摘要
许多全基因组连锁分析已经确定2q33.3-2q37.2区域最有可能包含导致慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性的基因。假设IV型胶原α3 (COL4A3)基因是位于2q33.3-2q37.2区域的基因之一,可能是COPD低外显率易感基因。
为了验证这一假设,将COL4A3在311例COPD患者和386例对照组的病例-对照研究中,研究了-1162T>C, IVS2+12C>A, P141L, G162E, H451R, P574L和*315C>A基因多态性与COPD风险的关系。
与451 H/H基因型相比,至少一个451R等位基因的存在与COPD风险显著增加相关(调整优势比1.48,95%可信区间(1.03-2.14))。当受试者根据年龄和COPD严重程度进行分层时,451R等位基因仅在患有严重COPD的年轻个体中与COPD风险显著较高相关(3.02(1.37-6.67))。
总之,这些发现表明IV型胶原α3基因有助于慢性阻塞性肺疾病的遗传易感性。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以进行性不可逆气流阻塞为特征的疾病,其原因是炎症导致小气道变窄,以及肺实质破坏导致肺弹性反冲丧失1.吸烟是慢性阻塞性肺病发展的唯一最重要的环境危险因素,但只有一小部分慢性吸烟者发展为有症状的慢性阻塞性肺病2- - - - - -4.这些观察结果,以及COPD的家族性聚类5,表明遗传因素有助于COPD的发展6- - - - - -8.基于已知或推测的COPD病理生理学,研究了与蛋白酶-抗蛋白酶假说、氧化剂-抗氧化假说、炎症反应、细胞凋亡和异种代谢相关的基因,但不同研究的结果往往不一致9.
许多全基因组连锁分析已经确定了可能包含导致COPD易感性的基因的染色体区域10- - - - - -13.2q33.3-2q37.2区域显示1秒用力呼气量比(FEV)比值评分>2.0的对数1)到波士顿早发性COPD研究家庭的强迫肺活量(FVC)10.染色体2q上的一个类似区域与FEV有关1在犹他州遗传参考项目中研究的家族/植被覆盖度比率12.此外,已有研究表明,2q33.3-2q37.2连锁区域含有通过基因-吸烟相互作用导致COPD易感性的基因13.该区域含有许多COPD候选基因,包括白细胞介素-8受体-α和-β,细胞色素P450家族成员CYP27A1, IV型胶原α3 (COL4A3)和溶质载体族11。
在COPD的位置候选基因中,目前的作者研究了该基因的潜在作用COL4A3COPD易感性的基因COL4A3是6个基因不同的同源α-链(COL4 A1-A6)之一,在正常的肺泡基底膜中大量表达14,15.它与COL4A4和COL4A5组装成三螺旋胶原蛋白分子,在调节细胞增殖、粘附、迁移和分化中起关键作用14,15.此外,COL4A3可以抑制中性粒细胞的激活。COL4A3增加中性粒细胞细胞质环磷酸腺苷,抑制其超氧化物生成和蛋白酶分泌16,17.此外,多项研究表明COL4A3可抑制内皮细胞增殖,诱导细胞凋亡18,19.综上所述,这些结果表明COL4A3可能通过调节炎症反应或肺泡壁凋亡参与COPD的发展20.- - - - - -22.
