抽象gydF4y2Ba
尽管在急性肺损伤动物模型中抗氧化治疗取得了令人鼓舞的结果,但有效的临床抗氧化剂仍有待开发。本研究探讨了巯基抗氧化化合物阿米弗汀预处理对革兰氏阴性菌壁脂多糖(LPS)诱导的肺内皮屏障功能障碍的影响。gydF4y2Ba
通过内皮细胞电阻的变化来监测内皮细胞的通透性。用免疫荧光法检测细胞骨架重构和活性氧(ROS)的产生。用Western blot检测细胞信号转导。以支气管肺泡灌洗液中埃文斯蓝渗出、细胞计数和蛋白含量为指标gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba肺血管渗透性的参数。gydF4y2Ba
过氧化氢、LPS和白细胞介素-6引起细胞骨架重组,增加肺内皮细胞的通透性,反映内皮细胞屏障功能障碍。这些破坏性的效应被预处理抑制和amifostine amifostine-mediated有关废除ROS的生产和redox-sensitive信号级联,包括p38、细胞外信号调节激酶1/2,增殖蛋白激酶和核factor-κB通路。gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba与此同时,阿米福斯汀可以抑制lps诱导的氧化应激和p38丝裂原活化蛋白激酶的激活,这与减少血管泄漏和肺中性粒细胞募集有关。gydF4y2Ba
本研究首次证实了氨福汀对脂多糖诱导的肺血管泄漏的保护作用gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和脂多糖诱导急性肺损伤的动物模型。gydF4y2Ba
组织炎症的激活、氧化介导的组织损伤和血管泄漏的增加是急性肺损伤(ALI)和更严重的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)发病机制的主要特征。在这种情况下,肺细胞产生的活性氧和氮(ROS和RNS)可以氧化和硝酸肺关键蛋白和磷脂,抑制其功能,或激活氧化还原敏感的病理信号通路。炎性刺激,如细菌wall-lipopolysaccharide (LPS)、肿瘤坏死因子(TNF) -α和白介素(IL) 1、强有力的触发器的肺部炎症反应。同样的刺激也会引起氧化细胞应激反应gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。大量的证据表明,通过多种机制,细胞信号通路和细胞氧化还原状态之间存在串扰。例如,生成ROS,如HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,导致酪氨酸蛋白激酶、丝裂原活化蛋白(MAP)激酶及其下游效应物的激活gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。然而,活性氧也会损伤细胞。在炎症和感染部位,局部细胞环境富含活性氧、细胞因子和趋化因子。除杀菌剂作用外,ROS还可攻击和损伤宿主组织,从而参与ARDS、再灌注损伤等疾病的发病机制。ROS/RNS水平与疾病的结局及血管内皮和肺泡上皮损伤的严重程度相关。虽然抗氧化酶和ROS/RNS清除剂在减轻ALI严重程度方面的潜在作用已得到承认,但对潜在保护化合物的研究仍在继续。动物和细胞培养模型用于检测ALI环境中潜在的治疗化合物还有待开发。gydF4y2Ba
Amifostine (s [3-aminopropylamino] ethylphosphorothioic酸;WR-2721)是一种硫代磷酸,通过组织中碱性磷酸酶的脱磷作用转化为其活性的游离硫醇形式。它已被美国食品和药物管理局(FDA)批准作为一种细胞保护剂,用于降低头颈癌术后放疗患者中中度至重度口干症的发生率gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。作为能够参与细胞内的还原/氧化过程的还原剂,氨磷汀,具有影响氧化还原敏感的转录因子和基因表达,一旦在细胞内的电位gydF4y2Ba五gydF4y2Ba。因此,氨磷汀以往的研究主要集中在肿瘤放射治疗,在那里它作为氧化剂清道夫其辐射防护作用。然而,尽管最近的研究已经证明,在反对博莱霉素或辐射引起的肺毒性肺保护氨磷汀的潜在作用gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,它还没有被测试作为一个潜在的保护治疗败血症和内毒素诱导的ALI。化合物WR-2721是WR-1065稳定的非活性前体。注射时,WR-2721被内皮细胞中高表达的膜结合碱性磷酸酶修饰,转入具有生物活性的硫醇代谢物WR-1065,后者迅速渗透到细胞中,硫醇基团作为自由基清除剂,保护细胞不受氧化损伤。然而,内皮细胞是氧化剂的主要来源,可能有助于炎症部位的氧化环境。gydF4y2Ba
本研究的目的是测试FDA批准的复方氨福斯汀对脂多糖和炎症细胞因子诱导的内皮细胞(EC)屏障功能障碍的影响,gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba并测试其作为前处理的效率在防止内毒素诱导ALI在小鼠模型。目前的结果表明,氨磷汀的保护作用可以通过导致氧化应激和氧化还原敏感的信号传导级联,下调其抗氧化性能,其导致肺血管渗漏的衰减来介导。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
试剂和细胞培养gydF4y2Ba
除非另有规定,均购自Sigma(圣路易斯,MO,USA)获得的所有试剂,包括β - 肌动蛋白抗体(目录号A-5441)。氨磷汀化合物WR-1065(释放用于细胞培养实验硫醇形式)和WR-2721(前体药物制剂中所用gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba实验)从美国国家癌症研究所(贝塞斯达,MA, USA)药物合成和化学分部癌症治疗处获得。IL-6和IL-6可溶性受体(SR)分别来自研发系统(美国明尼阿波利斯市)。-钙粘蛋白抗体(目录号:sc-9989)购自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA),硝基酪氨酸抗体(catalogue No. 32-1900)购自Invitrogen (San Francisco, CA, USA)。磷酸化肌球蛋白轻链抗体(MLC;目录编号3674),p38(目录号9216),热休克蛋白(Hsp) 27 2401号(目录),MAP激酶激酶(MEK) 1/2(目录号9121),细胞外信号调节激酶(Erk) 1/2(目录号9101),核转录因子(NF) -κB-p65(3031号目录)和抑制剂(I)κBα(目录9246号)从细胞信号(美国贝弗利,MA)。免疫荧光染色所用试剂均购自分子探针公司(Eugene, OR, USA)。人肺动脉内皮细胞(HPAEC)取自克隆(Walkersville, MD, USA),按照制造商的方法培养,用于第5-9代。gydF4y2Ba
EC成像gydF4y2Ba
EC monolayers grown on glass coverslips were stimulated with an agonist of interest, washed twice with room temperature PBS and fixed in 3.7% paraformaldehyde solution in PBS for 10 min at room temperature. This was followed by double immunofluorescence staining with Texas Red-conjugated phalloidin, to visualise actin filaments, and VE-cadherin antibody to visualise EC adherens junctions. EC cytoskeletal organisation was analysed as previously described8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
跨内皮电阻的测量gydF4y2Ba
采用细胞-基质阻抗传感系统(Applied Biophysics, Troy, NY, USA)测量融合内皮细胞单层跨内皮细胞电阻,分析细胞屏障特性。细胞在小的金电极上培养(10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba cm2gydF4y2Ba),和培养基被用作电解质。使用电细胞 - 基底阻抗感测系统(应用生物物理学)中动态地测量跨过单层中的总电阻,并通过细胞的基底表面和电极,反光粘着斑的,和之间的电阻之间的组合电阻来确定细胞中,如先前所描述gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
