文摘
闭塞性细支气管炎(OB)的主要原因是长期移植肺失造成一个不清楚的免疫过程发生在缺乏捐赠的免疫细胞。现在的作者提出,t细胞与自体树突状细胞(dc)的相互作用,可以在OB不同病人与健康的肺移植受者(公升)。
从14个OB Monocyte-derived DCs和35 non-OB公升和自体t细胞培养。T调节(T注册)细胞,共受体、细胞因子生产、DC表型和吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)表达式通过流式细胞术进行评估。实验重复的铜绿假单胞菌或anti-co-receptor抗体。
DCs从non-OB LTR调节T注册细胞,细胞毒性t淋巴球抗原(CTLA 4)和白介素(IL) -10。相比之下CD28和诱导t细胞co-stimulator表达下调与此同时IL-13和il - 4。OB相比,non-OB DCs显示一个不成熟表型CD80和CD83较低和较高的语言表达水平。刺激的铜绿假单胞菌没有废除的耐受性影响DCs non-OB t细胞。最后,减少T注册细胞和il - 10生产发现当添加anti-CTLA-4 non-OB LTR抗体。
目前的研究表明树突状细胞从nonobliterative细支气管炎肺移植受者产生依赖的宽容的t细胞表型细胞毒性t淋巴球antigen-4参与。
闭塞性细支气管炎(OB)的表现是慢性肺部同种异体移植物排斥反应发生在33%的患者手术后5年1。尽管明显降低并发症的患病率与先前的研究相比,闭塞性细支气管炎综合征(BOS)仍然是迄今为止最重要的长期并发症和术后晚期死亡的第一原因,占25 - 30%的死亡发生在手术后第三年1。此外,BOS还造成重大损失的健康相关的生活质量2。在组织层面,OB特点是在早期阶段的渗透细支气管壁与淋巴细胞、单核细胞和周围,其次是纤维化的过程,导致闭塞的小航空公司3。虽然理解与OB的发生有关的危险因素增加了近年来4患者,免疫特征区分宽容的接受者和BOS在很大程度上仍未知5,6。
急性排斥反应(AR)集是公认为OB的重要危险因素。基于“增大化现实”技术的主要发生在手术后的第一个月,当捐赠者的白细胞抗原呈递细胞(apc)仍然浸润支气管,这被归咎于古典alloreactive免疫反应。树突状细胞(dc)在肺最强大的装甲运兵车,t细胞相互作用与主要组织相容性复合体(MHC)二类分子。专门识别alloreactive MHC t细胞通过t细胞受体(TCR)。除了同源TCR-MHC认可,参与共同受体表达的APC和t细胞需要高效的免疫反应的发生。这些co-stimulatory信号介导的通过CD80 / CD86在DCs (B7-1 / B7-2)和CD28分子或细胞毒性t淋巴球抗原(CTLA) 4 t细胞受体,导致积极的还是消极的调节t细胞活化,分别。最近的一项研究基因表达谱在支气管肺泡灌洗(BAL)表明,CD28和CTLA-4共受体是调节在基于“增大化现实”技术7。
OB是炎症过程发生在距离的过程,当捐赠者的细胞,但不是骨髓细胞,是本地更新和增殖8,9。先前的研究表明,增加的DCs在场人数长期拒绝肺移植而稳定的肺移植受者(LTR)10,11。它曾被证明在慢性排斥反应T细胞被激活,与T调节不足(T注册)细胞的激活12。因此,OB可能源于一个DC / DC和t细胞交互t细胞受体的细胞。这种交互可能成为抗原表达的肽,可能donor-derived抗原,将承担alloreactive特异性。目前作者提出,依赖于DC / t细胞相互作用的本质而言,t细胞激活或宽容感应,OB或贪污宽容可能发生,分别无论肽。
首先,为了验证这个假设,自体monocyte-derived DCs与t细胞的相互作用是研究在LTR。t细胞活化DC / t细胞共培养健康的肺移植受者之间(non-OB)和接受者BOS比较。其次,感染因素可能与OB,这种交互也测试微生物的存在的化合物。最后,在这个过程中分析了共受体的作用。
材料和方法
研究设计
血液样本被收集在连续LTR从2005年7月到2007年4月。这项研究是Sud-Mediterannee II伦理委员会批准(法国马赛的)和书面知情同意是获得所有的病人。为了避免偏见与围手术期并发症,公升在6个月的移植是不包括在内。微生物检查系统中执行BAL样本和相关感染(积极与临床微生物学或放射性的发现需要特定的抗菌疗法)被排除在研究之外。此外,样本后2个月内感染或急性排斥反应的治疗并没有考虑。
BOS被诊断出在一个进步的支气管阻塞根据先前的指导方针13。细节后续,呼吸功能和额外的治疗药物剂量在网上补充。BOS-0p收件人收到增加免疫抑制方案,特别是在类固醇,为了避免偏见与治疗,这些人被排除在研究之外。
DC分化与自体t细胞共培养
