抽象的
肺气肿是一个主要的健康问题,需要新的药物。动物疾病模型在其发展中是关键的,但目前用于评估药物疗效的工具的有效性和敏感性有限。研究了微计算机断层扫描(CT)作为在小鼠模型中评估肺气肿的创新工具的有用性。
序列CT扫描在Smad3敲除(KO)小鼠中以双每周间隔进行,其自发地发展空域扩大。在两维图像中量化肺密度,并与平均线性截距和肺顺应性相关。
Smad3 Ko肺的CT扫描显示出8周龄8周的肺部密度显着降低,并且相对于年龄匹配的野生型(WT)动物的14周龄进一步进展。通过两维方法可靠地评估肺气肿,但由于肺积量的标准化和可变性的标准化,三维方法是优越的。最大体积·CMH的肺血压依从性为0.053±0.005和0.034±0.002%2O−1,反映了明显的生理相关肺气肿。
在重建的三维图像中的小动物计算机断层摄影成像和密度量化是用于量化动物疾病模型中的肺气血变化的有用工具。它将重要信息添加到常规评估中。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺气肿被认为是主要的全球健康问题。慢性阻塞性肺病的典型特征是不可逆的气流阻塞,由小气道阻力升高和肺气肿和肺破坏导致的肺顺应性增加引起1,2.慢性阻塞性肺病的发病机制是由有害颗粒和气体对肺的反复和/或持续损伤,导致氧化应激和高蛋白酶活性的慢性炎症3.,4.没有完全理解从组织损伤到不可逆损伤的组织损伤的确切机制5,6.一个流行的肺气肿发展假说涉及蛋白酶/抗蛋白酶失衡,有利于肺中的“基质降解微环境”7.
动物模型极大地拓宽了对肺气肿发展的认识,并有助于确定新的治疗靶点8.肺气肿实验模型的最常见方法是弹性蛋白酶的肿瘤内滴注,这导致快速和渐进的肺气肿。香烟烟雾曝光也导致动物的肺气肿,但需要相对较长的时间来发展。存在许多基因改变的动物,例如小鼠缺烟,其缺乏转化生长因子(TGF)-β途径中积分信号分子,并发展肺泡空气的年龄相关的扩大9.
在Smad3敲除(KO)小鼠中,没有肺气肿的大疱,空气扩张缓慢且相对均匀(图1)⇓),虽然在吸烟模型中是俗气的,但在弹性蛋白酶模型中甚至更为舒适。由于可行性,药物功效实验最常在弹性蛋白酶型模型中进行8.为此,肺气肿通常通过形态测定法来评估,例如测量平均线性截距(MLI),或通过量化基质基因表达和蛋白浓度。这种方法似乎相当简单和快速,如果应用得当,可以提供原则证明。然而,形态测量技术的使用并不总是正确的,而且可能被误解。菲润巴赫10.最近审查了文献,并指出,许多动物模型的仔细检查显示,令人惊讶的是,令人惊讶的是,令人惊讶的是,令人惊讶地证明了肺气肿定义的严格标准。此外,调查结果对人类疾病的适用性需要几十年来发展,仍然有问题。目前的评估工具不能重复遵循单一的动物,并且可以展示与实际肺部结构或功能无关的固定和通货膨胀的艺术品。
Smad3零小鼠,空域扩大模型。Smad3敲除(KO)小鼠随着年龄的增长而自发地发展肺气肿。代表性组织学图片a)a)ko和b)14周龄的野生型鼠标。秤杆=100μm。
肺气肿中肺泡的逐渐破坏导致气体交换表面的损失导致肺实质密度降低。这种结构变化可以通过计算机断层扫描(CT)X射线扫描仪在人体中量化11.,12..虽然肺功能检查是慢性阻塞性肺病和肺气肿的常规诊断和临床治疗方法,但它们也有缺点13.,14..CT成像可以提供今天人类肺气肿的有用信息,甚至可能优于功能评估12..定量CT在评估人类患者肺实质的微小变化方面似乎更有价值,并可能使疾病进展的可视化或由于干预而产生的变化的量化15.,16..微型CT可能在评估疾病的动物模型中的催育变化方面具有类似的潜力。