检测活细胞中ROS的产生gydF4y2Ba
ROS的产生是使用Image-IT LIVE绿色活性氧检测试剂盒(分子探针公司)进行测定。Confluent EC monolayers grown in 12-well plate were pre-treated with an unprotected form of amifostine for 30 min (WR-1065; 4 mM) orñgydF4y2Ba-acetylcysteine for 1 h (NAC; 5 mM) followed by LPS stimulation for 6 h. After stimulation, cells were washed in 37°C Hanks buffer and incubated for 25 min with 1 mL of 25 µM carboxy-H2DCFDA working solution (37°C, protected from light). After washing three times in warm Hanks buffer, cells were subjected to microscopy using the Nikon video-imaging system (Nikon Inc., Tokyo, Japan) consisting of phase contrast inverted microscope equipped with a set of objectives and filters for immunofluorescence, and which was connected to a digital camera and image processor. In total, 10 fields were randomly chosen for each experiment condition. Immunofluorescence signal intensity was measured and expressed in arbitrary units per microscopic field.
Western blot分析gydF4y2Ba
从小鼠肺或EC裂解物的蛋白质提取物用SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上,随后用感兴趣的特异性抗体温育。等量蛋白上样被重新探测与抗β肌动蛋白抗体膜的验证。根据制造商的方案(Amersham Biosciences公司,小查尔方特,UK)使用增强化学发光检测系统中检测到免疫反应性蛋白质。免疫反应性蛋白条带的相对强度(相对密度单位)通过使用图像定量软件(分子动力学,桑尼维尔,CA,USA)扫描密度测定法定量。gydF4y2Ba
在活的有机体内gydF4y2Ba阿里的模型gydF4y2Ba
成年雄性C57BL/6J小鼠,8 - 10周龄,平均体重20-25 g (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA),腹腔注射氯胺酮(75 mg·kg)麻醉gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)和乙酰丙嗪(1.5 mg·kggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)。有限合伙人(0.7 mg·公斤gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba体重,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaO55: B5,溶于无菌水)或无菌水被注入了气管内的体积小(20 - 30µL)使用20量度导管(Penn-Century Inc .,费城,宾夕法尼亚州,美国)。虽然水是低渗的溶剂,它没有引起任何明显的损伤控制动物注射20μL无菌水,与未经处理的小鼠或老鼠注射相比20μL normotonic生理解决方案(数据未显示)。小鼠随机同时接受无菌生理盐水或氨福斯汀(wr - 2721,200 mg·kg)gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)腹腔注射给药,实验组:1)对照组;2) LPS (0.7 mg·kg)gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba);3) WR-2721 (200 mg·kggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba);和图4) LPS (0.7 mg·kg-1gydF4y2Ba) + WR-2721 (200 mg·kggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)。所有的动物实验都得到了芝加哥大学动物保护与使用委员会(美国伊利诺斯州芝加哥)的批准,用于实验动物的人道对待。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗液分析gydF4y2Ba
After 18 h, animals were sacrificed by exsanguination under anaesthesia. Tracheotomy was performed, and the trachea was cannulated with a 20-gauge注射。gydF4y2Ba导管,被绑在合适的位置。支气管肺泡灌洗(BAL)使用1 mL温无菌Hanks平衡盐缓冲液(30°C)。收集的BAL液以520×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃,20分钟;取上清液,-80℃冷冻,进行后续蛋白研究。然后将细胞球重悬于1 mL的红细胞裂解缓冲液中(ACK裂解缓冲液;Invitrogen),静置5分钟。使用红细胞裂解缓冲液从细胞微球中去除红细胞,因为细胞悬浮液中存在大量的红细胞可能会影响白细胞的计数。然后以520×离心重制白细胞gydF4y2BaggydF4y2Bafor 20 min at 4°C. The cell pellet was again resuspended in 200 µL of PBS, and 20-µL aliquots were taken for cell counting using a hemocytometer. In brief, 20 µL of cell suspension was mixed with 20 µL of Trypan blue and allowed to sit at room temperature for 5 min. Cells were loaded onto a hemocytometer and then counted under a microscope. The remaining 180 µL of cell suspension were re-pelleted by centrifugation, and cell pellets were stored at -80°C for subsequent detection of myeloperoxidase (MPO) activity. The BAL protein concentration was determined using a Bio-Rad DC protein assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), which allowed the reaction to reach 90% of its maximum colour development within 15 min and colour changes of not more than 5% in 1 h. The absorbance was measured at 750 nm, and protein concentration was determined using standard curves.
