抽象的GydF4y2Ba
莫拉克斯氏菌属复活GydF4y2Ba是慢性阻塞性肺病传染性恶化的主要原因。在肺上皮细胞中,GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba诱导促炎细胞因子白细胞介素(IL)-8的释放,白细胞介素-8在协调气道炎症中起关键作用。GydF4y2Ba
本研究表明,蛋白激酶(PK)C被莫拉菌感染激活并正调控GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba-触发核因子(NF)-κB活化和随后的IL-8释放。PKC/NF-κB信号通路的激活依赖于莫拉菌特异的普遍表面蛋白A2的表达。此外,PKC的特异性异构体在基因的微调中发挥着不同的作用GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba通过控制诱导NF-κB依赖性基因表达GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba启动子活动。抑制PKCα和ε与化学抑制剂或使用短暂干扰RNA介导的基因沉默显着抑制,而PKC的抑制作用GydF4y2BaθGydF4y2Ba增加,GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba- 诱导的IL-8转录和细胞因子释放。GydF4y2Ba
综上所述,结果表明GydF4y2Ba莫拉克斯氏菌属复活GydF4y2Ba感染激活蛋白激酶C及其亚型α,柱一和柱一GydF4y2BaθGydF4y2Ba,差异调节人肺上皮细胞中的白细胞介素-8转录。GydF4y2Ba
慢性阻塞性肺病(COPD)是全世界发病率和死亡率的最常见原因之一GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba. 在COPD患者中,GydF4y2Ba莫拉克斯氏菌属复活GydF4y2Ba继续出现作为领先的人类粘膜病原体GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba.这种革兰氏阴性铅球菌将低至32%的成年人的呼吸道结合,与复发性和持续的低呼吸道感染有关,导致所有COPD加剧的〜10%GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba.在目前已确定的各种推定的致病因素中,有几种蛋白抗原已被证明从外膜突出GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba,包括普遍存在的表面蛋白(Usp)A1和UspA2蛋白,它们在大多数临床分离株中都有表达GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba突变分析表明UspA1与上皮细胞的粘附有关,而UspA2对血清耐药性至关重要GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba. 然而,对于这些蛋白在肺上皮细胞炎症免疫反应中的作用知之甚少。慢性阻塞性肺病的炎症特征是嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润气道增多GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba. 此外,当暴露于病原体或炎症介质刺激时,支气管上皮也通过分泌生物活性物质直接参与免疫反应GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba.其中,CXC趋化因子家族的Inter kin(IL)-8在调节中性粒细胞和单核细胞趋化性朝向感染部位以及诱导气道炎症方面发挥枢转作用。GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10GydF4y2Ba.微生物的存在,如GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba在COPD患者的下呼吸道中发现IL-8在COPD患者的支气管肺泡灌洗中释放增加,与疾病进展有关GydF4y2Ba11GydF4y2Ba–GydF4y2Ba13GydF4y2Ba.IL-8的转录调节由严格的调节信号网络控制,最重要的是涉及核因子(NF)-κB。NF-κB包含一系列rel蛋白质,其通常通过与NF-κB抑制剂(IκB)结合来保留在细胞质中GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba14GydF4y2Ba.在细胞活化后,IκBα磷酸化导致其泛素化和蛋白水解,导致核易位并结合到IL-8 κ b结合位点GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba启动子GydF4y2Ba14GydF4y2Ba.随后,RNA聚合酶II与启动子的结合决定了IL-8基因转录的开始GydF4y2Ba15GydF4y2Ba,GydF4y2Ba16GydF4y2Ba.最近,目前的作者证明了这一点GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba- 肺部上皮细胞引起的NF-κB活化导致IL-8释放GydF4y2Ba17GydF4y2Ba.然而,具有相当大的数据来表明微调NF-κB依赖性细胞因子转录需要许多额外的信号转导途径GydF4y2Ba18GydF4y2Ba.蛋白激酶(PK)C最近被认为与IL-1β或肿瘤坏死因子(TNF)-α控制IL-8释放有关GydF4y2Ba19GydF4y2Ba,GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba. PKC家族成员是丝氨酸/苏氨酸激酶,在细胞内信号转导中发挥普遍作用GydF4y2Ba18GydF4y2Ba.PKCs由12个密切相关的同工酶组成,根据其结构域和对Ca的响应能力可分为3个亚家族GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba和二酰基甘油(DAG)。