文摘
转录因子复杂的低氧诱导因子(HIF) 1控制大多数基因的表达参与适应缺氧环境。HIF-1是一个异质二聚体组成的oxygen-labile HIF-α和既定表示HIF-β子单元。HIF-α的氧依赖性的监管是一个多步骤的过程,包括退化下normoxia但稳定,易位到原子核在缺氧条件下和激活。
本文总结了光学方法的贡献的理解氧依赖性HIF-1通路的调控。HIF-α的组织——和特异性分布呈现是免疫组织化学和免疫荧光。转录活性HIF-1监控使用绿色荧光蛋白作为一名记者在活细胞缺氧反应的控制元素,在老鼠和肿瘤组织球状体。青色和黄色变异的绿色荧光蛋白融合诱导子单元和调节蛋白,亚细胞分布、迁移和交互是成像在活的有机体内通过荧光恢复后photo-bleaching和荧光共振能量转移。这些细胞和分子过程的非侵入性成像激光扫描显微镜补充体外分子生物学检测,并提供一个额外的空间和时间维度的理解HIF-1途径。
系列“缺氧:人肺科学会议”
由n·韦斯曼编辑
在本系列3号
为了减少氧化,哺乳动物细胞激活低氧诱导因子(HIF) 1,调节转录的基因参与血管生成,红细胞生成、糖酵解、铁代谢和细胞生存1。除了氧气体内平衡的作用,在活的有机体内研究显示一个特定期间HIF-1缺血的作用,炎症和各种癌症,以及在开发过程中1。
HIF-1 heterodimeric基本helix-loop-helix / / / ARNT / SIM (PAS)域的转录因子,组成一个稳定和持续表达β-subunit (HIF-1β,也称为芳基碳氢化合物受体核转运蛋白(ARNT))和一个诱导α-subunit (HIF-1α),由细胞氧浓度控制的水平(图1所示⇓)。除了无所不在的HIF-1αHIF-α家庭包含两个其他成员,HIF-2α(也称为内皮不是域蛋白1)和HIF-3α,两者都有更严格的组织表达2,3。而HIF-2α直接参与低氧基因调控,特别是在内皮细胞,HIF-3α可能是低的负调节基因的表达4。
低氧诱导因子(HIF) 1亚基的结构。人类HIF-1α亚基(826个氨基酸)和持续表达HIF-1β亚基(789个氨基酸)HIF-1复杂属于集团的基本helix-loop-helix (bHLH) / / / ARNT / SIM (PAS)的蛋白质。bHLH /不是域调解的DNA结合和heterodimerisation子单元。Transactivation HIF-1复杂的由氨基Transactivation域(N-TAD)和c端Transactivation域包含asparaginyl残渣(C-TAD) 803 (N)。HIF-1α在常氧条件下的降解是依赖于氧依赖性退化域(ODDD)。P:脯氨酸残基402年和564年;NLS:核本地化的信号。
HIF-1α迅速退化在常氧条件下,在两个脯氨酸羟化时残留在氧依赖性的降解蛋白质域由prolyl羟化酶域(博士)1 - 3(图2所示⇓)5。这个翻译修饰作为识别主题为后续泛素化的E3泛素连接酶活性冯Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白(pVHL),因此针对HIF-1α被蛋白酶体降解。缺氧条件下抑制prolyl羟基化,导致HIF-1α的稳定6,7。
低氧诱导因子(HIF) 1-mediated氧气传感的转录。的原理说明了α-subunit heterodimeric转录因子转录控制HIF-1传达了缺氧条件。在缺氧条件下,HIF-1αdimerises HIF-1β和结合HIF-responsive目标基因,如促红细胞生成素或血管内皮生长因子。招聘后转录辅激活绑定(营响应元素绑定)蛋白质分子(CBP) / p300 HIF-1α和额外的绑定的基因——或者修复转录辅因子,HIF-1-dependent转录诱导。b)在常氧条件下,HIF-1α缺席,因为它是灭活,立即由蛋白酶体机械退化。氧传感器将氧气浓度转换成HIF-1α氧依赖性的羟化酶:变化因素抑制HIF-1 (FIH-1)和prolyl羟化酶domain-containing蛋白质1 - 3(博士)。