肺血管渗漏的埃文斯蓝评价gydF4y2Ba
依文思蓝色染料(EBD, 30 mL·kggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)在实验结束前2小时注射到颈外静脉,以评估血管泄漏。简而言之,实验结束时,行开胸手术,肺用含5mm EDTA的PBS无血灌注。用柯达数码相机(Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA)切除左肺和右肺并成像。成像后,肺被涂抹干燥,称重,在PBS(1毫升·100µg单一化gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba组织)和如前所述用于支气管组织中蓄积的定量分析gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。Briefly, homogenised tissue was incubated with two volumes of formamide (18 h, 60°C) and centrifuged at 12,000 ×ggydF4y2Bafor 20 min. Optical density of the supernatant was determined by spectrophotometry at 620 nm and 740 nm. EBD concentration (μg·g-1gydF4y2Ba肺组织匀浆中的组织)按标准曲线计算。gydF4y2Ba
肺损伤的组织学评估gydF4y2Ba
Left lungs were intratracheally instilled with 10% formalin from a height of 20 cm, immersed in 10% formalin for ≥24 h and then embedded in paraffin. After deparaffinisation and dehydration, the lungs were cut into 4-µm sections and stained with haematoxylin and eosin. Alveolar fluid accumulation and neutrophil infiltration as indices of lung leak and inflammation, respectively, were evaluated by bright field microscopy of lung tissue sections at ×40 magnification.
统计分析gydF4y2Ba
结果以均数±表示gydF4y2BasdgydF4y2Ba从3个到10个独立实验。用未配对t检验比较受刺激样本与对照组。多组比较采用方差分析(ANOVA),其次为gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba用了费雪检验。p值<0.05为差异有统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
在预防炎性激动剂诱导的通透性过高的氨磷汀的作用gydF4y2Ba
为了检验这一假设,氨磷汀,具有抗氧化性质的辐射防护化合物,可以减弱由抗炎剂引起的肺的内皮通透性过高,本作者研究氨磷汀对LPS和炎性细胞因子IL-6诱导的内皮通透性的影响。用H EC治疗gydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba用lps作为氧化应激的独立对照。HPAEC单分子层经细胞可渗透的游离硫醇形式的amifostine (WR-1065, 0.4-4.0 mM)预处理后,HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-诱导的EC通透性通过明显的跨内皮电阻降低来判断(图1a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。The maximal protective effect of amifostine was achieved at a concentration of 4 mM. Similarly, amifostine alone did not affect basal transendothelial resistance (TER), but inhibited EC hyperpermeability induced by LPS (fig. 1b⇓gydF4y2Ba)。阿米弗司汀在4毫米的常规使用gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究并演示无副作用细胞保护作用gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。为了比较,使用浓度NACgydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba是否在10-20毫米范围内gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
丁硫磷对HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-、脂多糖(LPS)-和白细胞介素(IL)-6诱导的内皮屏障功能障碍。在微电极上培养人肺内皮细胞(EC)。在指定的时间点(灰色箭头),细胞用WR-1065预处理30分钟。接下来是a) H的刺激gydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(250 mM), b) LPS (200 ng·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba) or c) combination of IL-6 (25 ng·mL-1gydF4y2Ba)及其可溶性受体(SR;100 ng·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)。随着时间的推移,对反映EC通透性变化的跨内皮细胞抗性进行了监测。合并了三个独立实验的数据。控制:黑色;HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba250 μM: pink; amifostine 4 mM+H2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba: 橙子;amifostine 1 mM+H2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba: 绿色;amifostine 0.4 mM+H2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba: 淡蓝;LPS 200 ng·mL-1gydF4y2Ba:灰色;4 mM+LPS:红色;4 mM:黄色;il - 6 + SR:紫色;amifostine 4 mM+(IL-6+SR):深蓝色。gydF4y2Ba
以前已经证明LPS气管内灌注可激活肺中IL-6的产生gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba, IL-6及其SR的结合增加肺EC通透性gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。氨福斯汀预处理EC可显著降低IL-6+SR刺激下TER的升高(图1c)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。总之,这些数据有力地表明抵抗由炎症诱导的激动剂EC屏障功能障碍氨磷汀预处理的保护作用。gydF4y2Ba
