摘要
血管紧张素II是一种生长因子,在特发性肺纤维化(IPF)的生理病理中起关键作用。在血管紧张素原(AGT)的近端启动子区域,腺嘌呤取代鸟嘌呤(G-6A)的核苷酸替代,血管紧张素II的前体,已经与基因转录率增加有关。
为了研究AGT基因G-6A多态性是否与IPF的发生、严重程度和进展相关,本研究采用病例对照研究设计,对219例IPF患者和224例对照组进行G-6A基因分型。
G-6A基因型和等位基因的分布在病例和对照组之间无显著差异。AGT基因的G-6A多态性与诊断时的疾病严重程度无关。在控制了混杂因素后,A等位基因的存在与随访期间肺泡动脉氧张力差异的增加密切相关。与GA基因型(0.12±1 mmHg(0.016±0.133 kPa) /月)和GG基因型(0.2±0.6 mmHg(0.027±0.080 kPa) /月)相比,AA基因型(0.37±0.7 mmHg(0.049±0.093 kPa) /月)患者的肺泡动脉血氧浓度随时间的变化更高。
血管紧张素原基因G-6A多态性与特发性肺纤维化进展有关,但与疾病易感性无关。这种多态性在特发性肺纤维化患者中可能具有预测意义。
特发性肺纤维化(IPF)是慢性间质性肺疾病的一种特殊形式,其组织病理学特征为通常的间质性肺炎,并伴有不良预后1。IPF通过增加上皮细胞凋亡和伤口异常愈合导致肺结构丧失,随后是成纤维细胞灶形成和过度的肺胶原沉积。触发事件被认为是肺泡-毛细血管屏障的多个微观部位损伤,其中微血管内皮的破坏和肺泡上皮的凋亡和活化诱导促纤维化分子的分泌,从而导致持续的纤维化反应和疾病的进展2,3.。
IPF的最初原因尚不清楚;然而,它可能涉及环境和遗传因素之间的相互作用。尽管个体对肺纤维化易感性的基础尚不清楚,但IPF的家族聚集性已被描述,甚至在不同环境中长大的个体中也是如此4,5。在受影响的家庭成员中也观察到类似的基因突变6,7,以及散发性IPF的基因表达谱8,9。这些观察结果,再加上纤维原性药物,如石棉、胺碘酮或博来霉素,在所有暴露个体中都未能触发肺纤维化1提示遗传因素在肺纤维化的发生发展中起重要作用。在众多可能参与IPF易感性或进展的基因中,最有吸引力的目标可能包括影响肺泡上皮细胞活化和肺伤口愈合过程的介质基因8- - - - - -10。
血管紧张素(ANG) II是肺纤维化发病机制的重要介质。研究表明,ANG II可诱导肺泡上皮细胞凋亡,促进成纤维细胞增殖和肺胶原蛋白生成,增加转化生长因子(TGF)-β1合成11- - - - - -13。血管紧张素原(AGT)是ANG II的前体。与正常肺相比,IPF患者肺中AGT表达明显升高14。此外,与其他间质性肺疾病的基因表达谱相比,AGT已被发现是IPF肺中过度表达最多的基因之一8。AGT基础表达的适度增加可能导致基线ANG II生成的慢性升高。最近有研究发现,抑制AGT mRNA表达可减轻博莱霉素诱导的肺纤维化15。个体细胞因子产生的调控有一个主要的遗传成分。人类编码AGT的基因位于染色体1q42.3上,已经发现了大量的单核苷酸多态性(snp)。其中,对转录起始上游-6位的SNP G-6A核苷酸置换进行了重点研究。与A等位基因有关在体外随着AGT基因表达的增加和AGT合成的增加16。鉴于已证实的AGT与IPF之间的关系,本文作者假设AGT基因表达的变化可能参与了该病的发病机制。因此,本研究探讨了SNP G-6A是否与IPF的发生和进展有关。
材料与方法
主题