经典PKC同种型(α,βi,βII和γ)需要钙,DAG和磷脂酰丝氨酸进行活化。新型PKC同种型,包括PKCδ,ε和θ,需要DAG和磷脂酰丝网。非典型PKC同种型(ζ,1和λ)和PKCμ仅需要磷脂酰丝氨酸,与常规和新的PKC相比,不响应博士酯GydF4y2Ba21GydF4y2Ba.经典PKCs, PKCα和PKCβ,新型PKCs, PKCδ, pkc ε和PKCθ,以及非典型PKCζ已被证明在肺上皮中表达GydF4y2Ba22GydF4y2Ba–GydF4y2Ba24GydF4y2Ba.单独的PKC同工酶被各种刺激激活,并且涉及在某些情况下发挥明显,在某些情况下,在细胞内信号的转导中的作用,通常在疾病状态下过表达GydF4y2Ba19GydF4y2Ba.然而,PKC及其亚型在调控上皮NF-κB活化和IL-8表达中的作用GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba尚未调查感染。因此,本作研究研究了Moraxella USPA1和USPA2和不同的PKC同种型在肺上皮细胞中的累积GydF4y2BaM. catarrhalis-GydF4y2Ba诱导引发生产。目前的数据表明,莫拉菌UspA2的表达在激活PKC/NF-κB信号通路导致IL-8释放方面非常重要。此外,还发现PKC亚型PKCα、PKC ε和PKCθ参与GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba-诱导的IL-8的释放GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba启动子。GydF4y2Ba
材料和方法GydF4y2Ba
细菌菌株GydF4y2Ba
这个GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba菌株25238(血清型A)购自美国型培养物(ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba野生型株O35E(血清型A)和UspA1-和uspa2 -缺陷突变株O35E。1和O35E。2.were kindly provided by E. Hansen (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA). Antimicrobial supplementation for the复活的GydF4y2Ba变异O35E。1和O35E。2.involved kanamycin (15 μg·mL−1.GydF4y2Ba).GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba在37°C的脑心输注(BHI)琼脂(DIBCO实验室,BD,Heidelberg,德国)在37°C上生长过,补充有5%加热的绵羊血液,如前所述GydF4y2Ba17GydF4y2Ba,GydF4y2Ba25GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26GydF4y2Ba.在感染实验中,将过夜培养的单个菌落在BHI肉汤中重新悬浮,并在37℃下孵育2-3小时至中对数相(405 nm 0.4-0.6)。随后,通过离心收获细菌,重悬于不含抗生素的细胞培养基中,并调整光密度(OD)为0.3(等效1×10)GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba菌落(cfu)·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),并以指定剂量感染上皮细胞。细胞被感染GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba剂量0.1-10 cfu·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba.调查灭活GydF4y2BaM. catarrhalis,GydF4y2Ba将菌悬液加热(95℃,30 min),在BHI琼脂上孵育12 h排除菌悬液的活性。GydF4y2Ba
细胞系GydF4y2Ba
在正常人类志愿者的支气管镜下,通过支气管内涂刷获得人原发性支气管上皮细胞(PBECs)。该研究得到了当地伦理委员会的批准(Charité - Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany)。将PBECs置于含有人表皮生长因子(0.5 ng·mL)的支气管上皮细胞基础培养基中GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),胰岛素(5μg·mlGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)、转铁蛋白(10 μg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)、肾上腺素(0.5 μg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)、三碘甲状腺原氨酸(6.5 ng·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),庆大霉素(50 μg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),两性霉素B(50 ng·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),牛垂体提取物(52μg·mlGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)、维甲酸(0.1 ng·mL .GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)并培养涂有人胶原蛋白(vitregen 100;凝聚力技术,Palo Alto,CA,USA)的组织培养板上。所有实验均用通道2中的细胞进行。