氨磷汀对内皮细胞骨架重构和粘着连接的破坏的炎症激动剂诱导gydF4y2Ba
在接下来的实验中,作者评估了阿米福斯汀对HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,LPS和IL-6与及其可溶性受体(IL-6 + SR)。激动剂挑战,细胞骨架重构和在控制和黏着连接的完整性后,氨磷汀,预处理肺EC通过免疫染色F-肌动蛋白进行了检查,VE-cadherin的。In unstimulated cells and cells treated with amifostine alone, F-actin was primarily organised into actin bundles randomly distributed in the cell (fig. 2a–h⇓gydF4y2Ba)。在H的刺激下gydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, LPS,或IL-6 + SR, F-actin被重组成更厚的应力纤维在细胞的中心。这些变化与细胞旁间隙的出现有关(箭头所示),表明EC屏障的破坏。值得注意的是,amifostine预处理可减弱激动剂诱导的应力纤维和间隙形成。与这些数据一致,肺EC与氨福斯汀的预孵育也能减弱HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-和脂多糖诱导的单层完整性的破坏,通过免疫荧光染色检测的VE-cadherin(图2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Bai n)。这些结果表明,丁福丁的保护作用可能是由于它能够减弱HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, LPS和IL-6。结果表明,丁福丁对HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-、LPS-或il -6诱导的高通透性也与细胞骨架和细胞连接组织的保存有关。gydF4y2Ba
Amifostine (Amif)可防止激动剂诱导的肺内皮细胞(EC)细胞骨架重构和粘附连接破坏。生长在玻璃器皿上的EC先用Amif 4mm预处理30分钟,然后用H刺激gydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba15分钟(250 mM),脂多糖(LPS) 6小时(200 ng·mL)gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba或白细胞介素(IL)-6+可溶性受体6小时(25 ng·mL)gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba和100 ng·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)。A-H)的肌动蛋白细胞骨架重构通过与德克萨斯红鬼笔环肽免疫荧光染色评估。细胞旁间隙形成由箭头指示。A-d)车辆,HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,LPS和IL-6,分别。E-H)AMIF,AMIF + HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, Amif+ LPS和Amif+IL-6。i-n) - VE-cadherin染色观察粘连连接。用箭头表示脂多糖诱导的粘附连接的破坏。i (k), HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和有限合伙人。l-n) Amif, Amif +HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和AMIF + LPS,分别。该小组是代表整个细胞单层的。三个独立实验的结果示。gydF4y2Ba
氨磷汀对脂多糖诱导ROS生成的影响gydF4y2Ba
为了验证amifostine可能通过清除ROS的能力减弱LPS诱导的EC细胞骨架重构和屏障功能障碍的假设,我们测量了LPS刺激的EC中ROS的产生,无论是否经过amifostine预处理。抗氧化剂NAC作为阳性对照。LPS治疗6小时后,肺EC中ROS的产生呈剂量依赖性增加,最大作用为500 ng·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba有限合伙人(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。氨福斯汀或NAC预处理显著降低了LPS产生ROS的能力。重要的是,amifostine更有效地抑制lps诱导的ROS生成。这些结果提示了阿米弗汀在预防HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba- ,LPS-或IL-6 + SR诱导EC屏障功能障碍可能介导,至少部分地通过其抗氧化活性。gydF4y2Ba
氨磷汀(AMIF)抑制活性氧(ROS)生产由脂多糖(LPS)诱导的。人肺动脉内皮细胞用A-C预处理)车辆中,d-f)中gydF4y2BañgydF4y2Ba-acetylcysteine (NAC; 5 mM, 1 h), or g–i) WR-1065 (4 mM, 30 min). This was followed by 6 h LPS stimulation of a, d and g) 100 ng·mL-1gydF4y2Ba、b、e、h) 200 ng·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba或c、f、i) 500ng·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba。ROS通过羧基-H检测gydF4y2Ba2gydF4y2BaDCFDA和羧基-HgydF4y2Ba2gydF4y2BaDCFDA -5-(和6) - 羧基-2',7'-二乙酸dichlorodihydrofluorescin荧光测定法,如在材料和方法中所述。结果代表了整个细胞单层并在三个独立的实验已经再现。j)条NAC和AMIF对LPS诱导的ROS产生的影响的统计分析。AU:任意单位。*:p<0.05, compared with 500 ng·mL-1gydF4y2BaLPS处理的内皮细胞;gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:P <0.005,与NAC或氨磷汀相比预处理EC。gydF4y2Ba
丁福丁对氧化应激敏感信号分子的调节作用gydF4y2Ba
ROS和相关的氧化应力被示出激活各种信号分子,如ERK1 / 2,p38的,JNK MAP激酶和NF-κB信号传导,这是密切参与EC渗透性和炎症的控制和由丝氨酸/苏氨酸磷酸化调节和酪氨酸残基。gydF4y2Ba