在氧气的存在,FIH-1羟化asparaginyl残留803 (N)的c端transactivation域内HIF-1α,防止CBP的招聘/ p300 HIF-1复杂,从而导致转录活动的减少。博士羟化两个prolyl (P)残留(P402和P564) HIF-1α氧依赖性的退化域内,允许绑定的冯Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白(pVHL)。pVHL函数的识别元素multiprotein E3泛素连接酶复杂,目标HIF-1α,通过polyubiquitination,蛋白酶体降解。而二聚和transactivation HIF-1复杂的发生在细胞核,它仍在讨论是否FIH-1的氧传感过程/博士,pVHL绑定和蛋白酶体降解可以发生在细胞质和细胞核。哦:羟基。
稳定HIF-1α把进入细胞核,它与HIF-1βheterodimerises(图2所示⇑)。HIF-1复杂DNA结合监管序列称为缺氧反应元素(人力资源),它们存在于HIF-1目标基因的启动子或增强子区域8。招聘后转录辅活化因子,如绑定(营响应元素绑定)蛋白质分子(CBP) / p300,目标基因表达的诱导9。之间的相互作用与CBP / p300 HIF-1α也是氧控制通过羟基化(图2所示⇑)。一个叫做因子抑制asparagyl-hydroxylase HIF-1修改c端transactivation域(C-TAD) HIF-1α和抑制其与CBP / p300当氧是可用的10。因此,缺氧,除了稳定HIF-1α之外,也能导致激活的转录活动。此外,运动细胞之间的HIF-1α隔间似乎依赖于氧气的浓度11。目前综述光学方法来改善的贡献的理解氧依赖性HIF-1通路的调控。的组织——和特异性分布oxygen-controlled HIF-α子单元被免疫组织化学和免疫荧光的视觉。转录活性HIF-1监控使用绿色荧光蛋白(GFP)作为记者在活细胞控制的人力资源,和生活的老鼠球状体。使用青色和黄色的变体(分别CFP和YFP)生成与低氧诱导因子融合蛋白GFP的子单元和调节蛋白,亚细胞分布、迁移和交互是成像在活的有机体内通过荧光恢复后photo-bleaching(收紧)和荧光共振能量转移(FRET)。这些细胞和分子过程的非侵入性成像双光子激光显微镜补充体外分子生物学检测,并提供一个额外的空间和时间维度的理解细胞缺氧反应。
组织和HIF-α亚基的特异性表达
为了更好地理解HIF-α监管的机制和网站,HIF-α在正常组织的分布模式,以及变化发生在生理发展、恶性转化被免疫组织化学检查或缺血。
HIF-1α的时空分布在活的有机体内已经决定在健康小鼠反应减少氧气分压。免疫组织化学检查大脑、肾脏、肝脏、心脏和骨骼肌透露HIF-1α蛋白质存在于细胞核,甚至在常氧条件下。核和胞质染色HIF-1α被发现增加以应对系统性缺氧(6%氧气),除了在肺12。这些发现表明,生理氧气浓度在正常组织,包括2 - 5%的氧气13允许HIF-1α水平,有助于保持体内平衡的细胞活动,如。通过控制稳态所需的基因表达提供细胞能量。
除了缺氧,产生其他信号在细胞分化和在应对器官生长因子可能在常氧调节HIF-1α的表达在不同的细胞类型。强HIF-1α蛋白质的积累中检测出特定的细胞,如在海马体神经元,大脑的齿状回和肝细胞在肝脏12。相比之下,HIF-1α察觉在老鼠的肺细胞即使在缺氧(6%氧气)12。然而,HIF-1α表达诱导时雪貂肺通风4 h < 1%的氧气。re-oxygenation, HIF-1α迅速降解,半衰期为< 1分钟14。在缺氧的雪貂肺、HIF-1α表达在大多数细胞类型,包括平滑肌、肺泡细胞和血管上皮细胞14。
另外,细胞不含HIF-1α可能优先表达HIF-2α适应缺氧。尽管HIF-2α并不常氧条件下检测,系统性normobaric缺氧(8%氧气)和贫血缺氧(0.1%一氧化碳)诱导HIF-2α老鼠调查机关,包括大脑、心脏、肺、肾脏、肝脏、胰腺和小肠15。课程的时间和振幅之间的感应不同的器官,除了肺,HIF-2α蛋白质只有非常微弱的增加。