支气管上皮细胞系BEA-2B是来自C. Harris(美国国家卫生学院,贝塞斯达,MD,美国MD的国家研究院)。BEA-2B细胞在克拉汀细胞-SFM(GIBCO BRL Life Technologies,Paisley,UK)中繁殖,补充有2毫米GydF4y2BaLGydF4y2Ba-谷氨酰胺,青霉素(100 U·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)和链霉素(100μg·mlGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),如前所述GydF4y2Ba17GydF4y2Ba.这些细胞在第10-35代之间使用。从ATCC中获得A549上皮细胞(ii型肺泡细胞),并在Dulbecco 's modified Eagle培养基(DMEM;Gibco BRL Life Technologies)添加10%胎牛血清(FCS), 200mmGydF4y2BaLGydF4y2Ba-谷氨酰胺、链霉素(100 μg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),如前所述。NF-κ b依赖的报告细胞系A549 6Btkluc是R. Newton(华威大学,考文垂,英国)的馈赠。这些细胞包含一个稳定整合的质粒,序列有三个串联重复的5 ' - agcttacaagggattccgctggggactttccaggga -3 ',其中包含两个十聚NF-κB结合位点,位于驱动荧光素酶基因的最小胸苷激酶启动子(-105-51)上游GydF4y2Ba27GydF4y2Ba.在实验之前,在没有抗生素补充剂的培养基中生长细胞。评估每个上皮细胞感染的多种感染(MOI)GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba,在Neubauer细胞仪(Hecht Assistant, Sondheim, Germany)中进行胰蛋白酶处理后,对24孔板每孔的融合BEAS-2B层进行细胞计数。细胞数为~ 5×10GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba细胞·好GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba.PBEC和A549细胞计数良好GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba了类似的结果。每口井的体积为500 μL。因此,感染剂量为10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba cfu·mL−1.GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba对应于1的MOI。GydF4y2Ba
材料GydF4y2Ba
DMEM、FCS、胰蛋白酶- edta溶液、CA-650和抗生素从Life Technologies (Karlsruhe, Germany)获得。蛋白酶抑制剂Triton X-100和Tween-20购自Sigma (Munich, Germany), calphostin C, Gö6976, PKC抑制剂20-28,PKCβ抑制剂,Rottlerin, pkc1抑制剂肽,PKCθ myristoylated假底物抑制剂和PKCζ假底物抑制剂购自Calbiochem-Merck (Darmstadt,并溶解在二甲基亚砜中。phorboll -12-myristate-13-acetate (PMA)由Calbiochem-Merck公司(Darmstadt, Germany)获得。所用的所有其他化学品均为分析级化学品,并从商业来源获得。GydF4y2Ba
引发ELISAGydF4y2Ba
如前所述,根据制造商的协议(R&D Systems,威斯巴登,德国),使用市面上可买到的三明治- elisa试剂盒测定PBECs、BEAS-B和A549细胞分泌的IL-8GydF4y2Ba17GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
rt - pcr分析GydF4y2Ba
根据制造商的说明,使用RNEasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,德国)提取RNA。所有底漆均购自Tib Molbiol(柏林,德国)。在1.5%琼脂糖凝胶上分析PCR产物,用溴化乙锭染色并随后可视化。为了确认等同加载,并行进行甘氨醛-3-潮水脱氢酶的PCR。GydF4y2Ba
PKC化验GydF4y2Ba
如前所述,使用PKC检测试剂盒StressXpress (Stressgen Bioreagents Corp., Victoria, BC, Canada)检测PKC活性GydF4y2Ba28GydF4y2Ba.刺激BEAS-2B和A549细胞GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba.收集含有活化PKC的细胞提取物,并根据制造商的说明用ELISA法检测PKC活性。GydF4y2Ba
免疫印迹GydF4y2Ba
通过蛋白质印迹分析评估Western印迹分析评估了Western印迹分析评估了对PKCα,PKCε和PKCθ的短干扰(Si)RNA的转染效率,MyRistoylated,富含丙氨酸的C-激酶底物(Marcks)和PKC同种型易位的磷酸化。简而言之,在含有SDS-PAGE的含有TRITON X-100的缓冲液中被指示并裂解BEA-2B细胞,并在杂交膜(Amersham Biosciences,Freiburg,Germany)上呈印迹。用特异性抗体进行靶蛋白的免疫缩乳。在所有实验中,通过使用Odyssey红外成像系统(Li-Cor Biosciences GmbH,Bad Homburg,Germany)同时在相同膜上同时测定肌动蛋白或细胞外信号调节激酶2,以确认如前所述的等同蛋白质负载GydF4y2Ba17GydF4y2Ba,GydF4y2Ba28GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