外周血单核细胞(PBMCs)被Ficoll-Hypaque从外周血分离梯度离心法。单核细胞纯化从PBMCs依从性和分化成DCs,如前所述14。简而言之,单核细胞培养在24-well板(107细胞·毫升−1)24小时在完全培养基补充800 U·毫升−1集落刺激因子(gm - csf)和500 U ml−1白介素(IL) 4。细胞培养的促炎介质为另一个24小时(1000 U·毫升−1肿瘤坏死factor-α10 ng·毫升−1IL-1β10 ng·毫升−1il - 6和1μM prostaglandin-E2)。从不依从细胞自体淋巴细胞,恢复,期间保持新鲜培养基。
2天,monocyte-derived DCs然后培养自体淋巴细胞的比例1:10 - 2和IL-7 5天。7天,细胞被染色的收获。在一些实验中,直流对t细胞的比例增加至1:10 4:10。
细菌刺激
评估DC / t细胞相互作用的特点,微生物存在的化合物,细胞溶解铜绿假单胞菌被添加到培养。铜绿假单胞菌被选为召回抗原的来源对于大多数病人显示囊性纤维化(CF)或bronchectasis。DCs与10μL孵化铜绿假单胞菌文化上层清液在2天。12 h的孵化后,DCs被自体淋巴细胞培养。
同时封锁
确定在DC / t细胞相互作用共同受体的作用,文化进行从第二天有或没有anti-CD28(克隆CD28.6, 10μg·毫升−1),anti-inducible t细胞co-stimulator (anti-ICOS;克隆ISA-3,μg·20毫升−1)或anti-CTLA-4(克隆14 d3,μg·20毫升−1)单克隆抗体(Abs;美国圣地亚哥从eBioscience CA)15。
流式细胞术
t细胞的表达膜抗原是评估通过添加特定的Abs在推荐细胞浓度(CD4-PECy5, CD25-fluorescein异硫氰酸酯(FITC);贝克曼库尔特,马赛,法国;CD3-FITC;Dako、暗色岩、法国;CD3 - PECy5 CD69-PE;Immunotools、Friesoythe、德国;CD28-FITC、ICOS-PE CTLA4-PE-Cy5;BD生物科学、Le Pont-de-Claix、法国)。细胞内foxp3表达的CD4 + t细胞细胞固定和permeabilisation后测量,通过与细胞内染色反人类的Foxp3-PE抗体(eBiosocience染色设备)。t细胞细胞因子生产还测量了经过染色细胞固定和permeabilisation t细胞与细胞内Abs(干扰素(IFN)γ-FITC IL-4-FITC; BD Bioscience; IL13-PE, IL-10-PE; R&D system, Lilles, France) after a 6-h incubation in presence of monensin, as previously described16。直流膜抗原的表达进行了研究17使用特定的Abs在推荐浓度(CD83-PE CD11c-PE,人类白细胞抗原(HLA) -DR-PC5;贝克曼库尔特;CD80-FITC;Immunotools)。
直流吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)也评估了细胞内染色与兔子反人类的被罩Abs (Chemicon、St-Quentin-en-Yvelines、法国),复染色,FITC-labeled猪antirabbit二级Abs (Dako)。
荧光检测与15 mW氩离子激光器三种颜色FACSCan®流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)。标准的采集和分析软件是通过Cellquest®软件(正)。
统计分析
正态分布的变量被消极Kolmogorov-Smirnov测试评估。比较各组测定使用t。配对t被用来比较和不使用DC和DC成熟t细胞活化标记表达式有或没有铜绿假单胞菌或anti-co-receptor Abs。方差分析是用来测试结果之间的差异在不同直流/ t细胞比率。重要的方差分析,Wilcoxon符号秩测试每个条件进行比较与基线。一个p值< 0.05,对于所有的测试被认为是显著的。结果意味着±se。
结果
病人
病人的特点如表1所示⇓。连续共49例(24男性,女性25日)接受双肺(n = 46)或单肺移植(n = 3)在目前作者的机构(胸部医学部门,圣玛格丽特大学医院,马赛,法国)都包括在这项研究。潜在的诊断囊性纤维化(n = 31),肺气肿(n = 8),支气管扩张(n = 2),肺纤维化(n = 2),原发性肺动脉高压(n = 2),结节病(n = 1),朗格汉斯细胞组织细胞增生症(n = 1), broncholithiasis (n = 1)和Rendu-Osler疾病(n = 1)。总数的,35岁被认为是健康的LTR(平均年龄39岁)和14显示BOS(平均年龄34.9岁)的包容。在目前的队列,OB和non-OB接受者组没有显著差异有关供体/受体巨细胞病毒状态或数量的人类白细胞抗原(HLA)不匹配。