免疫组织化学显示核积累不同的细胞群在每一个组织,它总是nonparenchymal在某些器官(肾脏、胰腺和大脑),主要是别人的实质(肝脏和小肠)或均匀分布(心肌)15。然而在肺,组织从大鼠暴露于8%氧气免疫组织化学显示强烈和频繁的II型pneumocytes核染色,而贫血缺氧只有弱HIF-2α丰度增加。相比之下,肺动脉内皮细胞显示强烈的核信号反应形式的缺氧15。因此,HIF-2α可能在转录发挥重要作用对缺氧的反应在活的有机体内这是互补的,而不是多余的,HIF-1α。
表达模式和程度HIF-1α和2α施加相似或不同的功能在活的有机体内调查了比较不同细胞类型的免疫组织化学反应肾脏和心脏的缺氧或局部贫血16- - - - - -18。研究HIF-1α的表达与2α在肾脏,老鼠被暴露于系统性缺氧,贫血引起的出血,功能性贫血(0.1%一氧化碳)、肾缺血或氯化钴(II) (CoCl2;模拟缺氧)。这些疗法导致显著的选择性的核HIF-1α积累和2α细胞类型,肾区和实验条件16。HIF-1α主要是诱导在管状细胞,而HIF-2α表达在肾小球内皮细胞和管周内皮细胞和成纤维细胞。尽管众所周知的异质性肾氧气紧张(< 0.1 -7%的氧气),没有观察到的信号从HIF-α单位正常大鼠的肾脏16。相比之下,HIF-α蛋白表达在发展中人类和老鼠肾脏glomerulogenesis和nephrogenesis期间。HIF-1α似乎主要是参与tubulogenesis和HIF-2α肾血管生成;两种亚型glomerulogenesis期间被发现18。同样,在妊娠前三个月开发人类的肺,它发生在子宫的相对缺氧的环境,HIF-1α被发现主要局限于分支上皮,而HIF-2α也出现在肺实质的血管结构19。HIF-α物种的不同空间表达式在肺可能反映了他们不同的角色发展。HIF-1α似乎更重要器官发生,而HIF-2α的功能似乎是肺vascularisation和改造的微调19。这些数据支持了这样的观点,即HIF-1α和2α已经施加不同的器官功能在早期开发,以及它们的功能以应对缺氧或在成人组织缺血性疾病。
在正常的人体组织很少HIF-1α或2α的表达被发现。重大HIF-2α表达式被发现是有限的枯氏细胞在肝脏和骨髓巨噬细胞。这HIF-2α染色胞质为主,少量的核本地化巨噬细胞20.。弱HIF-1α表达式还发现在胎儿肝细胞,增殖在扁桃体和脾脏b细胞和睾丸的细精管,与细胞增殖有关21。
相比之下,HIF-1α和2α蛋白被发现在大多数类型的人类肿瘤及其转移,包括神经胶质、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、肝细胞、胰腺、前列腺、膀胱和肾脏癌20.- - - - - -23。在肿瘤、程度、强度、细胞内的本地化和分布HIF-1α和2α染色是异构的20.,21。HIF-1α染色主要是核,但一些细胞质染色的HIF-1α也发现结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺腺癌。然而,HIF-1αtumour-adjacent中没有观察到间质组织21。在肾细胞癌,染色HIF-1α细胞质和核,而HIF-2α专门核。在肝细胞癌,观察蛋白质的核和胞质染色20.。perinecrotic地区肿瘤,HIF-1α蛋白质染色往往强于HIF-2α20.。HIF-1α-positive细胞也突出neovascularisation肿瘤边缘及周边地区21。变量数量的核HIF-1α和2α的表达,或不完全重叠模式的两个HIF-α子单元,表明hypoxia-independent机制在肿瘤微环境有助于upregulation HIF-α蛋白质癌症。
监控HIF-1转录活动
虽然免疫组织化学分析可用于确定HIF-α蛋白质存在上级在癌症细胞与周围正常组织相比,它没有透露是否HIF-1复杂的转录活跃。调查HIF-1的转录活动在活的有机体内,一些人力资源通常是融合GFP或其变体。为了应对缺氧或CoCl2观察,诱导HIF-1-dependent GFP表达在一些细胞系通过流式细胞仪分析和荧光显微镜24- - - - - -26。