A549细胞和细菌感染的RNA干扰GydF4y2Ba
控制非沉默的siRNA(有义UUCUCCGAACGUGUCACGUtt,反义ACGUGACACGUUCGGAGAAtt)的siRNA靶向PKCα(有义UAGUUGAUCUCGCGGACGAtt,反义UCGUCCGCGAGAUCAACUAtt)的siRNA靶向PKCε(有义CGAUUCCAUCACUAUCCAUtt,反义AUGGAUAGUGAUGGAAUCGtt)和PKCθ-siRNA的(有义AAACCACCGTGGAGCTCTACTtt,反义AAGAGCCCGACCTTCTGTGAAtt)从MWG购(Ebersberg的,德国)。使用Amaxa Nucleofector转染A549细胞GydF4y2BaTMGydF4y2Ba(Amaxa, Köln,德国)根据制造商的协议GydF4y2BaTMGydF4y2Ba解决方案V, NucleofectorGydF4y2BaTMGydF4y2Ba程序G-16)每10个具有2μgsiRNAGydF4y2Ba6.GydF4y2Ba细胞。GydF4y2Ba
染色质免疫沉淀反应GydF4y2Ba
刺激BEA-2B细胞,除去培养基,如前所述加入1%甲醛GydF4y2Ba17GydF4y2Ba.1 min后,用冰水0.125 M甘氨酸PBS洗涤细胞,然后用冰水PBS快速收集,离心后用冰水PBS洗涤2次。用染色质免疫沉淀(ChIP)放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液(10 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1%去氧胆酸,0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1%抑肽酶)裂解细胞,超声剪切染色质。离心清除样品,上清液-80℃等量保存,待进一步使用。NF-κB p65 (C-20)抗体和聚合酶II (N-20)抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Germany)。可溶性染色质的免疫沉淀在4°C下过夜。用蛋白A/ g琼脂糖(Santa Cruz Biotechnology Inc.)收集免疫复合物60分钟,用RIPA缓冲液和高盐缓冲液(2 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 1% Nonidet P-40, 0.5%脱氧胆酸,1 mM EDTA)彻底清洗。在洗脱缓冲液中,180×振荡15 min,提取免疫复合物GydF4y2BaGGydF4y2Ba在30°C下。然后用核糖核酸酶消化30分钟 37°C时的最低温度。蛋白酶K消化6天后 h在37°C和6°C下 h在65℃下,使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)提取DNA。GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba通过PCR使用热星Taq(QIAGENGEN)DNA聚合酶通过PCR扩增启动子DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,并通过溴化乙锭染色检测。通过凝胶电泳控制等量的输入DNA。以下启动子特异性引物GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba用过:感觉,5'-AAG AAA ACT TTC GTC ATA CTC CG-3';反义,5'-TGG CCC TTT ATA TCA CCC TAC-3'。GydF4y2Ba
统计分析GydF4y2Ba
图1数据GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba–GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba显示为平均值±GydF4y2BaSEM.GydF4y2Ba至少有三个独立的实验。然后比较了主要影响GydF4y2Ba通过GydF4y2BaNewman-Keul测试后。刺激的影响GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba采用配对t检验对所用siRNA的抑制作用进行统计评估。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
M. catarrhalis-GydF4y2Ba诱导IL-8在支气管上皮细胞中的转录和释放GydF4y2Ba
目的研究寄主与病原菌之间的相互作用GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba和肺上皮GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba,本研究采用SV-40 t抗原转化的支气管上皮细胞系BEAS-2B作为细胞培养模型,以及与之相似的PBECsGydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba国家,从而为PBEC激活进行了一个重要的工具GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba.此外,已经表明BEA-2B细胞与其蜂窝功能的许多方面中的PBEC细胞的初级培养物类似地表现出类似的GydF4y2Ba17GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26GydF4y2Ba,GydF4y2Ba29GydF4y2Ba.