在接下来的一系列实验,目前作者调查的影响amifostine MAP激酶的调节,NF-κB-dependent由氧化应激信号激活。经免疫印迹分析发现,不论是否使用氨福汀,经预处理后的肺EC均有明显的LPS-、IL-6-和H的降低gydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-诱导Erk1/2和p38 MAP激酶级联的激活(图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),通过MEK1/2、Erk1/2、p38 MAP激酶和依赖p38的肌动蛋白动力学调节蛋白Hsp27的磷酸化检测。Amifostine大幅减毒LPS-induced IκBα磷酸化和NF-κB-p65单元(图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),这是至关重要的NF-κB-dependent转录的激活。同样的结果也出现在用HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(fig. 4b⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
氨磷汀(AMIF)衰减的细胞内信号通过炎症激动剂激活。Human pulmonary artery endothelial cells were pre-treated with Amif (4 mM, 30 min) or vehicle followed by stimulation with a) lipopolysaccharide (LPS; 200 ng·mL-1gydF4y2Ba,2 h), b) H2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(250mm, 15min),或c)白细胞介素(IL)-6 +可溶性受体(25ng·mL)gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba和100 ng·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba2 h)。p38磷酸化(p),增殖蛋白激酶激酶(MEK) 1/2,细胞外信号调节激酶(Erk1/2)抑制剂(我)κBα核转录因子(NF) -κB-p65,肌球蛋白轻链(多层陶瓷)和热休克蛋白(Hsp27)与相应phospho-specific抗体检测。结果代表了三个独立的实验。gydF4y2Ba
MLC磷酸化的增加与肌动蛋白聚合和肌动球蛋白收缩的激活有关。此外,炎症介质可能使肌球蛋白相关蛋白磷酸酶失活gydF4y2Ba14gydF4y2Ba从而进一步促进MLC磷酸化,内皮细胞收缩的标记。在下列实验中的当前作者分析对LPS,IL-6或H诱导的MLC的磷酸化氨磷汀的效果gydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba。Pre-treatment with amifostine significantly inhibited phosphorylation of MLC induced by these agonists (fig. 4c⇑gydF4y2Ba),这与氨磷汀的氧化应激和炎症的刺激下的EC屏障保护作用是一致的。gydF4y2Ba
综上所述,细胞培养实验的结果表明,p38的激活,Erk1/2 MAP激酶和NF-κB通路与EC压力反应炎症受体激动剂,并指出一个强有力的保护作用对EC amifostine氧化应激,屏障功能障碍和细胞骨架重塑。gydF4y2Ba
氨福司汀对脂多糖诱导的小鼠肺细胞浸润的影响gydF4y2Ba
目的:探讨阿米弗汀对肺通透性的调节作用gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba采用lps诱导ALI模型。药物前形式的氨福斯汀被用于gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba学习。LPS induced dramatic lung injury with a nearly 10-fold increase in BAL cell counts at 18 h (2.52±0.76×10五gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba与gydF4y2Ba2.46±0.33×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba,P <0.001;图。 5a⇓gydF4y2Ba)。氨福司汀(2.46±0.33×10)可抑制LPS引起的中性粒细胞流入肺内gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba与gydF4y2Ba1.22±0.24×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba,p < 0.001)。相应的,与单独使用脂多糖(37±8.5 U·mL)相比,经amifostine预处理后,作为活性中性粒细胞诱导的组织氧化应激和炎症标志物的MPO活性显著降低gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba与gydF4y2Ba148.3±61.4 U·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba(p < 0.01);图5 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Amifostine (Amif)可减弱脂多糖(LPS)诱导的中性粒细胞浸润,增加髓过氧化物酶(MPO)活性。用LPS (0.7 mg·kg)处理C57BL/6J小鼠gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba), with or without concurrent treatment with WR-2721 (200 mg·kg-1gydF4y2Ba) for 18 h. Control animals were treated with sterile water or WR-2721 (200 mg·kg-1gydF4y2Ba单独)。刺激后,测定对照组和实验动物的支气管肺泡灌洗(BAL)细胞数和MPO活性。n = 6-9每组。c-f) Control, Amif, LPS, LPS+Amif。肺切除,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,苏木精、伊红染色后进行组织化学分析。图像是代表6-9个肺标本的每种情况。* * *:p < 0.001gydF4y2Ba与gydF4y2Ba控制;gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:p < 0.001gydF4y2Ba与gydF4y2BaLPS。gydF4y2Ba
我们对使用苏木精和伊红染色的石蜡包埋的肺组织切片进行了组织学分析,以进一步研究amifostine对脂多糖诱导的肺微结构变化的影响。LPS刺激18 h后,肺实质中性粒细胞明显增多,经amifostine处理后明显减少(图5c-f)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。这些结果清楚地表明,amifostine可能抑制lps诱导的ALI。gydF4y2Ba
阿米福斯汀对脂多糖诱导的肺血管泄漏的影响gydF4y2Ba