监控和评估内生HIF-1活动水平在肿瘤发展和增长,Serganovaet al。24已经开发出稳定的肿瘤细胞转导的逆转录病毒载体,轴承双报告基因盒的HIF-1-inducible 8 hre-thymidine激酶/ GFP融合和持续表达报告基因,Discosoma红色荧光蛋白2 /黄嘌呤phosphoribosyltransferase。这种双重记者系统允许成像HIF-activity球状体或生活的异种移植小鼠,通过激光共聚焦显微镜以及通过非侵入性在活的有机体内正电子发射断层扫描(PET)放射性标记探针27。在多细胞转导C6鼠胶质瘤细胞生长,球状体HIF-1活动时可检测在中部地区超过350µm球状体直径,缺氧的核心区域。这些发现是在协议与应用前列腺肿瘤多细胞球状体(直径350 - 400µm)定量分析激光扫描显微镜,显示增加HIF-1α表达式在中部地区,关联与减少pericellular氧含量以微电极28。相比之下,Indovinaet al。26报道说,三维细胞组织导致几乎立即HIF-1激活即使在小直径(100µm)从骨肉瘤细胞生长稳定转染的HRE-enhanced (E) GFP记者向量,当分析在活的有机体内与双光子激光显微镜。自100年以来µm仍在氧气扩散限制,观察到的低氧诱导因子活动小很可能不是因为缺氧,但可能是由于旁分泌因素产生在早期三维细胞生长26。
此外,HIF-1活动已被证明是异构的,依赖于在异种移植肿瘤大小与HIF-1-specific转染GFP记者向量。增加(> 3毫米)直径的C6鼠神经胶质瘤肿瘤,观察HIF-1转录活动显著增加肿瘤的核心区域,所呈现的micro-PET和荧光显微法证实了切除肿瘤。Ischaemia-reperfusion损伤小肿瘤异种移植引起快速感应HIF-1转录活动持续时间(24小时)比正常组织透露,除了缺氧,致癌信号可能发挥作用在控制HIF-1活动24。为了实时监控HIF-1活动肿瘤异种移植,刘et al。25选择5启动子融合一定是不安的EGFP的半衰期缩短< 2 h (d2EGFP)。HIF-1活动,监视EGFP荧光强度,与缺氧有关治疗和re-oxygenation导致HIF-1迅速减少活动。固体肿瘤内生活的老鼠,HIF-1活动是异构的,免疫组织化学分析证实,d2EGFP-expressing地区反映HIF-1活动几乎是相同的地区缺氧标记这种染色25。然而,仔细观察,d2EGFP-positive细胞似乎比pimonidazole-stained细胞更丰富。HIF-1激活这可能反映了一个更低的阈值与或的这种加合物的形成是由于nonhypoxic激活HIF-1不增加这种染色25。
亚细胞分布的低氧诱导因子子单元与监管因素和交互
它已被广泛证实通过免疫荧光核HIF-1α积累的许多细胞系缺氧,hypoxia-mimicking代理、炎性细胞因子、一氧化氮和荷尔蒙29日- - - - - -34。核HIF-1α积累的结果减少退化或增强HIF-1α的综合。使用绿色荧光蛋白融合蛋白结构和删除变体,岩石et al。11确定了核本地化的糖信号图案HIF-1α介导的易位到细胞核。核易位本身似乎本构,独立的细胞内氧的可用性或pVHL状态感染腺病毒表达GFP融合HIF-1α亚基35。在re-oxygenation HIF-1α迁至细胞质中以在许多细胞系被蛋白酶体降解11,35,36。出口的HIF-1αre-oxygenation不是由染色体介导维护地区(CRM) 1 / Exportin1,自核出口未受药物影响leptomycin B35和一个典型的核出口信号在HIF-1α尚未确定。然而,Groulx和李35提供证据表明pVHL扮演双重角色,参与HIF-1α退化和出口到细胞质中。Groulx和李35显示交互的HIF-1αpVHL发生在细胞核,HIF-1α哪里ubiquitinated之前出口通过non-CRM1-dependent细胞质的机制。根据这一模型,HIF-1α完全位于细胞核在缺氧,因为它不与pVHL和交互,因此,不能出口到细胞质中35。