对照组由224名不相关的健康受试者组成(平均±sd年龄40±13岁;80名男性和144名女性),无相关疾病。来自西班牙的白种人受试者在四家不同的医院(医院Clínico和巴塞罗那的瓦尔德希布伦医院;马德里公主医院;和西班牙塞维利亚罗西奥圣母医院)。任何伴有潜在组织纤维化相关疾病的受试者均被排除在研究之外。在人类白细胞抗原基因分型研究中,西班牙人口的对照组的代表性已经得到证实17。IPF组219例无亲缘关系患者(年龄67.3±10岁;136名男性和83名女性)。IPF的诊断是根据美国胸科学会/欧洲呼吸学会共识声明建立的188bet官网地址1。219例患者中有89例(40.6%)获得组织学诊断。如前所述进行肺功能检查,使用的参考值来自本作者实验室18。肺泡-动脉氧张力差(P啊,很2)按标准公式计算,采用实际呼吸交换比19。IPF患者中,181例随访33±23个月;以下包括临床资料和肺功能的评估。受试者停止研究的主要原因是死亡。各参与医院的人类伦理委员会批准了这项研究,并获得了所有受试者的书面知情同意。
多态性和引物序列的鉴定
通过盐析程序从外周血白细胞中提取基因组DNA20.。采用PCR法检测各研究对象G-6A等位基因及基因型,引物为:5′-forward-GTC GCT TCT GGC ATC TGT CC-3′;5 ' -反向- ctt - CCT - CCT - CCT - AGC - CCA - CA-3 'PCR循环条件为:94°C 5 min,依次为35个循环,分别在90°C 30 s、65°C 30 s、72°C 45 s,最后在72°C延长7 min。产物用BstN I (NEB, Beverly, MA, USA)在60°C下消化2-3小时,然后在3%琼脂糖凝胶上电泳,得到以下产物:-6G: 173、86 bp, -6A: 119、86和55 bp。
统计分析
使用适当数量的自由度卡方检验,在对照组内的每个基因型都保持Hardy-Weinberg平衡21。病例组与对照组基因型和等位基因频率的差异采用Pearson卡方检验分析,资料经多次比较校正。以年龄和性别为协变量,对G-6A SNP基因型或等位基因效应的IPF数据进行logistic回归模型拟合。连续变量均值的差异用未配对t检验或Wilcoxon符号秩检验进行检验。通过ANCOVA检测IPF进展(肺功能测试随时间的变化)、治疗与基因型和等位基因类型之间的关系,调整诊断时肺功能的初始测量值。疾病进展的结果根据年龄、性别和吸烟变量进行调整。检验了模型残差的高斯-马尔可夫条件,排除了异常值,以确保模型的拟合。数据以平均值±表示sd。p值<0.05认为有统计学意义。
结果
IPF患者与对照组G-6A基因多态性
表1总结了AGT基因G-6A多态性的基因型和等位基因频率⇓。对照组与IPF患者基因型和等位基因频率差异无统计学意义(基因型:卡方= 1.25,p = 0.53;等位基因:卡方= 0.82,p = 0.36)。年龄和性别与IPF易感性有显著相关;男性(p<0.0087)和老年患者(p<0.0001)的发病风险较高。在调整患者的年龄和性别后,SNP基因型和-6ATG基因多态性的等位基因在IPF的发展中均不显著。对照组中G-6A基因多态性的基因型和等位基因频率与先前在白种人人群中描述的没有差异22。在男性和女性对照组中均未发现偏离Hardy-Weinberg平衡。没有证据表明性别和等位基因频率之间存在任何相互作用(p = 0.48)。在对照组和IPF人群中,等位基因在不同年龄组间的分布没有差异。因此,G-6A多态性与发生IPF的易感性无关。
IPF严重程度和疾病进展与G-6A基因多态性的基因型和等位基因频率有关
表2总结了IPF患者的呼吸功能特征⇓。基线肺功能测试结果在G和A等位基因之间无显著差异。同样,G-6A基因型与基线肺功能测试值也无显著相关性。
181例患者共监测33±23个月(3-114个月)。与其余38名患者失去联系。总体而言,患者表现出肺功能参数恶化(表3)⇓).随访期间肺功能测试的变化随时间变化,以比较患者之间的演变。肺功能检查的变化以月为单位除以整个随访期。男性和女性肺功能值的下降无显著差异(表3)⇓).共有130名监测患者接受糖皮质激素治疗,联合或不联合硫唑嘌呤或环磷酰胺N乙酰半胱氨酸。其余51名患者在监测期间未接受治疗。在评估的几个月内,治疗组和未治疗组的肺功能检查结果的变化没有差异(表4)⇓).