在下面的研究中,检测了氨磷汀对LPS诱导的肺血管渗漏的效果。BAL蛋白质含量的分析用作肺血管通透性的指标。Intratracheal instillation of LPS significantly increased in the total protein concentration in BAL fluid (fig. 6a⇓gydF4y2Ba), as compared with control animals (0.14±0.04 mg·mL-1gydF4y2Ba与gydF4y2Ba1。01±0.13 mg·mL-1gydF4y2Ba,p < 0.001)。与单独使用LPS(0.46±0.12 mg·mL)相比,LPS和amifostine可显著降低BAL蛋白浓度gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba与gydF4y2Ba1。01±0.13 mg·mL-1gydF4y2Ba,p < 0.001)。有没有在缺少LPS在BAL蛋白无显著差异氨磷汀治疗的动物和控制。gydF4y2Ba
阿米福汀(Amif)可减弱脂多糖(LPS)诱导的肺血管泄漏。用LPS (0.7 mg·kg)处理C57BL/6J小鼠gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba), with or without concurrent treatment with WR-2721 (200 mg·kg-1gydF4y2Ba) for 18 h. Control animals were treated with sterile water or WR-2721 (200 mg·kg-1gydF4y2Ba单独)。a)测定对照组和实验动物支气管肺泡灌洗液中的蛋白浓度。b)肺血管通透性采用材料和方法中描述的Evans蓝在肺中的积累进行评估。每组3人。c-f) Control, Amif, LPS, LPS+Amif。肺部图像显示埃文斯蓝漏入肺组织。结果代表了三个独立的实验。埃文斯蓝标白蛋白外渗的定量分光光度分析。* * *:p < 0.001gydF4y2Ba与gydF4y2Ba控制;gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:p < 0.001gydF4y2Ba与gydF4y2BaLPS。gydF4y2Ba
对LPS诱导的肺血管屏障折衷氨磷汀的保护作用通过伊文思蓝泄漏的测量进行进一步评估到肺组织。LPS caused substantial Evans blue leakage from the vascular space into the lung parenchyma, which was significantly decreased by amifostine treatment (fig. 6c–f⇑gydF4y2Ba)。这些结果通过定量分析Evans蓝标白蛋白在肺制剂中的渗漏得到了证实(图6b)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。Evans blue accumulation in the lungs from LPS-treated mice was significantly increased (16.95±3.46 μg·g-1gydF4y2Ba肺湿重gydF4y2Ba与gydF4y2Ba6.63±0.40μg·ggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba未处理组肺湿重p<0.001。LPS-induced组织积累的伊文思蓝降低了amifostine治疗(8.77±1.48μg·ggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba肺湿重gydF4y2Ba与gydF4y2Ba16。9五±3.46 μg·g-1gydF4y2Ba湿重肺,P <0.001)。因此,该数据表明在LPS诱导的血管通透性的小鼠模型氨磷汀保护作用。gydF4y2Ba
amifostine对lps诱导的氧化应激敏感信号转导的影响gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba
目前的作者然后检查了阿米弗汀的保护作用gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba与它的抗氧化性能有关。lps诱导ROS生成,一氧化氮(NO)合酶激活,NO生成增加,导致NO与超氧化物快速反应,生成过氧亚硝酸盐gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,导致蛋白质酪氨酸残基硝化。因此,含有硝化酪氨酸残基的蛋白质的存在可以作为氧化应激的一个标志gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba包括在ARDSgydF4y2Ba16gydF4y2Ba。对LPS-和amifostine+LPS处理的小鼠的肺组织样本进行Western blot分析,以检测酪氨酸硝化蛋白的存在。LPS处理增加了肺组织样品中含硝基酪氨酸蛋白的含量,在25kda和50kda范围内主要存在条带,经amifostine处理后显著减弱(图7a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,上半部分)。LPS刺激6 h后,主要检测到50 kDa范围内的含硝基酪氨酸蛋白。氨福汀预处理显著降低了脂多糖诱导的蛋白质硝化。此外,amifostine显著减弱了lps诱导的p38 MAP激酶磷酸化(图7a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,中图)。这些结果强烈表明,氨磷汀的保护作用gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba与lps诱导的氧化应激和氧化还原敏感性应激激酶信号通路的减少有关。gydF4y2Ba
Amifostine (Amif)抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠肺部氧化应激敏感信号转导。a和b)用LPS (0.7 mg·kg)处理C57BL/6J小鼠gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba), with or without concurrent treatment with WR-2721 (200 mg·kg-1gydF4y2Ba)。对照组用无菌水或WR-2721 (200 mg·kg)处理gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba单独)。2 ~ 6h灌注LPS后取小鼠肺组织,准备组织标本进行western blot分析。使用特异性抗体检测硝基酪氨酸蛋白和p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化的积累。证实了平等蛋白质加载re-probingβ-actin抗体的膜。结果代表了三个独立的实验。gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:P <0.005。c和d)对支气管肺泡灌洗(BAL)LPS诱导的中性粒细胞聚集和蛋白质含量AMIF效果的剂量依赖性。Mice were treated with LPS (0.7 mg·kg-1gydF4y2Ba), with or without concurrent treatment with the range of WR-2721 doses (25–200 mg·kg-1gydF4y2Ba)。刺激18小时后,在对照组和实验动物的BAL液中测定c)细胞数和d)蛋白浓度。n = 6-9每组。相对密度单位。* * *:p < 0.001gydF4y2Ba与gydF4y2Ba控制;gydF4y2Ba#gydF4y2Ba: p<0.001 100 mg·kggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba与gydF4y2Ba20.0 mg·kg-1gydF4y2Bawr - 2721。gydF4y2Ba