在本研究中,微型CT扫描被验证为评估肺气肿动物模型中疾病进展的新方法。结果表明,微型CT在Smad3 KO小鼠中与两个维度和肺功能的两个MLI相关联17.,18..该研究是第一个验证在逐行空域扩大的小鼠模型中的两维微CT成像。
方法
动物保健
所有小鼠都按照加拿大动物保护委员会的指导方针进行治疗。所有动物手术均在异氟烷(MTC Pharmaceuticals, Cambridge, ON, Canada)或Avertin (Aldrich Chemical Co, Milwaukee, WI, USA)吸入麻醉下进行,无补充氧。在背景为129SV/EV×C57BL/6的小鼠中,Smad3基因的第8外显子被破坏18..小鼠在特定的无病原体的房间中繁殖。
组织学
组织学检查时,气管内灌注10%中性缓冲福尔马林,恒压20 cmH,充气固定肺2o 5分钟。在固定10%缓冲福尔马林24小时后,肺部是石蜡嵌入,切成3μm的切片并用血红素和曙红染色。
CT扫描
使用X-SPECT SPECT/CT (Gamma medical - ideas, Northridge, CA, USA)对异氟醚麻醉下自发呼吸的小鼠进行CT成像。x射线管设置为80 kVp, 220 μA。图像采集使用连续旋转,在1,024×1,024阵列(像素尺寸为0.10 mm)中获取512个投影测量值。采用Feldkamp锥束重建算法将图像重建成512×512×512阵列(0.1157 mm)3.体素),然后重新缩放以提供CT编号。采用TLD 100芯片(Harshaw-Thermo RMP, Solen, OH, USA)嵌入死鼠体内6个部位进行全身x射线剂量测定,并取暴露量平均值。芯片由Global dose Solution Inc. (Irvine, CA, USA)读取。扫描120秒后,小鼠全身平均暴露量为27 mGy。然后使用Amira®软件(Mercury Computer Systems, Chelmsford, MA, USA)分析重建的图像数据,量化肺组织密度。在每张图像中,在解剖肺部周围手工绘制三维体积。这些体积内的肺组织密度是通过使用18个宽度为50 Hounsfield Units (HU)的箱,在CT数字范围- 1000 - -100上构建直方图来确定的。CT值以某一组肺总容积百分比的平均值表示。
验证实验证明,本成像方法能够可靠地检测不同体积充气肺密度的变化。Naïve Balb/c小鼠(n = 5)分别在异氟烷麻醉下自主呼吸、气管开放死亡、气管阻塞死亡和肺充气500 μL和700 μL四种不同条件下进行成像。
二维形态学与二维CT密度相关性
从八只动物(四个KO和四种野生型(WT))中的静际组织学部分被突出地在选择空域扩大和正常肺组织的区域。通过在每个突出的区域的至少七个照片中的每个照片上计算10个随机放置的线路,手动进行MLI测量。在相同的选定区域中突出显示最近的二维横轴CT切片,并分析体素数和密度。符合密度-550- -450胡锦涛的体素被求和并分析相同的区域的MLI。选择这些密度,因为它们对应于正常(-450UU)和扩大的空腹(-550UU)。
压力量环测定
使用定量机械呼吸器(Flexivent; Scireq Scientific呼吸设备,蒙特利尔,QC,加拿大)进行所有压力体积环。为了避免异氟烷可能的支气管扩张作用,在240 mg·kg的Avertin(Aldrich Chemical Co.)用Avertin(Aldrich Chemical Co.)麻醉动物−1i.p。与潘丘氨铵(Sandoz Canada Inc.,Boucherville,QC,Canada)瘫痪,并瘫痪)0.03 mg·kg−1注射.然后插入肿瘤内管,并将动物放置在机械通气上。正端呼气的压力在2cmH下恒定2O.