然而,之前报道,捕获HIF-1α在细胞核或胞浆并不妨碍HIF-1α退化37,这意味着HIF-1α退化可能发生在两个隔间。事实上,蛋白酶体复合物和pVHL存在于细胞质和细胞核38- - - - - -40。此外,本地化研究表明,氧传感器启动HIF-1α退化,即博士蛋白质,也发现在两个隔间41- - - - - -43。与这些研究结果一致,郑et al。44最近显示上的HIF-1α退化和细胞中特定类型的方式管理亚细胞分布。片段的氨基端transactivation域(N-TAD) HIF-1α能够抑制pVHL-mediated退化与GFP融合时针对不同细胞隔间,允许两种细胞类型的识别44。在高度增殖或转化细胞(如。HepG2肝癌细胞),HIF-1α降解主要发生在细胞质中。在缺氧,HIF-1α把原子核,re-oxygenation,需要搬迁到细胞质中蛋白质高效降解。在这个细胞类型,保留HIF-1α原子核可以防止退化。相比之下,在主内皮细胞(如。从老鼠大脑),HIF-1α可以降解效率等于在细胞核和细胞质。在这个细胞类型,HIF-1αnormoxia条件下存在于两个隔间,缺氧或re-oxygenation。此外,Myloniset al。45建议的活动水平增殖蛋白激酶(MAPK)途径有助于HIF-1α的特定类型细胞亚细胞分布。氨基酸残基被确定HIF-1α抑制域内,当磷酸化,增强核GFP-HIF-1α积累。因为MAPK通路活动高度连接到细胞的增殖状态,HIF-1α的分布可以在高度不同监管转变,快速增殖细胞和初级,生长缓慢的细胞。
HIF-1α相比,HIF-1复杂的β-subunit发现只在核间和受氧浓度影响。此外,HIF-1αHIF-1β积累和独立发生核转位,如图所示在HIF-1β-mutant免疫荧光小鼠肝癌细胞和胚胎干细胞36。然而,HIF-1β已被证明是不可或缺的绑定和transactivation HIF-1 DNA46。
细胞核内缺氧,内源性HIF-1α和HIF-1βcolocalised speckle-like结构,根据免疫荧光观察结合三维可视化研究47。这些speckle-like结构也观察到当ECFP-HIF-1α和EYFP-HIF-1βcoexpressed融合蛋白,但不是每个构造转染时,暗示这些结构是HIF-1复合物的场所48。使用收紧,观察到EYFP-HIF-1β移动速度比ECFP-HIF-1α(50%恢复后的荧光31年代与65年代相比,分别)当细胞cotransfected融合蛋白48。这表明子单元可以单独移动,因此,并不总是形成细胞核内HIF-1复合物。分析HIF-1α之间的相互作用和HIF-1βDNA-bound HIF-1复杂在活细胞中,森林或EYFP融合的n端或糖基长篇HIF-1子单元和受到烦恼分析。担心效率最高,因此最近协会的融合蛋白时观察到的森林和EYFP位于HIF-1α的n端和HIF-1β子单元,分别为(图3所示⇓)。的fluorophore-labelled N-termini HIF-1子单元的colocalised尽可能6.2 nm和c终端接近6.7纳米,甚至HIF-1复杂的N - c终端没有远比7.4海里48,这表明HIF-1复杂比此前认为的更加紧凑。此外,HIF-1α的亚核的分布/βheterodimerisation异构时捕捉到的敏感烦恼(图4所示⇓)。细胞核内的不同担心效率可能会从当地森林有害生物控制之间的平均距离的变化——而且EYFP-labelled HIF-1子单元。因为实验x射线晶体学数据的三维结构HIF-1复杂尚未公布,由于低溶解度的子单元49烦恼实验方法的选择,获得更多的见解HIF-1复杂的三维组织和其核分布在不同氧气浓度下活细胞。
在活的有机体内低氧诱导因子(HIF)分析1α和HIF-1β使用荧光共振能量转移(FRET)二聚作用。增强青色荧光蛋白(森林)-HIF-1α和增强的黄色荧光蛋白(EYFP) -HIF-1βcoexpressed在U2OS骨肉瘤细胞核和双光子激光扫描显微镜成像,而细胞缺氧。根据理论的烦恼,能量从供体分子(ECFP-HIF-1α)转移到受体(EYFP-HIF-1β)如果两个分子小于10纳米。烦恼从细胞核效率计算使用受体漂白方法。平均烦恼ECFP-HIF-1α和EYFP-HIF-1β交互效率取决于它们的相对表达各自的细胞核内。因此,分子之间的距离确定(6.2海里)当一个高原48。