的几个多态性COL4A3基因都被存入了公共数据库23.虽然这些多态性的功能影响尚未完全阐明,但目前的作者假设,其中一些变体可能对COL4A3的表达或活性有影响,因此可能在调节COPD易感性方面发挥作用。为了验证这一假设,我们进行了一项病例对照研究,以调查两者之间的关系COL4A3基因型/单倍型与COPD风险的关系。
材料与方法
多态性的鉴定和选择
为了筛选所有潜在的功能性变体COL4A3Gene,公共数据库23用于在基因启动子区、所有外显子(包括内含子-外显子边界,内含子两侧20 bp)和3 ' -非翻译区寻找候选变异,因为这些区域的变异最有可能影响基因功能。共研究了7个多态性:-1162T>C (rs12613226), IVS2+12C>A (rs1882435), P141L(在外显子7;rs10178458), G162E(在外显子7;rs6436669), H451R(在外显子22;rs11677877), P574L(在外显子25;rs28381984)和*315C>A (rs2070735)。转录起始位点记为+1,翻译终止密码子的核苷酸3 '记为*124.多态性频率是在一项包括27名健康韩国人的初步研究中通过直接测序确定的。在获得每个个体的知情同意后收集样本,包括54条染色体,提供至少95%的置信水平来检测频率为>5%的等位基因。用于测序的引物集是根据GenBank参考序列(登录号:gdb)设计的。NT_005403)。序列变异已被两位独立作者证实。有关所有单核苷酸多态性(SNPs)、SNP id和等位基因频率的信息从国家生物技术信息中心dbSNP主页获得23.这7个snp在27名受试者中具有较小的等位基因频率>10%。P141L和G162E多态性为完全连锁不平衡(LD), |D’| = 1.00,r2= 1.00。因此,选择了6个snp进行关联研究:-1162T>C, IVS2+12C>A, G162E, H451R, P574L和*315C>A(图1)⇓).
研究人群
患者组包括2006年7月至2006年12月在庆北国立大学医院(大韩民国大邱)呼吸中心就诊的311名男性COPD患者。COPD是根据国家心肺血液研究所/世界卫生组织慢性阻塞性肺病全球倡议(GOLD)制定的标准进行诊断的。1.慢性阻塞性肺病的诊断标准为:咳嗽、呼吸困难等慢性呼吸道症状和体征;post-bronchodilator FEV1<预测值的80%;FEV1/ FVC < 70%;和FEV1吸入200 μg沙丁胺醇<支气管扩张剂前FEV的12%后的可逆性1.COPD的严重程度以FEV进行分类1根据GOLD制定的指南,预测为轻度(>80%)、中度(50-80%)、严重(30-50%)或非常严重(<30%)。386名对照对象是从同一时期到庆北国立大学医院健康检查中心就诊的765名男性中招募的。对照组的入组标准如下:年龄>岁45岁;无已知疾病和任何疾病史;而且没有气流限制。在718名符合这些标准的男性中,共有386人同意参加这项研究(参与率53.8%)。与拒绝参与的受试者相比,纳入的受试者表现出相似的年龄分布和吸烟暴露水平。病例和对照组均为居住在大邱市及周边地区的朝鲜族。
LightCycler基因分型
采用荧光标记杂交探针(LightCycler;罗氏诊断,曼海姆,德国)。使用Förster/荧光共振能量转移(FRET)技术,>基因型成功率为98%。使用ABI PRISM 3700遗传分析仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)直接测序对无法用FRET评分的样本进行重新基因分型。为了确保质量控制,所有基因分型分析都对病例/对照状态进行“盲”分析。此外,约10%的样本被随机选择,由不同的研究者再次进行基因分型,结果是100%一致的。
统计分析
