抽象
外源性表面活性应用的最佳定时,以减少肺损伤和功能障碍的大鼠肺局部缺血和再灌注损伤模型进行了研究。
Lungs were subjected to flush perfusion, surfactant instillation, cold ischaemia (4°C, 4 h) and reperfusion (60 min). Animals received surfactant before (group 1) or at the end (2) of ischaemia, or during reperfusion (3) or not at all (4). Control groups included “worst case” without Perfadex and surfactant (5), “no injury” without (6) or with surfactant (7), and ischaemia with pre-ischaemic surfactant (8). Intra-alveolar oedema and blood–air barrier injury were estimated by light and electron microscopic stereology. Perfusate oxygenation and pulmonary arterial pressure (P巴勒斯坦权力机构1 ~ 4组再灌注时测定。
肺泡内水肿组1,6,7和8几乎不存在,在2,3和4中显着,并在第5血 - 气屏障损伤严重在组1和图8,在2,3和略微显着温和4,在5广泛而6和7灌注液氧合几乎不存在在第1组显著高于组2〜4相比较。P巴勒斯坦权力机构两组之间没有区别。
总之,外源性表面活性衰减肺泡内水肿形成和血 - 气屏障损害和改善了在大鼠肺灌洗液氧合作用,特别是当存储缺血之前施加。
尽管在人类肺移植中肺保存的改善已经取得了很大的进展,但缺血后原发性移植物功能障碍(PGD)仍然是移植后早期的一个主要问题1,2。PGD的主要原因是缺血/再灌注(I/R)损伤,临床上表现为轻度急性肺损伤(ALI)到严重急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。I/R损伤与短期和长期发病率和死亡率的增加有关1,3,4。在I/R损伤过程中,移植物器官发生结构性损伤,如间质和肺泡内水肿的形成和血气屏障完整性的丧失五,6。另外,肺表面活性剂体系受到严重缺血再灌注的影响,导致水肿和atelectases发展7-11。
几个实验12-21和临床22-24研究表明,外源性表面活性剂治疗成功地补充了内源性表面活性剂系统的不平衡,减轻了I/R损伤,有效地改善了肺的保存和移植功能11。在人肺移植供体的外源性表面活性治疗的巨大优势是,PGD在这种情况下可以精确地预测的事实,因此,甚至能够防止,从而提供用于预防性治疗的表面活性剂有前途的方法11,25,26。不过,也有中或在相同的实验设置缺血后比较应用程序预缺血性表面活性剂处理没有系统的研究。当前作者假设,外源性表面活性应用的相对于局部缺血的发作的定时影响肺的结构保存。
因此,本研究旨在确定外源性表面活性剂治疗供体肺的最佳时机。采用体外I/R损伤大鼠肺模型,结合光镜和电镜方法和基于设计的立体学27,28中,向其中发生了血 - 气屏障的肺泡内水肿和损伤的程度进行了研究。
材料和方法
实验设置
总共40只雄性Sprague Dawley大鼠(平均值±SDbody weight 371±57 g) were used in the study. All animals received humane care and were treated according to the实验室动物的护理和使用指南29并符合当前德国和瑞士的法律。图林根地区的生物伦理委员会,德国批准了实验。
腹腔注射戊巴比妥(每100克体重12毫克)后,暴露气管,气管内插管。启动机械通气,提供5 mL潮气量的室内空气,40次呼吸·min−1,呼气末正压3cmh2Ø(0.3 kPa), followed by a median laparotomy and systemic heparinisation. Following this, a bilateral longitudinal thoracotomy and puncture of the pulmonary trunk were carried out. Flush perfusion of the lung was initiated with 24–27 mL Perfadex® (60 mL per kg body weight) at 4°C, maintaining a perfusion pressure of 20 cmH2Ø(2.0 kPa).