DCs从non-OB LTR上调监管标记t细胞
DCs在自体t细胞的影响健康的接受者与OB患者DC / t细胞共培养。T注册人口(CD4 + CD25high + Foxp3 +)后评估文化如图1所示⇓。在non-OB接受者,DCs诱导T的增加注册细胞和il - 10生产(图。2⇓)。同时,t细胞CTLA-4表达增加了培养而这个理事会和CD28表达下调(图2所示⇓和表2⇓)。当t细胞干扰素(IFN) -γ生产没有影响DCs,辅助t细胞(Th) 2细胞因子明显降低(图。2⇓和表2⇓)。相比之下,在OB,受体表达和Th2细胞因子生产不同的DCs(图。2⇓和表2⇓),而IFN-γ调节。
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/31/6/1167/F1.medium.gif)
t细胞表型在树突细胞/ t细胞共培养。t调节细胞(CD4 + CD25 + Foxp3 +)通过流式细胞术进行评估。一)CD25 +与CD4 +强度;b) CD4 +与Fox3p +强度;CD25 +和c)与Fox3p +强度,2.3%都是积极的。#:CD4 + CD25medium +细胞;¶:CD4 + CD25high +细胞。集体CD4 + CD4 + CD25high CD25medium +和+代表所有CD4 + CD25 +细胞。
细胞因子在树突细胞生产/ t细胞共培养。白介素(IL) -13年,IL - 4和IL - 10 t细胞以及生产t调节细胞(CD4 + CD25high + Foxp3 +),诱导t细胞co-stimulator(这个理事会)和细胞毒性t淋巴球表达t细胞抗原(CTLA 4)评估在闭塞的毛细支气管炎(OB;•;n = 14)和non-OB (○;n = 30)接受者,在(+)或缺席(-)monocyte-derived denditic细胞(DC)。结果总t细胞的百分数表示。单杠显示的意思。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
因此,似乎从non-OB DCs接受者诱导宽容自体t细胞的表型,而引起炎性表型与upregulation IFN-γ生产OB接受者。
健康的t细胞宽容的表型LTR与DC / t细胞比例
为了评估是否DCs负责t细胞的表型,DC / t细胞比例从1:10 4:10在提高DC / t细胞共培养。在non-OB接受者,DC / t细胞比例增加诱导t细胞失活,CD69的差别反映在一个对这些和CD28的表达以及IL-13生产(图。3⇓)。t细胞激活4:10比达到一个最低水平。t细胞IFN-γ生产DC刺激下没有变化。相比之下在OB接受者,增加直流调节细胞因子的生产(IL-13 INF-γ)以及CD69表达(图3所示⇓)。DC-induced调制的t细胞活化存在剂量依赖的相关性。
![图3 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/31/6/1167/F3.medium.gif)
t细胞表型与树突细胞(DC) / t细胞(TC)比例增加。CD28 CD69表达和白介素(IL) -13或干扰素(IFN) -γ生产TCs被流式细胞术评估DC / TC共培养,同时增加DC / TC比例1:10 4:10。结果给non-OB (○, n = 16)和OB接受者(•n = 10),与基线比较每组中。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
直流从non-OB收件人显示一个不成熟的表型
DCs的成熟阶段严重影响免疫反应的结果。因此,直流标记与DC成熟了:CD11c, CD80、CD83和HLA-DR。相比与DCs OB接受者,DCs non-OB主题显示减少的表达CD83和CD80(图4⇓),而CD11c和mhc ii没有不同。
树突状细胞(DC)成熟标记和吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)表达式。)CD80、CD83、人类白细胞抗原(HLA)是和CD11c DCs和b)语言表达。之间的)结果比较闭塞的毛细支气管炎(OB;░;n = 14)和non-OB (□;n = 28)。b)单杠显示均值和评估DC / t细胞共培养,流式细胞术。结果给出了直流总量的百分比。结果对比OB (•;n = 14)和non-OB (○; n = 28) recipients. *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001.