对连续变量使用未配对t检验,对分类变量使用卡方检验,对病例和对照进行比较。Hardy-Weinberg平衡采用单自由度的卡方拟合优度检验。多态性对之间的LD强度用D′和r来测量2由Haploview25.LD块是从Gabriel提出的定义中推断出来的et al。26.使用无条件逻辑回归分析计算比值比(ORs)和95%置信区间(ci),并对可能的混杂因素(年龄和吸烟包年作为连续变量)进行了调整。在进行总体关联分析的基础上,根据年龄与COPD严重程度进行分层分析,进一步探讨两者之间的关联COL4A3各阶层COPD的基因型和风险。对于基因-吸烟相互作用分析,采用了三种方法来评估结果的一致性:1)对累积吸烟暴露的特定类别进行分层分析;2)联合基因型/单倍型吸烟效应;3)建立了包含基因型与吸烟相互作用项的logistic回归模型。在回归模型中,吸烟被认为是一个离散和连续变量:1)吸烟包年;2) pack-yrs的平方根;3)吸烟暴露水平,分为从不吸烟、轻度吸烟或重度吸烟。由于相互作用项在这些模型中均不具有统计学意义,因此仅在分析中使用连续累积吸烟剂量(吸烟包年)时才显示结果。在这些分析中,两组中一直吸烟的人根据包年值的中位数被分为两个亚组:一直吸烟≤33包年的人被认为是轻吸烟者,而一直吸烟> - 33包年的人被认为是重度吸烟者。
结果
本研究纳入病例和对照组的基线特征如表1所示⇓.FEV1和FEV1COPD组/FVC比值明显低于对照组。
6种基因型和多态等位基因频率COL4A3病例和对照组的多态性见表2⇓.对照组6个多态性的基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡。H451R位点多态等位基因的频率显著高于对照组(0.17与0.13;p = 0.02)。与451 HH基因型携带者相比,至少有一个451R等位基因的个体COPD风险显著更高(校正OR 1.48, 95% CI (1.03-2.14);p = 0.03)。研究的其他5个多态性的基因型分布在病例和对照组之间没有显著差异。
在根据年龄、吸烟状况和COPD严重程度对受试者进行分层后,进一步研究了H451R基因型与COPD风险的相关性(表3)⇓).当按中位年龄分层时,HR或RR基因型与年轻个体COPD风险显著增加相关(校正or 1.93, 95% CI (1.10-3.39);p = 0.02);然而,这些基因型与老年个体COPD风险之间没有显著相关性。当根据吸烟状况进行分层时,HR或RR基因型对吸烟者COPD风险的影响显著(1.57 (1.08-2.27);P = 0.02),但在从不吸烟的人群中没有。当根据中位数吸烟包年对长期吸烟者进行分组时,HR或RR基因型对重度吸烟者COPD风险的影响显著(1.84 (1.10-3.08);p<0.02),而在轻度吸烟者中,这些基因型与COPD风险之间没有显著相关性。当COPD病例按COPD严重程度进行分类时,一个或两个451R等位基因的存在与严重COPD风险显著增加相关(GOLD III-IV期;调整OR 1.62, 95% CI (1.00-2.61); p = 0.04), whereas there was no significant association between the H451R genotypes and the risk of mild-to-moderate COPD (GOLD stage I–II). When age and COPD severity were considered together, the effect of the HR or RR genotype was only significant in the younger individuals with severe COPD (3.02 (1.37–6.67); p = 0.006; p = 0.001 in test for homogeneity).
除分层分析外,还研究了H451R基因型和吸烟状况对COPD风险的联合影响(表4)⇓).以HH基因型不吸烟组为参照组,HR或RR基因型重度吸烟组COPD风险最高(校正or 9.51, 95% CI (3.93-23.01);p < 0.001)。然而,在多因素logistic回归分析中,H451R基因型与连续累积吸烟剂量之间的相互作用没有统计学意义上的证据(相互作用项p = 0.32)。
讨论