在a等位基因的存在和每月的增加之间有很强的联系P啊,很2(0.83±0.92 mmHg(0.11±0.12 kPa))与0.53±0.7 mmHg(0.070±0.093 kPa);p = 0.001)。携带A等位基因的患者在随访期间未接受治疗,死亡率更高P啊,很2与A等位基因患者相比(p = 0.01)。两组间差异有统计学意义P啊,很2AGT基因AA型患者(0.36±0.7 mmHg(0.048±0.093 kPa) /月)与GA基因型患者(0.12±1 mmHg(0.016±0.13 kPa) /月)以及GG基因型患者(0.2±0.6 mmHg(0.027±0.08 kPa) /月)随访期间的变化;P = 0.0015, P = 0.005;表5⇓).A、G等位基因患者随访时间(35.8±27.7个月)差异无统计学意义与(分别为31.7±19.8个月)。IPF患者携带G等位基因与较低的用力肺活量(FVC)恶化相关,但差异无统计学意义(p = 0.09)。随着时间的推移,G-6A基因型之间的植被覆盖度下降无显著差异(表5)⇓).肺对一氧化碳的扩散能力(DL,有限公司),DL,有限公司肺泡容积调节(K有限公司)在随访中发现基因型之间存在差异(表5)⇓).然而,更大的变化在K有限公司随着时间的推移,携带A等位基因的男性患者中观察到(p = 0.05)。
讨论
本研究首次证实了AGT基因G-6A多态性与IPF疾病进展之间的关系。结果表明,G-6A基因多态性与IPF易感性无关,因为患者与健康受试者之间的基因型分布和等位基因频率没有差异。然而,在AGT基因核心启动子-6位置存在A等位基因和AA基因型与IPF患者气体交换和肺功能恶化增加有关。这一发现提示了G-6A基因多态性作为IPF预后标志物的潜在用途,以预测不良结果并帮助选择适当的治疗干预措施。
已经在IPF患者中进行了几项研究,以发现遗传联系,从而更清楚地了解该疾病的发病机制,并提出治疗的目标途径10,23。IPF的病理生理可能是由多种遗传因素决定的,每种遗传因素都有助于疾病的发展10,23。根据不断发展的假设,IPF是伤口愈合受损的结果,涉及上皮/成纤维细胞途径2,许多候选基因的生长因子,以及涉及这一广泛过程的其他分子介质,已被评估24- - - - - -28。在IPF患者中分析的第一个候选基因与炎症反应有关。后来的研究集中在表面活性剂蛋白基因变异,t辅助细胞1/ 2型细胞因子多态性和参与上皮/成纤维细胞改变途径的生长因子。肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1受体拮抗剂、表面活性剂A和B蛋白以及补体受体1基因多态性与肺纤维化风险增加有关24- - - - - -28。Pantelidiset al。27IL-6和TNF-α受体II基因变异的共同携带与IPF27。TGF-β的存在1和IL-6多态性与IPF进展有关,因为它们与肺功能随时间的恶化有关25,27。
ANG II是一种生长因子,在不同器官的纤维化过程中发挥重要作用。它是肺纤维化发病的关键因素,因为它有助于伤口的异常愈合13。在体外和在活的有机体内研究表明,ANG II诱导上皮细胞凋亡,增加肺胶原沉积,增强TGF-β1合成11,13而其抑制或拮抗作用则可减弱实验性肺纤维化12。研究表明,Fas配体、TNF-α、博来霉素或胺碘酮诱导的肺泡上皮细胞凋亡需要ANG II的产生,而阻断ANG II的产生或受体相互作用可阻断细胞死亡11- - - - - -13。ANG转换酶(ACE)是参与ANG II合成的主要酶,在肺间质性疾病患者的支气管肺泡灌洗液中含量较高,在结节病纤维化期也观察到较高的ACE水平29。最近有研究表明,ANG II和AGT在IPF患者的肺部过表达,与肺泡上皮细胞凋亡和肌成纤维细胞有很强的联系14。有趣的是,用ANG II拮抗剂处理IPF成纤维细胞培养物可降低TGF-β1合成和肺胶原沉积13。
ANG II合成的遗传变异性可能导致识别具有较高风险的ANG II效应的受试者。本文作者研究了AGT基因核心启动子区域G-6A多态性,该区域是AGT表达和合成的主要调控因子16。发现G-6A多态性影响IPF患者的疾病进展。A等位基因的存在与AA基因型有很强的相关性P啊,很2随着时间的推移,梯度恶化。众所周知,IPF人群的肺功能下降率不是线性的,因此目前的研究结果无法评估这些患者的急性加重或没有随时间变化的时期。由于携带A等位基因和AA基因型与较高的AGT水平相关,因此很可能是ANG肽的增加影响了疾病的发展。先前在肝纤维化方面的研究已经描述了- 6aa基因变异与高级纤维化之间的正相关,尽管基因型频率与对照人群没有区别22。肺部疾病中ANG系统基因多态性的研究表明,在肺纤维化和导致同种异体干细胞移植的非感染性肺功能障碍中,ACE基因的D等位基因增加30.,31。因此,这些结果与本研究结果一起提示ANG系统基因变异可能参与间质性肺纤维化疾病。
综上所述,本研究结果提出了G-6A多态性在特发性肺纤维化患者的气体交换和肺功能恶化中发挥重要作用的可能性。目前的研究首次将血管紧张素原的遗传变异与疾病进展联系起来。了解这种多态性可能对特发性肺纤维化患者具有预测意义,并且医生可能能够对那些疾病进展高风险的患者使用更积极的治疗。
支持声明
由fisi - pi资助;FIS-PI060064, FIS-IDIBAPS CM05/00118, Sociedad Española de Neumologia y Cirugia Torácica (SEPAR)-Fundación呼吸科和西班牙资本学院。
利益声明书
没有宣布。
致谢
作者感谢K. Ziara在基因测试方面的帮助,以及M. Teresa Carrion和A. Fontana在血液样本收集方面的帮助。
- 收到了2008年2月2日。
- 接受2008年5月13日。
- ©ERS期刊有限公司