培养BEA-2B细胞和PBECGydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba菌株O35E(10GydF4y2Ba7.GydF4y2Bacfu·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba对于60,120和240分钟)产生了IL-8转录的时间依赖性增加(图1AGydF4y2Ba⇑GydF4y2Bab). BEAS-2B细胞感染GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba与菌株O35E相比,菌株ATCC 25238诱导同样强烈的IL-8蛋白质释放(图1CGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).Curaxella菌株O35e感染的PBEC也可以证明剂量依赖性IL-8释放(图1DGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).为了探讨细菌活力对IL-8释放的影响,GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba应变O35E(1×10GydF4y2Ba7.GydF4y2Bacfu·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)在感染BEAS-2B细胞前被热灭活。与感染相同剂量的活莫拉菌相比,灭活菌诱导的BEAS-2B细胞中IL-8的释放没有显著差异(图1e)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
复活的GydF4y2Ba在支气管上皮细胞中增加PKC活性GydF4y2Ba
进一步探讨PKC的激活是否在细胞凋亡中起重要作用GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba诱导的细胞活化,释放升级2B细胞60,120和240分钟GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba(10.GydF4y2Ba7.GydF4y2Bacfu·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba), PKC活性增加2 - 4倍(图2a)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).用菌株O35e对细胞的2-H刺激导致PKC活性的增加,该活性与用菌株ATCC 25238感染后观察到的,用PMA(160nm)的细胞感染1-H刺激,是一种强大的诱导剂PKC活动(图2AGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba诱导的PKC活化通过免疫印迹证实了MACKS的伯酚酚磷酸化的时间依赖性增加,PKC在菌株O 3 5E感染细胞中的一个主要基材(图2BGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba)GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
复活的GydF4y2Ba- 诱导的IL-8释放和支气管上皮的PKC活化依赖于USPA2,但不依赖于USPA1表达GydF4y2Ba
为了研究GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba蛋白UspA1和UspA2用于肺上皮细胞释放IL-8,BEAS-2B细胞感染GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba野生型菌株O35e,USPA1缺陷型突变株O35E.1或USPA2缺陷突变株O35E.2持续16小时。如图3A所示GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba,由菌株O35E.1诱导的IL-8蛋白质释放与野生型菌株O35e诱导的IL-8分泌没有差异。相比之下,菌株O35E.2诱导显着降低IL-8分泌,表明USPA2上皮细胞相互作用对此重要GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba全身引发释放。接下来,UspA1和UspA2表达对PKC激活的影响通过与O35E野生型菌株、UspA1缺陷突变株O35E孵育细胞来研究。或uspa2缺陷突变株O35E.2。我们发现,莫拉菌表达的UspA1并不参与BEAS-2B细胞的PKC激活,而PKC的活性似乎依赖于UspA2(图3b)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).为了排除使用莫拉克拉菌株的生长速率的可能差异,野生型和突变菌株的生长GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba通过在BHI肉汤中的初始OD下孵育细菌悬浮液和37℃,振荡来进行比较。通过OD测量后续进行增长。通过不同OD的不同CFU计数验证数据GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba暂停。类似于Aebi的结果GydF4y2Ba等GydF4y2Ba31GydF4y2Ba检测的菌株之间没有发现差异(数据未显示)。因此,这些数据表明UspA2而不是UspA1对GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba诱导PKC活化和IL-8释放的肺上皮细胞。GydF4y2Ba
复活的GydF4y2Ba- 引出的IL-8释放由PKC同种型PKCα,PKCε和PKC差异调节GydF4y2BaθGydF4y2Ba
