在COPD患者的支气管的持久性的途径仍有待确定。此外,有在存在于气道COPD白细胞表型相对于支气管组织中疾病的严重程度和微定位差异4。
除炎性改变,慢性阻塞性肺病气道也经历了结构重构五。这包括:1)增加的数目和粘液腺泡在粘膜下腺大小;2)增生和表面粘液分泌-在大和小气道,分别杯状细胞化生;和3)鳞状上皮化生五。导致上述变化的机制是未知的。此外,慢性阻塞性肺病患者的支气管上皮功能受到影响,细胞因子/趋化因子表达上调6,如白细胞介素(IL)-8或巨噬细胞炎性蛋白1α和-1β,和下调的蛋白质,如多聚免疫球蛋白(Ig)的受体7,中性粒细胞酶可能是以下降解8。
半乳凝素是参与肺生理半乳糖结合蛋白9-12。半乳凝素3可以通过与整联蛋白受体的竞争为层粘连蛋白的细胞外基质的结合限制到基底膜的粘附增强呼吸道上皮细胞的增殖13。galectin -1和-3也参与细胞凋亡调控通过结合到细胞表面或细胞质的配体,如纤连蛋白受体的聚糖,CD7或细胞内蛋白质,如B细胞白血病/淋巴瘤2基因产物10,14。galectin-3表达的核和/或细胞质模式可能在恶性转化过程中发挥作用,这在乳腺癌中得到了证实15。此外,galectin-3已知有:1)触发中性粒细胞和巨噬细胞释放氧代谢物和弹性蛋白酶;2)增强巨噬细胞的吞噬作用;3)刺激自然杀伤细胞活性和IL-1的产生14,16。它也代表一个粘附分子独立选择素和β2-链球菌肺炎时肺中性粒细胞聚集的基础整合素17,18。与此相反,半乳凝素-1抑制肿瘤坏死因子α的产生由单核细胞/巨噬细胞14,说明galectin-1和-3对细胞凋亡/增殖和吞噬细胞活化的作用是平衡的、相反的。值得注意的是,这两种凝集素在肺中大量表达11,18。
半乳糖凝集素-3的作用已经在肺癌和哮喘进行评估,而其在COPD的作用仍是未知。因此,半乳凝素-1的表达和-3在大和小呼吸道的支气管上皮通过免疫组织化学评估来自八个重度COPD患者接受肺移植。肺组织九个非吸烟者和六个吸烟无COPD患者作为对照。半乳凝素表达的研究结果均与气流受限,上皮细胞增殖(Ki-67的表达)和嗜中性粒细胞,在上皮和粘膜固有层的巨噬细胞和T细胞的组织积累的临床参数,在大型和小型的气道。
材料和方法
耐心
COPD患者从一个人口正在接受肺移植招募,如前面所描述的其他地方7。八名极重度COPD患者归类为第四阶段,根据慢性阻塞性肺疾病分类的全球倡议1,都包括在内。平均年龄为52岁(42-60岁)。慢性阻塞性肺病患者均为戒烟者,有慢性支气管炎症状,除1例外均采用吸入皮质类固醇治疗。对照组包括6名年龄为60岁(42-74岁)的患者,他们是从没有慢性阻塞性肺病的吸烟者和9名正在接受肺手术的非吸烟者(平均年龄62岁)中招募的。所有患者在手术时临床表现稳定,无肺部感染的证据。肺功能检查37±26(均数±26)SD手术前)天。For each patient, random tissue blocks (three to 11 per patient) were sampled in central and peripheral areas from each lobe of one or both lungs (single or bipulmonary transplantation), fixed under constant inflation pressure (30 cmH2O)在4%甲醛和用于免疫组织化学处理。患者特征are presented in table 1⇓。
免疫组化
组织切片加工的半乳糖凝集素免疫染色。内源性过氧化物酶活性通过在温育0.03%抑制v/vH2Ø2用正常马血清和avidin/biotin阻断试剂盒(Dako, Glostrup,丹麦)阻断切片。切片用1:100兔多克隆抗人galectin-1或-3抗体处理30min, ELISA和Western blotting严格检测其特异性12,19,20。控制切片用正常兔血清(100 1)温育。生物素化的马抗兔IgG(1:100)用作第二抗体和切片与抗生物素蛋白温育 - 生物素 - 辣根过氧化物酶(Vectorstain的ABC标准套件; DAKO)。3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐和0.03%H后的启示2Ø2,切片用甲苯胺蓝染。
使用特异性抗体以嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(嗜中性粒细胞),CD68(单核细胞/巨噬细胞)和CD3(T淋巴细胞)检测白细胞。For macrophages and T-cells, antigen retrieval was performed using microwave treatment (five cycles of 3 min, 350 Watts) in 0.01 M citrate buffer, pH 5.7. Endogenous peroxidase activity was inhibited by incubation in 0.03% H2Ø2和切片用1%牛血清白蛋白。然后将切片与小鼠培养单克隆抗体中性白细胞弹性蛋白酶(mIgG1κ,克隆NP57; DAKO)或CD68(mIgG3κ,克隆PG-M1; DAKO)或用多克隆兔抗体CD3(DAKO)。控制部进行处理,与正常兔血清或小鼠IgG同种型为宜。第二抗体生物素化山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(DAKO)。将反应物温育与链霉抗过氧化物酶缀合物扩增,并使用二氨基联苯胺和H透露2Ø2。切片用梅耶的血块进行染色,并在Eukitt medium(维尔,鲁汶,比利时)上安装coverslips。