接下来的实验在肺血管泄漏的LPS模型中测试了阿米弗汀保护作用的剂量依赖性。Amifostine对lps诱导的BAL细胞计数增加有保护作用(图7c)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba) and protein content (fig. 7d⇑gydF4y2Ba)在25-200 mg·kggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba剂量范围。Remarkably, even low doses of amifostine (25 mg·kg-1gydF4y2Ba)对BAL蛋白积累的保护作用接近最大,而对BAL细胞积累的抑制作用在200 mg·kg剂量时达到最大gydF4y2Ba-1gydF4y2Baamifostine。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
虽然生理条件下产生的活性氧在细胞内稳态和细胞信号转导中起着重要的作用gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,其过度产生炎症部位变得不利,并可能导致组织损伤。血管内皮,其调节从血液大分子和循环细胞的组织的通道,变得易于暴露于氧化应激和起着几个血管疾病的病理生理学中起关键作用。本研究表明,氨磷汀,其充当活性游离硫醇的供体,抑制LPS诱导的内皮单层的破坏和衰减LPS诱导的肺血管渗漏gydF4y2Ba通过gydF4y2BaROS的下调和组织氧化应激。gydF4y2Ba
LPS是参与肺水肿和急性呼吸窘迫综合征的发病机制中的肺部炎症的重要触发因素。通过结合其受体,CD14,在细胞膜上,LPS诱导促炎细胞因子的释放。作为LPS刺激的结果,激活的中性粒迁移到从血液循环肺间质,并产生大量显著ROS导致炎症的进一步升级。活化的内皮细胞可能是ROS在炎症部位有助于形成一个丰富的氧化剂的环境形成的另一个重要来源。目前的结果显示显著ROS的产生由LPS诱导的肺EC。此外,HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba- ,LPS-和IL-6诱导的应力纤维形成和肺EC单层粘着连接的破坏是由氨磷汀防止。在本研究中观察到的氨磷汀的屏障保护作用与它的能力来抑制ROS产生和衰减氧化还原依赖性促炎症信号传导在EC培养物和LPS诱导的ALI的鼠模型。gydF4y2Ba
NF-κB redox-sensitive转录因子激活LPS刺激后,触发炎症信号并激活促炎细胞因子的表达。目前的数据表明,有效的抑制效应amifostine预处理在LPS-induced NF-κB激活。Erk1/2 p38激酶通路/ mk 2地图和NF-κB redox-sensitive的方式可能会激活gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。此外,p38MAP激酶可能参与肌动蛋白丝重组响应于氧化应激gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba肌动蛋白结合效应蛋白Hsp27的MAP激酶依赖性磷酸化。本研究表明,p38和Hsp27的磷酸化是由LPS或H引起的gydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba被减弱阿米福汀gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba。此外,阿米弗汀预处理可消除LPS-、HgydF4y2Ba2gydF4y2BaØgydF4y2Ba2gydF4y2Ba- 和IL-6诱导的调节性MLC,其触发EC收缩和屏障功能障碍的激活。炎性细胞因子IL-6是内毒素诱导的肺损伤的模型升高炎症的标志物gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。可溶性IL-6受体(可溶性IL-6 receptor, SR)是一种50-55 kDa的配体结合蛋白,可与其配体结合,通过与gp130的结合诱导细胞反应,从而发挥IL-6激动剂的作用。协会与可溶性白介素SR-α形式能够诱发细胞只表达膜生物反应gp130。以前曾有报道,IL-6或其SR单独处理HPAEC不会显著改变基础TER水平,而IL-6和SR联合处理则会显著降低TER水平gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。在本研究中,我们采用IL-6及其SR联合治疗来重现肺内皮的炎症反应。在这些实验中,IL6/ sr诱导的EC屏障功能障碍、细胞骨架重构和p38 MAP激酶靶蛋白Hsp27的磷酸化被amifostine减弱(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和图4gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。综上所述,这些结果表明lps诱导的氧化应激在激活炎症信号和细胞骨架重构导致EC通透性和肺血管泄漏中起重要作用,而amifostine预处理可显著减弱EC通透性和肺血管泄漏。gydF4y2Ba
Western blot detection of nitrotyrosinated proteins, a footprint of oxidative stress, showed increased lung tissues levels of nitrotyrosinated protein immunoreactivity after 2 and 6 h of LPS exposure, which were markedly attenuated by amifostine (fig. 8⇓gydF4y2Ba)。抗氧化策略的肺炎症损伤的衰减已在以前的研究中测试。例如,NAC,一种硫醇类抗氧化剂化合物,表现出抗氧化作用并抑制ros介导的肺损伤gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。类似于氨磷汀,NAC减毒p38和MAP激酶激酶(MKK)3 / MKK6中的EC屏障功能障碍的TNF-α模型的活化gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。然而,NAC在临床的应用并没有证明其有效性。在纤维性肺泡炎中,活化的炎症细胞诱导下呼吸道的氧化应激,高剂量的NAC(12周内每天1.8 g,外加免疫抑制治疗)并不能显著抑制炎症细胞的活化gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。北欧多中心对照试验gydF4y2Ba23gydF4y2Ba结果显示,6天的课程gydF4y2Ba注射。gydF4y2Ba出生后第一周的NAC不能预防支气管肺发育不良或死亡,也不能改善出生时体重极低的婴儿的肺功能。尽管先前的研究表明,amifostine对辐射(或化疗)诱导的急性肺毒性具有保护作用,但在内毒素诱导的ALI模型中,没有直接证据表明amifostine具有保护作用。