在此之后,上,下腔静脉和左奇静脉用夹子固定。心脏和肺被切除全体用卡紧的气管和储存易地在30-40毫升保存液中,4℃保存4小时(即缺血时间)。Lungs were treated with instillation of the exogenous surfactant preparation poractant alfa (Curosurf®, 200 mg/kg body weight; a kind gift from Nycomed Pharma GmbH, Linz, Austria) according to the experimental setting. Before instillation of exogenous surfactant, the lungs were once inflated at a pressure of 23 cmH2Ø(2.2 kPa) in order to recruit potentially collapsed regions of the lung三十。Surfactant drawn up in a syringe in a volume of 4–5 mL air was then carefully instilled通过气管插管。再次进行肺泡招聘程序,以确保表面活性剂达到肺部的肺泡区和正常通气后重新启动。组织学肺切片的后实验可视化用于证实外源性表面活性剂在肺中均匀分布。使用由Fukuse详细描述的体外心脏肺电路进行体外再灌注et al。31。简而言之,电路包括一个储存器,温度探针(用于灌注液温度监测),一个滚子泵,以提高灌注液至充氧器,血液过滤器和两个薄膜充氧的。A perfusion pool was used at 80 cmH2Ø(7.8 kPa) and a preload pool at 5 cmH2O (0.5 kPa)。采用小型动物呼吸器进行机械通气。灌注包括Krebs-Henseleit缓冲液,补充牛红细胞浓缩物(红细胞压比38-40%),在与上述相同的通风条件下,使用quattro头辊泵(mode - reglo - digital;瑞士苏黎世,Ismatec)。
将动物随机分配到八个不同的组(每组5只动物)。实验组包括:第1组,其接收到的初始表面活性剂滴注,冲洗灌注,局部缺血和再灌注;组2,将其冲洗灌注,随后表面活性剂滴注在缺血结束时,再灌注;group 3, which was flush perfused, then stored under ischaemia and finally reperfused while a bolus of surfactant was applied after 20 min of reperfusion; and group 4, which was flush perfused, stored under ischaemia and reperfused without receiving surfactant. Additional groups included: group 5, which was flush perfused with 0.9% NaCl solution, followed by ischaemia and reperfusion as “worst case” control; group 6 was fixed原位后立即切除为“无伤害”控制之前冲洗灌注;组7,用表面活性剂之前,冲洗和灌注固定治疗;and group 8 received surfactant before flush perfusion, followed by ischaemia (fig. 1⇓)。
![图。1-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/33/3/625/F1.medium.gif)
实验方案的概述。▾:表面活性剂滴注;▪:与perfadex平齐;░: ischaemia (4 h at 4°C); □: reperfusion (60 min at 37°C); ▒: flush with NaCl.
功能数据的测量
肺动脉压(P巴勒斯坦权力机构)和氧合记录在再灌注过程中,如前所述五。充氧灌流的定义为充氧后从左心房采集的灌流与预负荷池的去氧灌流氧张力的差值,用于评估气体交换能力。P巴勒斯坦权力机构(; PVB MEDIZINTECHNIK,Kirchseeon的,德国的Statham)通过压力换能器来确定。
固定,取样和组织处理
固定,取样和组织处理如先前所述进行27,32,33。Ťhe left lung was fixed by vascular perfusion of a fixative containing 4% paraformaldehyde and 0.1% glutaraldehyde in 0.2 M HEPES buffer. Afterwards, the main bronchus and artery were clamped and the left lung was excised and stored in 4°C cold fixative.
总肺体积通过流体位移确定。Ťhen the lungs were embedded in agar and sectioned from apex to base using a tissue slicer into 9–12 tissue slices of 3 mm thickness. Systematic uniform random sampling was used to obtain representative tissue blocks for stereological analysis27。用每隔一个的切片用于光(LM)或电子显微镜(TEM),分别传输。对于TEM,小样本从肺片通过在每个切片中的透明均匀的点网格的overprojection采样。Whenever a point hit a lung slice a tissue sample was taken at the given location and stored in the fixative for ≥24 h.
对于LM,切片固定在四氧化锇中,在cacodylate钠和蒸馏水中再次洗涤,浸泡在半饱和的醋酸铀酰水溶液中过夜,在上升的丙酮浓度中脱水,并嵌入到乙二醇甲基丙烯酸酯树脂中(Technovit 7100®;(德国魏赫莱姆,库尔泽贺利乌斯)一夜之间。从嵌入组织块,1μm厚度减少的部分,安装在玻璃幻灯片,与亚甲蓝染色。
对于TEM,所述组织块在四氧化锇后固定,染色全体in half-saturated aqueous uranyl acetate, dehydrated in an ascending acetone series and, finally, embedded in an epoxy resin (Araldite®; Serva Electrophoresis, Heidelberg, Germany; polymerisation: 5 days at 60°C). Ultra-thin sections of 40–70 nm thickness were obtained from the tissue blocks and stained with lead citrate and uranyl acetate using Ultrostainer (Leica, Bensheim, Germany).