统计分析
数据以平均值±表示扫描电镜或者意味着±SD..为了评估Smad3 KO和WT组值的差异,使用了未配对t检验。在充气小鼠CT验证过程中,使用方差分析(f检验)来评估单个分析仪之间的变异性。值p<0.05被认为是显著的。采用线性回归对两个变量集进行比较。
结果
Smad3 KO气肿进展
目前的作者先前描述了Smad3小鼠随着年龄的增长而自发获得领空扩大的进展9.图1⇑说明了14周龄前KO动物的空域扩大程度,而WT动物基本没有变化。KO动物的MLI在8周龄时显著增大,在14周龄时进一步增加。
二维形态测量与CT密度相关
具有和不具有空位扩大的动物的组织形态学与来自并发CT扫描的相同的二维切片相关。拍摄和分析具有明显肺气肿和正常的肺部实质的地区,并分析MLI(图2A-L⇓).由于这些选定的体素显示与MLI数据的相关性,分析了二维横向切片中的相同区域。图2⇓例如,示出该区域A1具有比区域B1更高的空隙扩大和更低的CT密度。此外,CT扫描中所见的增加的低密度与组织学中所见的空体扩大的严重程度相关。在二维CT切片中具有正常和低密度的区域之间存在显着的相关性,以及组织学中的正常和蓄水区的位置。包含可见空域放大的区域,组织学中与〜-550胡及以下的扫描密度相关。图2M.⇓显示了CT图像中-550 - -450 HU求和的二维区域与16个相同区域的MLI之间的相关性(R2= 0.53)。
二维计算机断层扫描(CT)密度的组织形态相关性。比较二维CT切片中组织形态与低密度体素增加之间的空域扩大的相关性。组织学和相应的CT图像是一个代表性的Smad3敲除(KO;a-e, k)和一个野生型(WT;F-j, l)每个鼠标。A1(•)和A2(〇)对应KO;B1(▪)和B2(□)至WT。对空域扩大区域和正常区域的平均线性截距(MLI)进行组织学分析。在组织学上选择尽可能接近同一横轴切片的横轴二维切片。在二维CT切片中提取相同的区域并生成密度直方图。对密度为-550 - -450亨斯菲尔德单位(HU)的体素进行求和,因为只有这些密度与MLI相关。 Red represents -700– -600 HU, yellow -600– -550 HU and blue -550– -100 HU. Scale bars = 200 μm (a and f) and 100 μm (b, d, g and i). m) Correlation of summed two-dimensional CT slice voxel densities with two-dimensional morphometry. The number of areas analysed was 16 from eight animals (four KO (♦) and four WT (⋄)). All mice analysed were 14 weeks of age. Correlation of morphology to CT densities had R2 = 0.53.
三维CT密度分析
动物模型中肺气肿的常规研究依赖于肺部随机区域采取的平均曲线长度测量,然后平均。该分析通常在肺的单个部分上进行,从而缺少潜在的空体扩大区域。类似的限制可以适用于二维CT成像。相反,三维CT图像可用于实时找到小鼠肺的空间取向和密度。低密度体素的空间取向可能在受试者之间变化,但是低密度体素的量可以从三维图像平均,以在组之间找到显着性。含有-550-1,000胡源密度的体素被认为是代表顽固的变化,因为在WT动物的正常肺部没有看到这些密度。图3.⇓显示SMAD3 KO和WT小鼠已从6-14周龄苏打扫描。随着年龄的比例进展,可以可视化倾向于较小的组织。Smad3鼠标相当异质,有一些KO动物比其他KO动物显示更多的低密度组织。Smad3 KO小鼠并不在同一年龄的肺气肿进展,但通常,在性成熟(6-7周)的发作时观察到MLI和低密度体素的增加。以三维重建图像,以帮助随着时间的推移在KO动物的肺中可视化MLI的变化。图4.⇓显示来自一个代表性KO和一个WT小鼠的图像,其中低密度组织(-700-550胡),着色黄色,从6到14周增加。通过在整个Smad3 KO肺的空间扩大的均匀分布,支持二维颤轴切片与三维密度很好的发现。
![图3-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/30/6/1082/F3.medium.gif)
SMAD3淘汰赛(KO)和野生型(WT)小鼠空域增长的进展。在A)扫描时肺总量的平均百分比6周(n = 4ko,n = 6wt);b)10周(n = 8ko,n = 11 wt);和c)14周(n = 9ko,n = 15重量)。•:KO;○:wt。数据显示为平均值±扫描电镜.