Ki-67抗原染色进行了使用MIB-1单克隆抗体(Dako公司)和抗小鼠检测方法如前所述。
免疫组化的计算机辅助定量
按照同样的方法进行免疫染色的量化以前发表7。半乳凝素和Ki-67染色进行了研究在保存完好的支气管上皮的10个随机选择的区域,在不脱离基底膜脱离由基底和柱状细胞的存在所定义,在每个段(三至11%受试者),在这两个大和小气道。白细胞浸润在上皮的10米随机选择的区域,10个区域固有层和在每个部分粘膜下腺的10个区域进行了评价。Large airways were defined as cartilaginous bronchi with submucosal glands and small airways as membranous bronchioles, without cartilage or glands and with an internal diameter <2 mm, as previously described elsewhere21。两到每滑动九个不同的气道和共10至21大的气道和每个受试者9至28小气道进行了评价。共有30个,34和45的组织切片中的非吸烟者,吸烟者和COPD组分别进行了分析,。
在选定的区域染色的计算机辅助定量使用配备有彩色摄像机和光学显微镜(Olympus BX 50;奥林巴斯。光学有限公司,日本东京)一个SAMBA 2005系统(阿尔卡特TITN,法国格勒诺布尔)使用的400的最终放大倍数×。结果表示为平均光密度(以任意单位测量),表示在所考虑的区域染色的平均强度,并作为标记指数(如百分之测量),表示相对于总面积的表面染色的百分比选择,因此,反映了阳性细胞的相对数量。
统计方法
在从每个患者的不同部分中的染色指数进行统计分析。进行两种类型的比较。首先,平均值计算从组之间的不同部分得到的染色指数和比较每个患者(COPD与对照)使用Mann-Whitney U-检验进行。其次,组内比较是对成对数据进行(大与小气道)中相同的部分(其中,大的和小的气道存在获得)使用Wilcoxon匹配-对测试。的相关性,使用非参数Kendall检验或Spearman的方法适当地进行测试。p值<0.05被认为是统计学显著。结果以中位数和范围。
结果
galectin-1和-3在COPD和正常对照组气道中的表达
Galectin-1 expression was detected in the bronchial epithelium from control and COPD patients (fig. 1a⇓),以及固有层,特别是内皮细胞(数据未显示)。在支气管上皮细胞中观察到Galectin-3免疫染色,特别是在纤毛细胞和浆液腺细胞的细胞质中(图1b)⇓), whereas staining was also observed in macrophages (fig. 1b⇓)。
a) Galectin-1和b) galectin-3在慢性阻塞性肺疾病患者的小气道染色和c)正常兔血清对照染色。箭头表示肺泡巨噬细胞中galectin-3的表达。
While no change in galectin expression was observed in the large airways, the bronchial epithelium of smokers exhibited increased galectin-1 expression in the small airways, as compared with nonsmokers (approximate three-fold increase; p<0.001; fig. 2⇓)。在COPD中,galectin-1的表达也有增加的趋势(p = 0.06,与不吸烟者相比),但比吸烟者要低得多(图2)⇓)。
![图2-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/5/914/F2.medium.gif)
染色半乳凝素1和-3表达的指数在支气管上皮。的上皮表达)半乳凝素-1和b)半乳凝素3中的大,小气道从慢性阻塞性肺病(COPD)患者与非吸烟者(Nonsm)和吸烟者(SM)中示出了平均光密度(MOD)的条款。水平条代表中位数。AU:任意单位。**:P <0.01;#:p = 0.06 (Mann–Whitney U-test).