进一步调查PKC及其不同同种型的贡献GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba用泛pkc抑制剂calphostin C或staurosporin预孵育BEAS-2B细胞1小时,随后感染莫拉菌O35E株。采用ELISA法检测IL-8释放的诱导程度。如图4a所示GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba,这两种抑制剂导致IL-8释放减少,提示PKC参与IL-8的产生,以应对莫拉菌感染。接下来,我们研究了已知在肺上皮中表达的不同PKC亚型的作用。因此,融合的BEAS-2B细胞预先与化学PKC亚型抑制剂阻断PKCαβ (Gö6976, PKC 20/28), PKCβ (PKCβ抑制剂),PKCδ (rottlerin), PKC柱(PKCϵ-translocation抑制剂肽),PKCθ (PKCθ假底物抑制剂,肉豆素化)或PKCζ (PKCζ假底物抑制剂,PKCζ,肉豆蔻酰基化)GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba16小时GydF4y2Ba.GydF4y2Ba如图4b所示GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba,阻断PKCα和PKCε降低GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba-诱导IL-8产生。相反,PKCθ的抑制导致IL-8应答的显著增加。如PKCβ和PKCζ的示例所示,抑制其他PKC同型并不影响IL-8的释放(图。 4bGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba和数据未显示)。这些实验中使用的化学抑制剂没有减少上皮细胞数,诱导细胞毒性的形态迹象,或者在测试的时间框架内改变细菌生长(数据未示出)。GydF4y2Ba
接下来,通过sirna介导的基因沉默,我们更详细地分析了PKCα、pkc2和PKCθ与IL-8表达的相关性。然而,在基因敲除过程中,BEAS-2B细胞的活力受到了显著影响(数据未显示)。因此,我们使用了肺上皮细胞系A549,这是目前的作者之前成功使用的有效的靶基因沉默GydF4y2Ba26GydF4y2Ba,GydF4y2Ba32GydF4y2Ba.首先,利用本文前面描述的化学抑制剂(图5a),在该细胞系中证实了PKC亚型PKCα、pkc1和PKCθ参与莫拉菌诱导的IL-8释放GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).接下来,测试siRNA以减少靶蛋白的表达,发现pKCα-,PKCε-和PKCO特异性siRNA基本上降低了相应的激酶同种型的蛋白质水平(图5B-DGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).此外,与用对照siRNA转染的细胞相比,SiRNA的PKCα和PKCε的敲降降低了O35E诱导的IL-8产生(图5EGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba相比之下,转染PKCθ siRNA增加了moraxella诱导的A549细胞中的IL-8反应(图5g)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).因此,研究结果证实了这些PKC亚型的不同调控功能GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba全身引发释放。GydF4y2Ba
复活的GydF4y2Ba激活PKCα,PKCε和PKCGydF4y2BaθGydF4y2Ba肺上皮细胞中的激活GydF4y2Ba
已知从细胞溶溶胶到细胞膜的激酶易位是用于活化这些PKC同种型的指示剂GydF4y2Ba33GydF4y2Ba,GydF4y2Ba34GydF4y2Ba.为了确认PKC的同源型PKCα, pkc2和PKCθ的激活,随后在细胞膜中检测了易位的PKC同源型GydF4y2Ba复活的GydF4y2BaWestern Blotting感染。如图5A所示GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba,通过使用泛特异性PKC抗体,PKC强易位从细胞液到被感染细胞的细胞膜。类似地,PKCα, pkc2和PKCθ亚型也可以被显示到细胞膜上,这表明在莫拉菌感染肺上皮后,这些亚型被激活(图5b-d)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
PKC和UspA2参与其中GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba全身的NF -κB激活GydF4y2Ba
最近,目前的作者已经证明了这一点GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba- 诱导的IL-8释放取决于NF-κB的活化和易位及其与之结合GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba启动子GydF4y2Ba17GydF4y2Ba. 以往的研究表明,在不同类型的细胞中,PMA和TNF-α激活PKC是NF-κB激活所必需的GydF4y2Ba35GydF4y2Ba.评估PKC的重要性GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba- 诱导的NF-κB活化,NF-κB依赖的报告细胞系A549 6Btkluc感染GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba对于不同的时间段。在感染之前,将细胞与Pan-PKC抑制剂葫芦蛋白C一起温育。如图7A所示GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba,通过NF-κB荧光素酶活性测定,PKC的抑制显著降低了NF-κB的活化。此外,与野生型菌株相比,用UspA2缺陷突变株O35E.2感染细胞也导致NF-κB活化降低(图。 7aGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba)和USPA1缺陷型突变菌株O35E.1(数据未显示)。GydF4y2Ba
PKC同种型PKCα,PKCε和PKCGydF4y2BaθGydF4y2Ba差异控制IL-8表达GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba感染的肺上皮细胞GydF4y2Ba