![图4-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/30/6/1082/F4.medium.gif)
在6(a和d),10(b和e)和14(c和f)中,在代表性敲除(a-c)和野生型(d-f)小鼠中,显示肺密度的三维图像随着代表性敲除(a-c)和野生型(d-f)小鼠的时间 weeks. Yellow colour represents voxels with densities -700– -550 HU, blue represents voxels with densities -550– -100 HU.
二维和三维CT数据比较
过去,通过分析二维切片来确定组间的差异。放射科医生负责寻找最具代表性的全肺切片。为了确定Smad3 KO中所见的低密度组织的数量是否也存在于WT动物中,我们从每次CT扫描的顶部和底部提取二维切片。正如预期的那样,数据揭示了-700 - -550 HU范围内的低密度体素数量的差异。图5一个⇓显示具有密度-700- -550胡的整体二维切片的百分比。随着年龄的增长,KO二维切片体素的密度降低,并且在相对于WT年龄匹配的动物(P <0.01和P <0.05)的年龄10和14周内显着。平均而言,KO肺的密度在6周龄在6周龄(P <0.04)时在KO动物的14周内降低。将从二维切片提取到三维整肺的数据进行比较,两者之间发现了高相关(R.2= 0.94),说明该模型中两个平均二维切片的密度代表了整个扫描的密度。然而,尽管Smad3 KO小鼠的空域扩大模式相同,但三维数据的变异性(CV = 1.43)低于二维数据的变异性(CV = 1.24)。在三维分析中,与二维分析相比,KO肺低密度体素总和与对照组的差异具有更高的意义(p = 0.00007)与p = 0.0005)。可以预期,在有斑片状组织改变的模型中,变异性将显著增加(图5b)⇓和5C.⇓).
两维计算断层摄影密度的相关性。a)具有密度-700- -550胡氏菌的整个二维切片的平均百分比。每次扫描提取两片切片。顶部切片(▪:野生型(WT);▒:敲除(ko))始终在肺部顶部和底部切片下方32片(□:wt;░:ko)在底部上方32片肺部。b)具有密度-700--550胡的整个三维肺的平均百分比。□:WT;▒:ko。箱图显示为平均值±SD..c)两维密度数据的相关性。具有密度-700- -550uu(低密度)的总二维切片的百分比在肺的顶部和底部之间平均平均。将整个肺部的低密度的三维百分比与相同的扫描的二维切片平均值进行比较,而R2 = 0.94. At 6 weeks, four KO and six WT observations were made; at 10 weeks, eight KO and 11 WT; and at 14 weeks, nine KO and 15 WT. **: p<0.01 with respect to age-matched WT; ***: p<0.001 with respect to KO at age 6 weeks;#: 6周或8周KO p<0.04;¶:P <0.006相对于KO,6或8周。
肺密度分析验证
实验验证了本方法在检测肺密度变化方面的有效性。Naïve Balb/c小鼠(n = 5)分别在自主呼吸、气管开放死亡、气管阻塞死亡和肺充气500 μL和700 μL四种不同条件下进行成像。体重20 ~ 30 g的自主呼吸小鼠平均肺容积为619±63.4 μL,密度为-425 ~ -375 HU时最大体素计数。安乐死后,平均肺容量为352±20.2 μL,密度为-375 ~ -325 HU时最大体素计数。已知充气气量时,500 μL充气后CT计算肺体积变化量为485±47 μL, 700 μL充气后为748±27 μL(图6)⇓).请注意,通过过度充气的小鼠从未达到-950胡面积中的传统人类催眠CT密度。CT图像的定量分析由三种不同的分析仪独立进行。通过每个分析仪测定总肺体积并对每只小鼠进行平均。使用F-Test,没有足够的证据来得出结论,分析仪之间有98%置信区间的分析仪之间存在差异。在一只小鼠上进行一个额外的实验,该实验在八次不同时间成像以确定测量的可重复性。八个扫描中总肺体积的变异系数为7.7%。这些结果证实,从CT图像计算肺部体积对空气量,可重复的和具有高分析局可靠性的变化敏感。
![图6-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/30/6/1082/F6.medium.gif)
对计算机断层摄影密度的膨胀肺量验证。扫描的小鼠的总肺量的平均百分比(•,n = 5),死于开口气管(□,n = 5),死气管闭合,500μl(▴,n = 5)或700μl(○注射的空气n = 3。数据以平均值±表示SD..