体视学分析
采用基于设计的体视学方法对肺标本进行分析,获得定量数据27,28,34。
LM分析进行了使用Axioscope光显微镜(Zeiss,Oberkochen的,Germany)和计算机辅助体视系统(CAST 2.0;奥林巴斯,巴勒鲁普,丹麦)。系统的均匀随机抽样产生用于进一步估计代表性测试领域,并与测试点所定义数目的点格栅投影到切片。随后,将体积密度(Vv)通过计数点击打结构估计(P海峡),以及撞击基准空间的点,(P裁判),与Vv(STR / REF)等于P海峡/P裁判。在此之后,体积密度被转换成通过与参考量乘法的总肺容积,根据等式1。
(;软成像系统,德国明斯特Megaview III)和图像分析软件(分析3.1;软成像系统)TEM使用的EM 900(蔡司,蔡司,德国),补充有数字照相机执行。系统的均匀随机采样施加到超薄切片,并以×20000的最终放大率每当测试场包括血 - 气屏障的薄部分被拍摄的数字显微照片。阿由平行的线段和点的测试系统叠加。通过点和交叉点计数,肺泡上皮细胞,间质和毛细血管内皮的算术平均值势垒厚度(τ)根据式(2)估计,其中lŤ是测试线的长度,Pb是点击中屏障轮廓的数量和一世b是测试线的交叉点与所述阻挡层的参考表面的数量27,28:
为了获得关于血-气屏障受影响程度的进一步信息,还对该屏障进行了半定量表征。以下定义了三个不同的类别。1:正常,肺泡上皮、毛细血管内皮正常,电子致密超微结构,间质较薄;2:肿胀,在血-气屏障的一个或多个部位出现内皮和/或上皮结构肿胀;3:碎片化,肺泡上皮和/或毛细血管内皮被破坏,基底膜被剥脱。因此,估计血-气屏障完整性指数。通过将一类上皮细胞的横截面数与血-气屏障横截面总数相联系,估计正常、肿胀和碎片状肺泡上皮的表面积分数五。
采样及数量被设计每个肺100个200均匀地随机分布计数事件的每个参数之间获得。这保证了总的观察到的变异性是由动物之间,而不是由变性生物变异由于体视程序为主34。
统计数据
数据以均数±表示SD。体视学分析数据如下:根据研究的总体假设,1-4是秩使用的Kruskal-Wallis单因素方差分析进行的实验组的比较。如果p <0.05,那些对整个组间差异贡献组分别由所有成对多重比较方法(学生 - 纽曼-Keuls法)分离。对照组与相应的实验组进行了比较(即第5组与第四组,第六组与组7和8组与由惠特尼-曼U-试验组1)。组之间的功能数据通过单向ANOVA,随后的Tukey B或Tamhane检验。组之间的差异被认为是在p <0.05统计学显著。
结果
灌注液氧合和肺动脉压
在20、40和50分钟时,灌注氧合1组明显高于2-4组。30 min时也明显高于第2组和第4组,30 min时也有高于第3组的趋势。2-4组在任何时间点的灌流氧合无明显差异。的意思是P巴勒斯坦权力机构was similar in groups 1–4 and did not show any significant difference at any point in time (fig. 2⇓)。
灌洗液氧合(ΔPØ2)和平均肺动脉压(P巴勒斯坦权力机构)。▪:组1;▴:组2;•:组3;♦:组4。#:P <0.05与组2 - 4;¶:P <0.05与groups 2 and 4. 1 mmHg = 0.133 kPa.
定性LM和TEM
在所有的LM和TEM切片中,肺组织仅有少数不通气区,毛细血管和肺泡腔内有少量的红细胞,而大多数血管被广泛开放。表面活性剂注入组(即与未处理组相比,1-3组、7组和8组肺泡中表面活性剂的含量同样丰富,证明了应用的物质有效地到达了预定的目的地。无损伤对照组(6)肺实质结构正常,无肺泡内水肿,无红细胞。总的来说,这些结构上的发现清楚地表明,肺组织的灌注固定是成功的,只留下非常少的结构上的改变,这可能是由于实验过程造成的(图3)⇓)。
![图3-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/33/3/625/F3.medium.gif)
光显微照片,显示在组肺组织图1(a),2(b)中,图3(c),4(d),图5(e),6(f)中,7(g)和8(H)。前红细胞的减少缺血和再灌注的(a)帧内肺泡水肿(ED)的形成和外渗表面活性剂处理(红霉素;比较B-e)中,产生了结构保存接近无损伤对照组,而不用(f)和与(克)表面活性剂(冲浪)。Scale bars = 100 μm.