一个机制apc可能引起一个宽容的t细胞反应是通过IDO的表达。根据监管表型诱导在DC刺激non-OB接受者,OB DCs表达低水平的细胞内被罩比non-OB病人(图4 b⇑)。
因此OB相比,non-OB DCs展览一个不成熟的表型,尽管使用相同的两组成熟细胞培养条件。
刺激的铜绿假单胞菌修改DC成熟而不影响其耐受性的影响
来验证是否t细胞的表型DC-induced宽容是维持微生物存在的化合物(其分子模式和抗原),DC / t细胞共培养与10μL刺激铜绿假单胞菌浮在表面的文化。刺激non-OB接受者的DCs铜绿假单胞菌上层清液调节直流CD80的表达、降低DC细胞内油生产,以上的差别,对这些CD83(图5⇓)。相比之下,在OB DCs,铜绿假单胞菌诱导增加CD83 IDO的表达没有显著变化或其他标记(数据未显示)。因此,刺激的铜绿假单胞菌修改non-OB和OB接受者DC成熟状态。
t细胞和树突状细胞(DC)表型的存在假单胞菌aerugisosa(年利)。直流/ t细胞共培养的执行年利浮在表面的文化。CD80, b) CD83和c)吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)表达式nonobliterative细支气管炎DCs (n = 16)评估通过流式细胞术在DC / t细胞共培养(+)或缺席的(-)年利。d) t调节细胞(CD4 + CD25high + Foxp3 +), e)白介素(IL) -10产生t细胞,f)诱导t细胞co-stimulator(这个理事会)或g)细胞毒性t淋巴球表达t细胞抗原(CTLA) 4 +年利也评估了在t细胞nonobliterative毛细支气管炎(non-OB;○;n = 20)和OB接受者(•;n = 10)。结果进行了比较(+)的存在与否的DCs (-)。单杠显示的意思。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
在这些条件下,一个轻微的upregulation诱导t细胞CD69的表达和IFN-γ生产的OB接受者。关于共同受体和Th2细胞因子的生产,没有发现显著变化(图5 b⇑和表3⇓)non-OB接受者,DCs在微生物化合物的存在仍然调节生产il - 10, T注册细胞和CTLA-4表达式,而CD28和这个理事会表达下降(图4 b⇑和表3⇓)。关于Th2和Th1细胞因子,发现无显著差异(表3所示⇓)。因此,即使在的存在铜绿假单胞菌,DCs还诱导t细胞表型宽容non-OB接受者。
t细胞的表型DC-induced宽容non-OB取决于CTLA-4接受者
测试如果受体参与B7家族分子负责DC-induced宽容的概要文件中发现non-OB细胞,anti-CD28 anti-ICOS或anti-CTLA-4阻塞Abs被添加到DC / t细胞共培养。
在non-OB接受者,anti-CTLA-4 Abs生产和T降低il - 10注册比例(图6⇓),而anti-CD28或anti-ICOS Abs没有影响(数据没有显示)。
t细胞表型和树突状细胞(DC)标记表达式的anti-cytotoxic早期抗原(CTLA) 4 (Abs)的抗体。)t调节细胞(CD4 + CD25high + Foxp3 +), b)白介素(IL) -10产生t细胞,c) CD69和d)诱导t细胞co-stimulator(这个理事会)表达式进行流式细胞术在nonobliterative毛细支气管炎(non-OB;○;n = 18)和OB接受者(•;n = 10)。总t细胞和比较的数据表示为百分比在(+)或缺乏对DCs(-)和anti-CTLA-4 Abs. e) CD80和f)吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)表达式non-OB DCs (n = 16)评估DC / t细胞共培养。数据给出直流总额的百分比和比较在(+)或缺席(-)anti-CTLA-4 Abs。水平栏显示的意思。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