生理相关性:压力量环
测量了压力-容积回路离体为了确定CT密度数据中看到的变化是否实际上代表了肺顺应性的生理差异。图7A⇓显示KO和WT动物的平均准静态压力量环。图7B.⇓结果显示,与野生型对照组相比,14周龄时Smad3 KO小鼠的依从性显著增加(p<0.007)。
![图7-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/30/6/1082/F7.medium.gif)
Smad3肺的生理特性。a) Smad3敲除的平均准静压-容积回路(KO;•)和野生型(WT;〇14周龄小鼠(n = 8 KO, n = 15 WT)。b) Smad3 KO小鼠与WT小鼠肺顺应性差异显著(p<0.007)。依从性是通过14周时平均压力-容量回路下端最后8个点的斜率来测量的。数据以平均值±表示扫描电镜.
讨论
肺气肿的动物模型在鉴定和评估本疾病中的新疗效干预方面是关键。目前在肺气肿模型中评估药物疗效的方法具有局限性,对人类疾病的可转移仍然是可疑的。本研究表明,代表使用CT成像作为在鼠标模型中使用两维定量分析随时间遵循鼠标模型中肺气肿进展的方法的数据。这种方法的优点是它是可靠的,快速和诊断的肺气肿的变化。此外,它具有各自动物的纵向随访的优点,并避免了与固定伪影和形态学相关的问题。
了解肺气肿发展的分子机制稳定地增加,动物疾病模型基本上辅助8.气管内注入有毒有害物质,如弹性蛋白酶或暴露于香烟烟雾,可引起肺气肿。同样,肺气肿在自然发生的突变小鼠株或基因改变的动物中自然发生。新的分子靶点已经确定,药物正在开发中,以干扰肺气肿的分子机制。由于时间和可行性的限制,通常采用弹性蛋白酶模型进行药物疗效实验8,提供早期终点和快速读数。目前通过组织形态学评估肺气肿,并且可靠的MLI或曲线长度的测定需要仔细和标准化的肺部充气。气道或胸膜表面上的任何泄漏都会导致测量不正确19..肺图像如图1所示⇑和2⇑在低放大率下被故意获得,以说明使用标准化充气压力的验证方法甚至用于制备组织载玻片的组织载玻片并不总是导致教科书中所示的理想图像。
本研究表明,肺气肿的动物模型中的CT成像不仅能够提供类似于组织形态学的可靠量化空间扩大,但与传统方法具有若干优点。非侵入性CT扫描不需要安乐死,并且可以根据需要在几个时间点进行。它也可以在单个动物中重复,以在药物疗效研究的情况下可视化动态疾病进展或可逆性。这不仅有助于解释用于接口变异性,而且还减少了研究所需的动物数量。
选择目前的技术由于其短图像采集时间以及它需要最低剂量的辐射来检测触发性进展。获取数据是SWIFT,每次扫描只需要2分钟。然后可以在另外2分钟内重建数据,并在另外5分钟内使用Amira®成像软件进一步分析三维评估。本作者确定了120-S扫描的辐射剂量为~27 mgy,比能够显着肺部损伤的值少50倍20..扫描的分辨率为115毫米3.虽然与最优质的微型CT分辨率相比,但与最优质的微型CT分辨率相比,虽然与最优质的微型CT分辨率相比,但在没有肺气肿的动物之间显示出显着和有意义的差异。值得注意的是,本研究中的动物在全身麻醉下,但自发性呼吸,因此每只动物在靠近其功能残留能力的体积上分析,这可能在组之间发生变化,基于所观察到的压力差异 -卷环。