在缺血再灌注治疗组(1-5),用于超微结构损伤明显的证据可能被检测到。损伤的程度取决于是否以及何时施加表面活性剂。在非缺血组6和7,肺超微结构广泛完整和受伤人失踪。Group 8, which was exposed to ischaemia but not to reperfusion, showed moderate lung damage due to ischaemic conditions (fig. 4⇓)。
电子显微照片,显示在组血 - 气屏障超微结构图1(a),2(b)中,图3(c),4(d),图5(e),6(f)中,7(g)和8(H)。前表面活性剂处理减少肿胀和血 - 气屏障的组件的片段化(比较B-e)中,产生了结构保存接近无损伤对照组,而不用(f)和与缺血和再灌注的(a)(克)表面活性剂。阿绿:肺泡腔;盖:毛细血管腔;红霉素:红细胞;外延:肺泡上皮细胞;INT:间质;远藤:毛细血管内皮细胞;冲浪:肺泡内表面活性剂。 Scale bars = 1 μm.
肺泡内水肿地层以及红细胞和血 - 气屏障受损的血管外积累被发现的可变程度,但组之间明显的分化所需要的正式定量,即体视学方法。
体视
为了在LM水平上定量肺泡内水肿的形成,V(ed,肺脏)和肺泡内红细胞积累,V(ERY,肺),加入到肺泡内水肿的总体积,V(眼,肺)(每肺毫升)。该参数显示肺泡内水肿的形成仅在1组(0.01±0.01 mL)和6组(0.01±0.04 mL)中轻微出现,在2组(0.07±0.08 mL)、3组(0.03±0.03 mL)和4组(0.20±0.23 mL)中明显,在5组(0.64±0.36 mL)中严重。7组和8组未见肺泡内水肿或红细胞(0.00±0.00 mL)。根据非实质血管和气道的壁腔比估计支气管血管周围水肿的形成,2-5组的壁腔比高于其他组。然而,这些结果并不显著(表1)⇓)。
A blood–air barrier integrity index was determined for each group (fig. 5⇓),表明1组(1.80±0.14)、8组(1.72±0.07)中肿胀,2组(2.20±0.35)、3组(1.98±0.15)、4组(2.17±0.20)中破碎/肿胀,6组(1.26±0.03)、7组(1.33±0.08)中基本正常。估计的算术平均厚度blood-air障碍,τ̄(巴布),导致相同的序列组,1组(367±44 nm)和8(400±71海里)显示同样温和的影响,组2(518±83海里),3(404±88海里)和4(524±92海里)明显肿胀,紧随其后的是集团5受影响最(646±165海里)。6组(358±22 nm)和7组(358±30 nm)未见血气屏障肿胀。算术平均厚度的间隙空间,τ̄(int), 5组显示显著增加肿胀与所有其他组织。此外,所有接触缺血的组别(即groups 1–5 and 8) presented considerable swelling of the blood–air barrier, as distinct from the non-ischaemia groups (6 and 7) without swelling (table 2⇓)。
的正常(□)分数,溶胀(▓)和分段(▪)血 - 气屏障的表面上。前缺血和再灌注(组1)的表面活性剂处理导致血液零散空气屏障表面(比较组2-5)的分数降低。肿血 - 气屏障表面的分数是相媲美的相同的处理而无需再灌注(组8)。只有轻度肿胀存在由于所述的实验步骤(组6和7)。
总之,本研究的结果表明,表面活性剂滴注衰减超微结构损伤进行局部缺血和再灌注的肺,尤其是当局部缺血的周期之前施加。
讨论
在人肺移植,I / R损伤引起的PGD是可怕的并发症,其余的短期和长期的发病率和死亡率的原因显著1,3,4。I的临床表现/ R损伤包括水肿形成,增加了在P巴勒斯坦权力机构和低氧血症和范围从轻微阿里严重急性呼吸窘迫综合征1,10。几项研究已经确定在肺移植相关的I / R损伤的表面活性剂的变化中的重要作用8,9,35-40。因此,外源性表面活性疗法已被成功地在实验应用12-21和临床22-24学习。据,因此,考虑用于严重肺I / R损伤的减轻潜在的有希望的疗法,虽然要确定的最佳表面活性剂制剂和治疗仍然需要的模式26,41。