此外,anti-CTLA-4 Abs直流CD80和语言表达的显著降低和增加CD83、HLA-DR和CD11c表达的DCs non-OB接受者(图6 b⇑)。
相比之下在OB接受者,CTLA-4封锁诱导增加这个理事会和CD69表达(图6⇑),没有重大的变化在DC成熟标记(数据未显示)。
因此,anti-CTLA-4 Abs逆转DC-induced non-OB t细胞表型,但不在OB接受者。这些结果表明,B7-CTLA-4交互在DC / t细胞共培养专门调解t细胞由直流的宽容的表现型non-OB接受者。
讨论
在目前的研究中,自体DCs在t细胞活化的影响在健康non-OB和OB接受调查。DCs从non-OB接受者诱导il - 10的upregulation生产和T注册细胞。这些T注册细胞是负责宽容感应的各种模型实体器官移植18。在血LTR,它已经表明,T注册细胞减少BOS接受者而健康的接受者12。目前的研究结果都和这些结果一致,表明DC-induced T注册细胞,在健康的LTR,移植的患者有保护作用。据DC-induced宽容的t细胞的表型,t细胞CTLA-4表达增加在DC刺激non-OB接受者。事实上,CTLA-4表示激活t细胞CD28,结合CD80和CD8619,但它是一个监管分子抑制t细胞的反应20.。
我的n体外DCs来源于外周单核细胞对t细胞的影响是检查。尽管循环直流和肺直流没有研究,目前作者认为目前的结果有关在活的有机体内。事实上,气道的DCs起源于外周血单核细胞从骨髓6,21。Monocyte-derived DCs用于在体外研究类似co-stimulatory分子(CD80、CD83)和HLA-DR表达式来自肺DCs22。这些分子可以通过骨髓DCs和血浆DCs差异表达,这两个航空公司的直流子集能够引起不同类型的免疫反应23。分析DCs从矿山或支气管活检能证实这个类比,但这些细胞不够代表正常研究关于他们co-stimulatory能力。通常条件下诱导成熟,一个不成熟的表型在non-OB接受者而获得OB对象预期的成熟表型。事实上DCs从non-OB收件人参与抗原表达明显下调表面分子(CD80、CD83)和与此同时增加细胞内、涉及抑制t细胞增殖24。这种不成熟的DC表型可能负责宽容表型t细胞共培养诱导。
铜绿假单胞菌是用来挑战DCs,通过刺激toll样受体(TLR)诱导一个完整的抗原表达系统,因为研究患者的80%,CF或支气管扩张患者先前感染病原体。预计TLR由革兰氏阴性细菌刺激诱导DCs在炎性细胞能够分化组织向完全anti-infectious DC-induced t细胞激活反应。然而在目前的系统中,铜绿假单胞菌刺激non-OB患者的影响很小,而它有效地增加了促炎OB患者t细胞表型。这个结果表明一个健壮的pro-tolerant概要non-OB DCs的接受者。值得注意的是患者移植前无差异铜绿假单胞菌殖民和其他LTR。铜绿假单胞菌刺激修改了DC表型non-OB接受者特别是增加CD80表达、减少油生产。然而DCs的耐受性影响t细胞并没有修改。这可能是上层清液的相关事实铜绿假单胞菌文化,而不是活细菌,使用。也有可能模仿的7天文化太短在活的有机体内的影响铜绿假单胞菌。目前的结果还表明,因素,除了DC的成熟水平,参与了耐受性的过程。事实上参与CTLA-4证明是关键。