In contrast, expression of galectin-3 in the small airway epithelium, which tended to increase in smokers (p = 0.06), was strongly increased in COPD (approximate two-fold increase; p<0.001; fig. 2⇑)。
在COPD和对照组中表达Ki-67的上皮细胞
Numbers of Ki-67 expressing epithelial cells were significantly increased in small airways of patients with severe COPD, as compared with smokers (p = 0.05; fig. 3⇓)。COPD大气道Ki-67染色未见明显变化(数据未显示)。
![图3-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/5/914/F3.medium.gif)
上皮细胞增殖(Ki-67的染色)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)和对照患者的支气管粘膜。相对数量Ki-67的表达上皮细胞(由标记指数(LI)表示)示于小气道的重度COPD患者,非吸烟者(Nonsm)和吸烟者(Sm)等。水平条代表中位数。#:p = 0.05 (Mann–Whitney U-test).
嗜中性粒细胞,巨噬细胞和COPD气道的T细胞浸润
与对照组相比,重度慢性阻塞性肺病患者中性粒细胞数量显著增加(p<0.001;表2⇓)。When compared with smokers, neutrophils were elevated in submucosal glands and in small, but not large, airways (table 2⇓)。因此,与非吸烟者相比,吸烟者的大气道上皮内中性粒细胞数量有增加的趋势(表2)⇓)。
CD68+单核/巨噬细胞也可在COPD气道中偶尔聚集成病灶(数据未见),而染色值与对照组大体重叠(表2)⇑)。然而,与不吸烟者相比,吸烟者和COPD患者的小气道中巨噬细胞的相对数量显著增加(表2)⇑)。
Lymphoid foci were observed around COPD airways (data not shown), with increased T-cell numbers in the epithelium and lamina propria of small airways, as compared with smokers (p = 0.003 and p<0.001, respectively; table 2⇑)。
半乳糖凝集素,上皮增生,气道炎症和肺功能之间的关系
在小气道上皮半乳凝素-3的表达没有在与上皮细胞增殖或中性粒细胞浸润COPD相关。In the small airways, Ki-67+ cell numbers correlated with neutrophils (p = 0.03, r = 0.76; fig. 4⇓)。此外,上皮内中性粒细胞与气流阻塞相关,通过一秒钟用力呼气量评估(FEV)1)/forced vital capacity ratio (p = 0.001, K = -0.93) and subepithelial monocyte/macrophages correlated with FEV1(图5⇓)。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者小气道中a)中性粒细胞(棕色染色细胞)与b) Ki-67+上皮细胞(棕色染色细胞)的关系。c)代表同型的(老鼠免疫球蛋白G1κ)控制。d)根据Spearman方法,中性粒细胞对重度COPD患者小气道Ki-67+增殖上皮细胞的影响。李:标签索引。p = 0.03, r = 0.76。
在严重的慢性阻塞性肺疾病的患者的小气道中性粒细胞,巨噬细胞和肺功能之间的关系。气道阻塞(功能参数用力呼气量一秒(FEV1)和FEV1/forced vital capacity (FVC) ratio) plotted against a) intra-epithelial neutrophils (p = 0.001, k = -0.93) and b) subepithelial macrophages (p = 0.03, k = -0.73) expressed as mean optical density (MOD) values. % pred: % predicted; au: arbitrary units. K (Kendall's tau) and p-values were calculated according to the Kendall test.