目前的研究结果表明,阿米福斯汀对脂多糖诱导的肺EC屏障损伤具有较强的保护作用gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和LPS诱导的肺白细胞浸润,BAL蛋白的积累和血管渗漏。氨磷汀抑制LPS诱导的白细胞汇集在BAL中以剂量依赖的方式。A maximum protective effect was achieved at 200 mg·kg-1gydF4y2Ba。然而,在较低剂量(25 mg·kg)时仍能观察到明显的保护作用gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba),其不引起毒性副作用。A dose of 910 mg·m−2gydF4y2Baamifostine最初用于临床化疗研究。在这个浓度,副作用包括恶心,呕吐,低血压和低钙被记录。在目前的研究中,我们观察到,即使在没有副作用的情况下,阿米弗斯汀对肺损伤的保护作用也显著降低了阿米弗斯汀的剂量。这些结果提示阿米弗丁可能用于临床治疗ALI综合征。与包括NAC在内的其他抗氧化剂相比,amifostine的另一个优点是在不同的给药途径上具有相当的效率。对于大多数抗氧化剂来说,最有效的方法是静脉注射。相比之下,氨福司汀在皮下注射和静脉注射时的效果差不多gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,以及腹腔内gydF4y2Ba25gydF4y2Ba管理。gydF4y2Ba
阿米弗汀抑制脂多糖(LPS)诱导的炎症反应和内皮屏障功能障碍。肺暴露于LPS可激活toll样受体(TLR)4gydF4y2Ba通过gydF4y2BaLPS与LPS结合蛋白(LBP)和磷脂酰肌醇糖结合细胞表面蛋白CD14结合。随后,LPS-CD14复合物与TLR4及其附属蛋白MD2相互作用。lps诱导的另一种信号通路可能涉及到小凹gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。lps - signaling complex在caveolae中组装,细胞内的适配器蛋白MyD88和MAL被募集到Toll/interleukin (IL)-1受体TLR4的胞质结构域,导致tlr介导的信号通路的激活。LPS通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、一氧化氮合酶、黄嘌呤氧化还原酶等酶来刺激活性氧和氮的产生(分别为ROS和RNS),从而导致细胞氧化应激。因此,激活redox-sensitive信号级联,包括核转录因子(NF) -κB、磷酸化(p)细胞外信号调节激酶(Erk) 1/2和p-p38增殖蛋白激酶(MAPKs),触发细胞反应有限合伙人,如促炎细胞因子的表达升高,细胞骨架改建和破坏内皮单层完整性导致急性肺损伤。Amifostine可降低脂多糖诱导的炎症信号gydF4y2Ba通过gydF4y2BaROS和RNS失活,氧化还原敏感性炎症信号变弱。NF-κB Iκβ:抑制剂;IκβIκκ:抑制剂;MEK:丝裂原激活蛋白激酶激酶;MAPKAPK: mapk活化蛋白激酶;Hsp27:热休克蛋白27;肌球蛋白轻链。gydF4y2Ba
多项证据表明,内皮细胞是亚胺硫蛋白吸收和转化为其活性形式的主要场所。WR-2721可能是被膜结合的碱性磷酸酶修饰,该酶在内皮细胞中高度表达,并转移到硫醇代谢物WR-1065中。WR-1065能迅速渗透到细胞中,在细胞中,巯基作为自由基清除剂,保护细胞免受氧化损伤gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。然而,肺内皮细胞和上皮细胞是肺内氧化剂的主要来源,并可能是维持炎症部位富含氧化剂环境的重要因素。根据当前数据,目前的作者推测amifostine的强有力的保护作用LPS-induced血管泄漏可能归因于其本地激活肺微血管内皮细胞在肺部发炎,导致增加的能力阻止肺微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞由氧化剂攻击。gydF4y2Ba
与NAC的中性电荷相比,Amifostine是一种带负电荷的硫醇,后者允许Amifostine在线粒体内和带负电荷的DNA周围聚集。这种效应称为硫醇模型的净电荷。带负电荷的硫醇比中性或带正电荷的硫醇具有更高的保护电位gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。事实上,氨磷汀辐射曝光比NAC细胞保护过程中表现出在细胞中直接和更有效的效果gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。amifostine第二保护机制和南汽的行动是能够激活NF-κB由于硫醇基,提高细胞内抗氧化锰过氧化物酶的基因表达dismutlase (MnSOD)。与NAC相比,Amifostine在同等摩尔基础上对MnSOD表达的刺激效果更高gydF4y2Ba五gydF4y2Ba。其结果是,该激活导致增强的抗性对辐射诱导的ROS,并且还可以有助于氧化应激在慢性炎性肺损伤的减少。这些研究结果有力地表明,氨磷汀可以与病理ROS产生伴随LPS诱导的肺损伤相关的临床设置表现出比NAC更有效的保护作用。相较于NAC,氨磷汀已在放射治疗处理过程中的辐射防护和细胞保护治疗被FDA批准。这些特点使氨磷汀潜在的临床试验更具吸引力的化合物。gydF4y2Ba
综上所述,本研究证实了阿米弗汀预处理对lps诱导的肺损伤模型的有效保护作用gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba肺EC屏障功能障碍gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba衰减的氧化应激,抑制redox-sensitive MAP激酶,NF-κB炎症级联,衰减LPS-induced EC粘连导致的细胞骨架改建和中断保护EC单层完整性(图8所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。氨磷汀目前用作抗电离辐射的毒性效应的细胞保护性化合物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
虽然氨磷汀各种给药方案的严格测试,仍然需要,本研究的结果表明,对于第一次,氨磷汀可以被认为是急性肺损伤综合征与病理海拔相关的更广泛的预防治疗活性氧的产生和氧化应激,gydF4y2Ba即gydF4y2Ba脂多糖引起的炎症和缺血/再灌注。gydF4y2Ba
支持声明gydF4y2Ba
这项工作是由来自ALA载波研究员奖K.G.资金支持Birukov;NIH / NHLBI PO1-058064为K.G.Birukov和J.G.N.加西亚;和NIH / NCI RO1 CA99005和DDE格兰特DE-FG02-05ER64086的D.J.Grdina。gydF4y2Ba
利益声明gydF4y2Ba
无声明。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者要感谢N. Moldobaeva提供的高级技术援助。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2008年1月30日。gydF4y2Ba
- 公认gydF4y2Ba2008年10月8日。gydF4y2Ba
- ©ERS杂志有限公司gydF4y2Ba
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