使用重组可溶性形式的人类CTLA-4之前证明CTLA-4 / B7系统可以调节IDO的表达CD4 +和CD8 + t细胞25。这里,anti-CTLA-4 Abs诱导non-OB recipiens,相应减少的T注册人口和t细胞il - 10生产,证明DC-induced宽容t细胞表型观察到这组取决于CTLA-4订婚26,27。但值得一提的是,在OB接受者,CTLA-4封锁t细胞CD69的表达增加,表明受体功能,但不能诱导这些病人的宽容的表型。此外,anti-CTLA-4 Abs专门诱导减少直流被罩表达式和增加直流膜抗原的表达与成熟有关。这些结果说明CTLA-4 / B7轴工作不仅从直流到t细胞,而且从t细胞,扩增循环。然而,anti-CTLA-4 Abs Th1和Th2细胞因子影响生产。除了CTLA-4外,其他共受体可能参与调节t细胞反应。的确,穆恩et al。28显示阻塞CTLA-4附随地CD28受体诱导一个完全废除IDO-mediated抑制t细胞。在目前的研究中,独自anti-CD28没有可见的影响,但残余直流对t细胞的影响被anti-CTLA-4 Abs由于CD28仍有可能。此外,最近的一个研究建立了一个关键的角色控制启动和降级的t细胞无力的新分子途径涉及B7-H1装甲运兵车及其受体t细胞的程序性死亡129日。这将是有趣的研究B7-H1 /编程死亡1轴平行于B7 / CTLA-4通路在目前的系统。
结果是否有偏见了两组不同的免疫抑制疗法的使用是有问题的。然而,宽容的DC / t细胞的相互作用中发现non-OB接受者时保持比较non-OB和OB接受者拥有相同的免疫抑制方案(他克莫司,霉酚酸酯、阿奇霉素;数据未显示)。此外,治疗中给出OB或急性排斥后更免疫抑制,因此将增加t细胞宽容的表型,从而减少观察两组之间的差异,而不是放大它们。
细胞因子是免疫系统的主要监管机构,细胞因子和cytokine-receptor基因多态性可能影响容易被拒绝。Lacha等。30.表明,il - 6基因多态性与糟糕的时间埋葬在肾移植的结果。地也被牵连在同种异体移植物排斥反应特别是心脏31日和肾移植。事实上,肾移植受者与地显示多态性降低急性同种异体移植物排斥反应的风险32。在相同的观点,目前CTLA-4结果可能CTLA-4基因多态性的结果。的确,最近表明,特定CTLA-4单体型(+ 49 / + 6230 g),这对正常的膜结合编码CTLA-4表达但降低可溶性CTLA-4生产,是共显性风险等位基因为临床肝移植后急性排斥反应33。HLA多态性也可以参与其中。这是显示最近可溶性HLA-G免疫心脏和肝脏有关宽容34- - - - - -36。
综上所述,目前的结果提供了新证据为特定的树突状细胞和t细胞在肺移植受者之间没有什么根据的闭塞的细支气管炎。树突细胞诱导宽容t细胞表型观察nonobliterative细支气管炎患者为闭塞性细支气管炎的病理生理学提供了新的见解。树突状细胞是主要的细胞类型呈现抗原在肺癌和支气管,目前作者推测,树突细胞的特点/ t细胞相互作用诱导nonobliterative细支气管炎患者负责长期容忍。导致这些特征的信号是未来研究的一个重要话题。重要的是,如果这一特点树突细胞/ t细胞交互排除了发生闭塞性细支气管炎,这些共培养可以有助于慢性排斥反应的早期诊断。最后,使用自体树突细胞一直在测试一些癌症治疗引起强烈anti-tumoural效果37。目前的结果表明,在类似的方法,不成熟的自体树突细胞,T注册细胞或战略旨在刺激B7 /细胞毒性t淋巴球antigen-4轴可以用于治疗或预防肺移植受者的闭塞性细支气管炎。
支持声明
这项工作得到了协会Vaincre Mucoviscidose,巴黎,法国。
感兴趣的语句
没有宣布。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2007年7月23日。
- 接受2008年1月21日。
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