讨论
半乳糖凝集素都在显着肺发育和炎症反应分泌参与中性粒细胞募集和细胞凋亡/增殖,调节凝集素10-14。本研究首次显示galectin-3在重度COPD患者小气道上皮表达增加。相反,未患COPD的吸烟者在小气道中galectin-1升高。通过评估包含不同气道代的大量组织标本(全肺和手术标本),这可能提高了检测组间差异的能力22中,还表明,在严重的嗜中性粒细胞COPD优选是微定位于小气道上皮,在那里它们与增加的上皮细胞增殖和气流阻塞相关。
它已经显示,半乳糖凝集素1的表达的确定在皮质类固醇治疗鼻息肉诱导,这可能会限制组织嗜酸性粒细胞23。降低半乳凝素-1和半乳凝素增加-3表达与在幼年特发性关节炎滑膜单核细胞的凋亡缺陷相关联24。最近的一项研究表明,galectin-3是心脏成纤维细胞的有丝分裂源,诱导胶原沉积,并可能导致心室功能障碍25。在非小细胞肺癌中,肺上皮细胞的galectin-3表达增加26,27,而在小鼠哮喘模型中,基因疗法靶向半乳凝素3抑制变应原引起的呼吸道炎症,包括IL-5表达和上皮粘膜化生28-三十。半乳凝素-3的分泌也上调在辐射诱导的肺纤维化的大鼠模型中31,32。
在半乳凝素的表达在本研究中观察到的变化可能相关的COPD发病机理,如半乳凝素控制上皮细胞和炎症细胞的细胞凋亡,以及嗜中性粒细胞和巨噬细胞活化。因此,半乳凝素3参与嗜中性粒细胞的募集,并触发其氧自由基和弹性蛋白酶的释放14,它们被认为是介导吸烟引起的肺损伤的物质33。然而,目前的研究主要集中在呼吸道而不是肺实质,在增加肺泡上皮细胞和内皮细胞的凋亡率可能背后肺气肿的发展34包括在终末期COPD35,36。在小气道半乳凝素-1和-3之间改变的半乳凝素的平衡可能有利于在COPD中观察到的支气管上皮的增生。增殖的数量增加(表达Ki-67的)的上皮细胞在COPD小气道中观察到,如先前在大支气管的鳞状化生领域报道37。之前也观察到重度COPD患者肺泡壁Ki-67表达升高38,而它在另一项研究中保持不变,从控制36。有趣的是,在本研究中的Ki-67 +在小气道上皮细胞数量与嗜中性白细胞相关,提示炎症和组织重塑之间的链接。因此,增加的Ki-67以下过敏原攻击+上皮细胞在哮喘相关的气道嗜酸粒细胞增多39。可替代地,这些相关性可能是由于表达Ki-67抗原上皮内炎性细胞的存在。虽然这种可能性不能排除,Ki-67的染色不能与中性粒细胞浸润上皮通过慢性阻塞性肺病连续切片的Ki-67和中性粒细胞染色检查(数据未显示)。
无COPD显示吸烟者在小气道的支气管上皮并联增加半乳糖凝集素1的表达以在半乳凝素3增加的趋势,这表明半乳凝素-1和-3之间的平衡受损利于气道炎症和重塑是仅在易于观察吸烟者谁开发慢性阻塞性肺病。我们很容易推测,在不敏感的烟民半乳糖凝集素-1可能有助于炎症和增殖反应抑制信号。然而,本研究没有被设计来解决这些变化的机制,这可能涉及到COPD支气管上皮的固有变化,或与严重的疾病有关的非特异性因素,如缺氧40。此外COPD治疗的推定作用不能被排除,但似乎不太可能吸入激素治疗可占半乳糖凝集素表达的观察到的变化23。
本研究中没有记录在重度COPD患者上皮半乳凝素3表达和中性粒细胞聚集之间的相关性。正如先前证明41-45时,观察到重度COPD患者的气道的中性粒细胞浸润。本作者表明,在严重的COPD患者的中性粒细胞在粘膜下腺和小气道,在轻度阶段COPD对比度的后一特征特别是局部46-48。吸烟者的特点是嗜中性粒细胞浸润近支气管,特别是在上皮内。正如之前在其他地方报道的那样43,45,巨噬细胞数目在很大程度上重叠那些在吸烟者观察到,尽管在本研究中小气道中观察到增加的趋势。