在本研究中,基因多态性之间的潜在联系COL4A3研究人员在韩国人群中调查了基因与COPD风险的关系。H451R多态性与COPD风险显著增加相关。H451R基因型与COPD风险之间的关联在年轻人和严重COPD患者中更为明显。这些发现表明COL4A3H451R基因多态性可能参与COPD的发生发展COL4A3基因可能是COPD遗传易感性的有用标记。
的COL4A3在本研究中,H451R多态性与吸烟相互作用以确定COPD风险。在吸烟者中,HR或RR基因型与COPD风险显著相关,但在从不吸烟者中不相关,这反映了基因-环境的相互作用。这种相互作用在生物学上是合理的,因为吸烟是慢性阻塞性肺病的主要原因。当前研究的另一个有趣发现是,H451R多态性与年轻患者的严重COPD有更明显的相关性,这与遗传因素在疾病早期发病中起主要作用的观点是一致的10,11.有异常的个体COL4A3运动可能更容易在年轻时患COPD;因此,在患有严重COPD的年轻患者中,这种关联将更明显地观察到。
尚待阐明的是COL4A3H451R多态性本身会影响蛋白质的折叠、相互作用位点、蛋白质的溶解性或稳定性,或与其他蛋白是否存在LDCOL4A3变异或相邻的真易感基因。一些计算算法已经被引入来预测非同义snp (nsSNPs)对蛋白质结构或功能的影响27.PolyPhen算法基于同源序列的三维结构和多次比对,通过预测氨基酸变化是否可能对蛋白质有害,从而识别功能重要的nsSNPs28.朱et al。29将PolyPhen应用于166项分子流行病学研究,以检验位置特异性独立计数(PSIC)评分与特定nsSNP相关OR之间的相关性。OR与PSIC评分差异、容差指数与PSIC评分差异呈显著负相关。这些结果表明PolyPhen有助于预测nsSNP的功能意义。本研究还使用PolyPhen来推断三者的功能相关性COL4A3研究的nssnp: G162E, H451R和P574L。这表明H451R多态性是唯一可能具有破坏性的,这与451R等位基因与COPD风险显著增加相关的发现是一致的。因此,这一发现在生物学上是合理的。
由于缺乏发表的证据表明COL4A3蛋白有助于COPD的发展,目前数据的解释受到限制。慢性阻塞性肺病的病理特征是小气道炎症和肺气肿。关于肺气肿的发病机制,最流行的假设之一是炎症细胞理论,该理论认为,香烟烟雾刺激炎症细胞,如中性粒细胞和巨噬细胞,释放蛋白酶,导致细胞外基质(ECM)和基底膜的破坏1,20.,30..另一种假说是细胞凋亡理论,该理论认为香烟烟雾降低了血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体-2的表达,导致上皮细胞和内皮细胞凋亡,随后失去ECM成分和肺泡单位23,31.COL4A3已被证明可以抑制中性粒细胞的活化,从而减少它们的超氧化物和蛋白酶的分泌,包括弹性蛋白酶和IV型胶原酶16,17.此外,多项研究表明COL4A3的非胶原结构域通过与整合素相互作用抑制血管生成,导致细胞凋亡18,19.因此,COL4A3可能通过调节炎症反应或细胞凋亡参与基底膜和ECM的降解,从而促进COPD的发展。然而,这一假设必须在未来的研究中得到验证。
COL4A3多态性可能对疾病进展有影响。而在本研究中,基因型分布无显著性差异COL4A3根据COPD严重程度的多态性。此外,COL4A3基因型与定量肺功能测量无显著相关性(数据未显示)。
综上所述,IV型胶原α3 H451R多态性与慢性阻塞性肺疾病的发病风险显著相关。这种关联似乎受到吸烟的影响。多态性对慢性阻塞性肺疾病风险的影响在患有严重慢性阻塞性肺疾病的年轻患者中更为明显。这些结果表明,IV型胶原蛋白α3基因可能通过基因-吸烟相互作用影响对香烟烟雾暴露的反应,从而导致慢性阻塞性肺疾病的遗传易感性。然而,由于这是第一个调查IV型胶原α3多态性与慢性阻塞性肺疾病风险之间关系的病例对照研究,因此还需要进一步的研究来证实这一发现。此外,IV型胶原α3在慢性阻塞性肺疾病中的功能作用还需要进一步的研究。
支持声明
本研究由韩国卫生和福利部的韩国健康21研究与发展项目(批准号:no。A060165),以及2006年“韩国智慧21计划”的部分成果。
权益声明书
没有宣布。
- 收到了2007年6月22日
- 接受2008年3月13日。
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