亚核的分布的低氧诱导因子(HIF) 1α和HIF-1β二聚作用,分析了荧光共振能量转移(FRET)。U2OS骨肉瘤细胞转染与增强的青色荧光蛋白(森林)-HIF-1α和增强的黄色荧光蛋白(EYFP) -HIF-1β。在缺氧,融合蛋白在细胞核表达和烦恼是由激光扫描显微镜成像的。担心效率的分布在一个细胞核估计使用敏感烦恼的方法50想起在错误的颜色模式,颜色栏所示。亚核的变化为效率最有可能反映当地森林有害生物控制之间的平均距离的变化——而且EYFP-labelled HIF-1子单元。酒吧= 2μm规模。
此外,HIF-1-mediated转录需要招聘的辅活化因子,如海关与边境保护局/ p300和因素属于类固醇受体共激活剂(SRC) / p160家庭,建立转录活跃HIF-1 /共激活剂复杂9。Ruaset al。51表明colocalisation CFP-mouse-HIF-1α和YFP-CBP核积累焦点是依赖于C -的完整性和N-TADs HIF-1α,这与HIF-1-mediated转录的激活。进一步colocalisation CFP的研究或HIF-1αYFP融合蛋白,HIF-1β,CBP SRC-1表明CBP,除了与HIF-1α交互,也可以与HIF-1β交互,从而稳定的形成HIF-1α/β异质二聚体52。此外,海关与边境保护局发现调解之间的交互SRC-1 HIF-1α,表明CBP HIF-1 /共激活剂形成的中介9。
激活转录,以应对缺氧组织的方式,进一步的代数余子式必须招募HIF-1或HIF-1 /共激活剂复杂,如。肝细胞的核4激活转录促红细胞生成素的肝脏53。不久的将来会面临的挑战分析动力学和结构的组装HIF-1 /共激活剂/代数余子式multiprotein复合物在活的有机体内,通过收紧和烦恼的方法。
结论
免疫组织学和免疫荧光显示oxygen-labileα-subunits HIF-1和2几乎没有检测到成人的正常组织,尽管组织范围内的氧浓度3 - 5%。然而,积累HIF-α器官的早期发育过程中观察到,在应对缺血和肿瘤组织。HIF-1α和2α染色是异构的,只有部分重叠,这表明α-subunits不冗余,扮演不同的角色。通过表达GFP的控制下在肿瘤细胞中,一定是多细胞球状体或xenographs生活的老鼠,HIF-1转录活动已被证明是增加以应对缺氧或缺血。在缺氧条件下,HIF-1α显示局部在大多数细胞的细胞核,虽然在其他细胞HIF-1α也发现在细胞质中。表达不同的HIF-1αGFP融合蛋白在活细胞、亚细胞定位被发现细胞特定的和受HIF-1α的降解途径。
在细胞核内,HIF-1α和HIF-1β本地化speckle-like结构、交互的子单元。Heterodimerisation ECFP-HIF-1α和分析了EYFP-HIF-1β的活细胞使用收紧和烦恼的方法。HIF-1α之间的距离和1β融合蛋白被计算为6.2 - -7.4海里。此外,HIF-1-mediated转录需要招聘几个转录辅活化因子和组织HIF-1复杂代数余子式。
不久的将来会面临的挑战分析动力学和结构的组装multiprotein复合物参与低氧信号的转导在活细胞中,通过结合后荧光恢复photo-bleaching和荧光共振能量转移与非侵入性方法如双光子激光显微镜。
支持声明
这项工作获得金融支持从德意志Forschungsgemeinschaft(赠款FA225/18-2和FA225/19-2)和欧盟委员会(European Commission)在FP6(合同编号。利- ct - 2005 - 018725, PULMOTENSION)。j . Fandrey收到欧洲呼吸学会旅费出席第五届肺科学会议在陶尔米纳,意大利。188bet官网地址
感兴趣的语句
一份声明中对j . Fandrey可以发现www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.shtml
脚注
本系列之前的文章:没有。1:瓦格纳PD。氧的生物。欧元和J2008;31日:887 - 890。2号:周G,达达,Sznajder霁。肺泡上皮细胞功能调节缺氧。欧元和J2008;31日:1107 - 1113。
- 收到了2008年1月28日。
- 接受2008年1月31日。
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