活化后,NF-κB从胞质转位到细胞核,结合IL-8/κ b结合位点GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba启动子并诱导转录GydF4y2Ba14GydF4y2Ba.以描述不同PKC亚型的作用GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba的诱导转录GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba推动者,芯片研究采用。它是调查了吗?GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba- 抑制肺上皮细胞中的NF-κB活化导致RNA聚合酶II(POL II)的结合增加GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba启动子表明基因转录开始GydF4y2Ba36GydF4y2Ba.如图7B所示GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba,感染BEAS-2B细胞GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba导致Pol II与细胞的结合增加GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba启动子,确认该病原体诱导的增加的IL-8转录的先前结果(图7BGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba)GydF4y2Ba17GydF4y2Ba.为了研究PKCα、PKCα和PKCθ在这一过程中的作用,在BEAS-2B细胞感染PKCα (Gö6976)、pkc (PKCϵ-translocation抑制剂肽)或PKCθ (PKCθ伪底物抑制剂)前,用PKCα (Gö6976)、pkc (PKCϵ-translocation抑制剂肽)或PKCθ (PKCθ伪底物抑制剂)预孵育60分钟GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba(10.GydF4y2Ba7.GydF4y2Bacfu·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba),延长120分钟。预先用PKCζ抑制剂孵育的细胞不影响GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba- 诱导的IL-8释放,并用作内部控制。目前的结果清楚地表明了GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba- 诱导POL II的招募GydF4y2Bail8.GydF4y2BaPKCα和PKCε抑制后启动子显着降低(图7BGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).相反,PKCθ的抑制导致POL II与莫塞尔兰感染的促进剂的结合增加,表明这一点GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba-诱导的IL-8转录受到PKC亚型的负调控(图7b)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).与未经处理但静脉感染的细胞相比,PKC1的抑制不改变POL II的结合模式。GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
复活的GydF4y2Ba通过刺激促炎介质的分泌,例如IL-8,在COPD恶化中发挥病理作用。GydF4y2Ba17GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26GydF4y2Ba.在本研究中,证明了GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba- 至少部分地通过PKC控制诱导的NF-κB依赖性IL-8释放。此外,发现在肺上皮中表达的几种PKC同种型差别涉及GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba全身引发分泌GydF4y2Ba24GydF4y2Ba.化学抑制以及sirna介导的PKCα和柱一基因沉默显著抑制GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba-诱导IL-8释放,而抑制PKCθ则增加了这种释放,表明这些亚型具有相反的作用。研究了PKCα和柱一对GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba诱导的IL-8释放以及PKCθ的抑制作用伴随着将这些PKC同种型的易位从细胞溶溶胶到细胞膜馏分。在肺上皮表达的其他PKC同种型显示出没有影响GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba全身引发生产。此外,研究还证实了PKC亚型α、柱一和θ的差异调控是通过控制聚合酶II与蛋白的结合介导的GydF4y2Bail8.GydF4y2Ba呼吸上皮细胞启动子。PKC的活化依赖于蛋白的表达GydF4y2BaM. catarrhalis-GydF4y2Ba特异性外膜蛋白UspA2。感染UspA2缺陷病毒的细胞GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba突变株O35E.2显示出降低的PKC活性,导致与野生型菌株或USPA1缺陷突变株O35E的感染相比,导致NF-κB活化和IL-8释放。USPA2蛋白是一种推定的自耦体展示型大分子,其在表面上形成相对较短的丝状突起GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba细胞并是生物活性抗体的靶标GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba37GydF4y2Ba.