关于T细胞,在大气道中观察到组间无显着差异。这是轻度至中度慢性阻塞性肺病显示增加皮下CD3以往的研究对比42,44,45和CD8细胞44,45在较大气道。相反,在由斯蒂法诺在重度COPD患者的一项研究等。49,CD3和CD8细胞数目减少,并与气流限制的程度呈负相关,这表明香烟烟雾诱导的支气管发炎被下调随着病情的发展。另外,重度COPD可能代表COPD患者的特定亚群具有独特的免疫表型。然而,本研究结果证实,T细胞浸润重度COPD患者的小气道,如在COPD肺实质观察50和周围肺血管51,这一事实是一致与重度COPD患者先前的研究52并已被轻度慢性阻塞性肺病病例先前报道48。此外,与不吸烟者相比,t细胞数量的减少是无COPD吸烟者的特征。正如前面建议45,这一观察结果可能与选择低CD3细胞计数的吸烟者亚群有关,这些人对香烟烟雾的影响更有抵抗力。
在慢性阻塞性肺病中,最近报道了中性粒细胞对平滑肌的微定位53与CXC趋化因子的局部表达有关54。类似地,在哮喘支气管周围平滑肌内的肥大细胞的定位55已经与CXCL10的由平滑肌细胞释放相关联56。本研究表明,与上皮下相比,严重慢性阻塞性肺病中嗜中性粒细胞的微定位与气道阻塞相关。除了本研究报道的galectin-3的产生外,支气管上皮细胞还可以表达CXC趋化因子和粘附分子,这些趋化因子和粘附分子可能促进中性粒细胞向气道上皮的转运。相反,中性粒细胞衍生的产物,如弹性蛋白酶,可在COPD中促进局部活化的上皮细胞,并触发转录程序,导致促炎介质的上皮表达。本研究作者观察到移行上皮下巨噬细胞也与气流受限相关,提示慢性阻塞性肺病炎症细胞在不同气道微室中具有不同的功能57。
虽然患者数量较少限制的结论,本研究提供的中重度COPD患者的支气管上皮发生重要的变化进一步证明。半乳凝素上调-3表达,通过不平衡半乳糖凝集素1,在谁已经开发重度COPD,在不COPD吸烟者对比度吸烟者谁往往显示相反的表达谱的小气道中观察到。虽然其他因素似乎参与,在半乳糖凝集素的表达变化可能有助于上皮增生和中性粒细胞聚集在COPD患者的气道。值得注意的是,半乳凝素-2在T细胞调节新兴介入和心肌梗塞亮点发病机制的肺疾病中的半乳凝素网络的进一步分析的重要性58-60。
目前的研究表明在第一次,在严重的慢性阻塞性肺疾病的小气道上皮中性粒细胞浸润的特定位点,与上皮细胞增殖和气流受限。该研究结果支持先前的研究61,其中提出在慢性阻塞性肺疾病的病理生理学的小传导气道中的重要作用。有人建议,对上皮慢性损伤是与半乳凝素增加-3表达和嗜中性粒细胞的该微定位到小的气道上皮易感吸烟者相关联是在严重的慢性阻塞性肺疾病的特定和功能相关的特征。
致谢
作者要感谢p Thurion(实验室的组织病理学,鲁汶大学Mont-Godinne,比利时)为他的优秀的技术援助和鲑鱼,c . Decaestecker和n D 'Haene(实验室的组织病理学,布鲁塞尔大学布鲁塞尔,比利时)帮忙统计分析和染色量化。作者也要感谢L. Wilcock(伦敦帝国理工学院,英国伦敦)对手稿的语言修订。
- 收到了2005年6月25日。
- 公认2007年1月3日。
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