是否选择通风动物,已经引入了根据呼吸机频率改变肺部体积的问题21..目前作者将这些测量考虑为SMAD3 KO小鼠功能性肺气肿的证据。对于组织学分析,小鼠肺部膨胀至20 cmh2O和福尔马林固定。在分析空气空间扩大的证据之前,这是一种将所有肺的压力-体积关系标准化到一个固定点的方法。鉴于在功能和组织学评估时肺容量存在明显差异,因此在这些情况下就空气空间大小进行直接比较是不合适的。使用这些独立的方法,我们发现Smad3 KO小鼠随着时间的推移会出现空域扩大,并且在个体小鼠的随访研究中发现,这些肺气肿样的变化与二维形态测量显著相关。目前的作者进一步表明,通过三维图像密度的降低来评估肺实质的损失与肺顺应性的增加有关,这加强了成像技术作为评估肺气肿动物模型有意义的结果的有效性。
为什么三维方法?
最常见的肺气肿是与吸烟有关的,由扩大的晚期细支气管发展成小叶中心型。肺尖通常比肺基部受累多。全腺性肺气肿通常与α有关1-抗胰蛋白酶缺乏症,在碱基中更多的存在,而且总体上比前者的斑片状分布更均匀1.来自较早的研究数据表明,这些类型中的一种肺气肿通常在晚期疾病中占优势22.,强调肺气肿以异质的方式发展,并且单个时间点在单个时间点处的单片组织形态学可能不足以获得可靠的数据。此外,众所周知,只有约~15%的吸烟者在临床上发育症状COPD,而40%表现出肺气肿的迹象23.,暗示了一个长期的肺气肿课程。动物疾病模型中的肺气肿可以从厘米的类似斑驳的模式中进展,取决于实验中使用的动物的起始剂和物种24..迄今为止,在肺气肿动物模型中,大多数与成像相关的问题都依赖于二维CT切片。斑块型的肺气肿可能在组织形态学或二维成像中消失,但在三维成像时不会消失25..本文所述的SMAD3 KO模型似乎在肺的中心区域具有稍微更多的空隙扩大,但密度的降低相当均匀地存在于肺的顶部和底部。虽然在本研究中显着相关的两维图像分析,但与三维方法相比,通过二维切片分析评估的肺密度仍然存在较高的可变性。可以预期,在具有斑驳肺气肿的模型中,二维数据的可变性将显着更高,例如弹性蛋白酶型型号,其常用于药物功效实验。此外,涉及三维结构切片的任何技术可能意味着在寻找最代表性的切片的尝试期间研究员的部分偏差。最后,将三个但不是两维基于基于肺密度分析的肺部体积。空气诱捕,肺部的动态恶性血液,而不是结构性气雾剂将显示为在二维图像中具有低密度的区域,因此标记为肺气肿,而在三维图像分析中,它将与肺有关体积,不被视为肺气肿。另外,三维图像分析与适当软件的可用性大致比二维更快。所有这一切都使得CT图像的三维重建和肺密度的量化是似乎比传统的二维评估更有效的强大工具。
结论
已经证明,重建的三维图像中的计算机断层摄影成像和密度量化是用于量化动物疾病模型中的肺气肿的变化的有用工具。它至少与常规组织形态学一样可靠,但具有可以随时间遵循各个动物的优点。该方法快速,易于执行和成本效率。目前的作者认为,这种评估工具在肺气肿研究中的药物疗效实验中将极为宝贵。
致谢
作者感谢R. Ellis、C. Lavery、T. Rahman、C. Saab、J. Wattie和D. Boreham提供的专家技术援助进行了辐射剂量测定(汉密尔顿,ON,加拿大)。
- 收到了2007年1月2日。
- 接受2007年8月15日。
- ©ers Journals Ltd