与USPA1相比,它不起作用,但直接参与USPA2阳性静脉菌株中发现的血清耐药性的表达GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba38GydF4y2Ba,GydF4y2Ba39GydF4y2Ba. 此外,本研究的结果表明,UspA2介导的PKC激活控制NF-κB依赖性IL-8的释放可能代表了呼吸上皮细胞中莫拉菌UspA2的一种新的毒力机制。目前调查的主要局限性在于它是一个GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba研究利用人支气管上皮细胞。然而,研究这种严格的人类特异性病原体的发病机制是困难的,因为缺乏模拟人类在人类中看到的病原体宿主相互作用的简单动物模型难以困难。因此,如几个出版物所记录,GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba细胞培养方法为研究莫拉菌或其他潜在病原微生物与感染期间发生的宿主肺上皮之间的相互作用提供了一个有用的替代方法GydF4y2Ba13GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26GydF4y2Ba,GydF4y2Ba29GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
最近的报告支持PKC在气道上皮细胞中促炎基因表达的调节中的作用。通过PMA的PKC活化已被证明刺激NF-κB活化,并诱导A549细胞和人支气管上皮细胞中的粒细胞 - 巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)表达GydF4y2Ba40GydF4y2Ba,GydF4y2Ba41GydF4y2Ba.此外,若干研究表明了气道上皮细胞TNF-α对PKC抑制剂至少部分敏感的反应。在人支气管上皮细胞中,香烟烟雾诱导,以及C5a介导的IL-8表达GydF4y2Ba42GydF4y2BaTNF-α诱导的细胞间粘附分子-1表达GydF4y2Ba43GydF4y2Ba被calphostin C阻断,TNF-α诱导的GM-CSF表达被泛pkc阻断剂staurosporineGydF4y2Ba44GydF4y2Ba.此外,惠普GydF4y2Ba等GydF4y2Ba45GydF4y2Ba报道了泛PKC抑制剂calphostin c处理细胞后,pma诱导的气道黏膜蛋白MUC5B和MUC5AC的气道上皮细胞表达减弱。尽管这些研究没有确定PKC同工酶负责福波酯诱导的反应,这与本研究的结果一致,PKC亚型可能以NF-κ b依赖的方式调控气道上皮细胞基因表达。众所周知,PKC家族通过调节NF-κB等转录因子的活性,在控制炎症、细胞生长、分化和凋亡方面发挥着关键作用GydF4y2Ba19GydF4y2Ba,GydF4y2Ba46GydF4y2Ba. 然而,PKC激活所产生的生物学效应可能是刺激性的,也可能是细胞或组织特异性的。在上皮细胞中,关于病原体诱导的PKC的特异性调节,特别是PKC亚型,以及NF-κB依赖的促炎细胞因子转录,我们知之甚少。GydF4y2Ba念珠菌白葡萄酒GydF4y2Ba发现通过在上皮细胞中的PKC激活来上调环氧氧酶(COX)-2GydF4y2Ba47GydF4y2Ba.此外,COX-2的病原体相关表达GydF4y2Ba幽门螺杆菌GydF4y2Ba——或者GydF4y2Ba金黄色葡萄球菌GydF4y2Ba显示染料的上皮细胞被PKC活化介导GydF4y2Ba48GydF4y2Ba,GydF4y2Ba49GydF4y2Ba. 目前的作者最近证明COX-2表达和随后的PGEGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba- 杂志诱发GydF4y2Ba军团国GydF4y2BaneumophilaGydF4y2Ba肺泡上皮细胞A549的感染依赖于肺上皮细胞PKCα和NF-κB的激活GydF4y2Ba28GydF4y2Ba.如本研究所示,具有肺上皮细胞的感染GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba活化的PKC,触发NF-κB活化导致IL-8转录和释放。此外,目前作者发现PKC同种型PKCα,PKCε和PKCθ参与其中GydF4y2Ba复活的GydF4y2Ba通过差异调节IL-8转录诱导IL-8释放。因此,结果表明在Moraxella的IL-8诱导方面的PKC同种型的特定调节GydF4y2Ba-GydF4y2Ba受感染的肺上皮细胞。GydF4y2Ba
蛋白激酶C亚型的水平和不同组成代表了表达和降解之间的组织依赖性平衡,这可能在细胞应激环境中改变,例如急性或慢性炎症或吸烟GydF4y2Ba50GydF4y2Ba.蛋白激酶C同种型表达的变化可能进一步影响炎症免疫应答后GydF4y2Ba莫拉克斯氏菌属复活GydF4y2Ba感染。然而,目前有关人肺上皮细胞中蛋白激酶C的信息有限,需要进一步研究来分析正常和病变肺上皮细胞中蛋白激酶C亚型的组成。更好地了解单个蛋白激酶C同工酶如何参与慢性阻塞性肺疾病患者细菌感染的发病机制,可能为对抗这种慢性炎症疾病提供新的治疗靶点。GydF4y2Ba
支持声明GydF4y2Ba
这项研究得到了莱斯特大学医院NHS信托基金的财政支持。GydF4y2Ba
利益陈述书GydF4y2Ba
没有宣布。GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
我们非常感谢J. Hellwig,F. Schreiber和D. Stoll(Charité - Universitätsmedizin柏林)的优秀技术援助。这项工作的一部分将包含在L. Maqami的博士论文中(Charité - Universitätsmedizin柏林)。GydF4y2Ba
- 收到了GydF4y2Ba2007年8月9日。GydF4y2Ba
- 认可的GydF4y2Ba2007年12月11日。GydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司GydF4y2Ba
参考GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba
- ↵GydF4y2Ba