在肺移植中,在器官提取之前可以使用表面活性剂,即它是少数几种可以预防使用的情况之一11。以前的实验研究已经表明接枝肺功能表面活性剂处理的有益效果,尤其是当局部缺血之前施加12,16。此外,实验证据表明内源性表面活性剂体系的改善通过角质细胞生长因子的应用程序成功地降低了大鼠移植相关的I / R损伤42。最近的一项临床研究也表明,供体肺的外源性表面活性物质治疗之前检索保护移植后的表面活性剂的功能23。不过,也有缺血期间或在相同的实验设置再灌注过程中比较应用程序预缺血性表面活性剂处理没有系统的研究。此外,表面活性剂成功治疗的相关成分的结构是未知的。因此,本研究的目的是在我系统地限定用于外源性表面活性滴注的最佳时间点/ R使用组合LM和TEM和立体学方法受伤肺部。已建立体外大鼠肺I / R损伤模型,在研究中使用,包括移植相关的事件,即冲洗灌注,冷缺血保存和随后再灌注整个序列五,8,9。这种模式的局限性在于它是不是一个真正的移植模型。因此,从供体和宿主之间的相互作用而产生的效果不能进行调查。Perfadex®作为保存液在以前的研究中它被证明有效6,43,44,在一组中,除了,这是用NaCl灌注以诱导严重的I / R损伤平齐。关于表面活性剂制剂,它决定从Curosurf®猪的肺组织衍生的将被使用,其包含所述疏水性表面活性剂蛋白B和C,并且其通常适用于新生儿呼吸窘迫综合症的治疗45。在分析中,目前的作者集中在肺泡内水肿形成和血 - 气屏障的完整性超微结构,以及灌注液氧合和肺动脉压的体视学估计。它通过定量体视学评估先前已表明超微结构损伤的程度是肺I / R损伤与功能相关的,因为它紧密地与缺血后肺功能相关五,8,9。另外,氧合障碍是PGD的主要特征之一1;因此,灌注液的氧合程度的改善,局部缺血预表面活性剂治疗后所观察,强烈证实在目前的研究中的体视学数据。
肺泡内水肿的形成是I / R损伤的一个标志,从而导致对肺气体交换的增加的势垒厚度。根据菲克定律,肺泡内水肿的发展降低了肺氧合能力。目前笔者使用,以量化器官内其保存的微组织和本地化的水肿形成的程度基于设计的体视学方法。这些参数对于肺功能受损和更好的关联在一起器官的比湿 - 干比呼吸能力更敏感的指标五,9,46。这种高敏感性很重要,因为在目前的研究中,肺泡内水肿的量相当低。先前的直接结构-功能相关性研究表明,当>3%的体积分数时,肺泡内水肿的形成与功能相关46。在the present study, only the two reperfused groups that did not receive surfactant had an intra-alveolar oedema volume fraction >3% of the parenchymal volume: group 4 (3.6%) and group 5 (7.9%; table 1·)。此外,该灌注液氧合显著在第1组相比,第2-4组,这强烈地强调体视数据更好。因此,本研究表明,外源性表面活性治疗,尤其是当施加的预ischaemically,有效地衰减肺泡内水肿形成,所以有助于提高肺保存和防止I / R损伤的。
I / R损伤也导致血 - 气屏障的崩解,包括间质肿胀和肿胀或上皮和内皮细胞的分裂五,6。用电子显微镜估计算术平均屏障厚度可获得间质、上皮和内皮水肿形成程度的信息6。血 - 气屏障完整性指数的估计,作为用于定量血 - 气屏障的正常的,溶胀和零散部分的比例建立的方法,提供了对肺损伤的程度的重要信息五,6。Based on this approach, the present results suggest that pre-ischaemic surfactant instillation is superior to application during or after ischaemia with respect to the attenuation of blood–air barrier injury (fig. 5·);然而,这些数据没有达到统计上显著的水平。
总之,本研究提供了定量的形态和功能的证据表明,表面活性剂应用显著衰减通过降低肺泡内水肿形成和血 - 气屏障损伤和改善灌洗液氧合缺血/再灌注损伤。当表面活性剂缺血发作,之前给予一个发现这个观察是最明显的是提供了以改善肺保存质量肺移植表面活性剂供肺的预处理的理由。
支持声明
这项工作是由德意志研究联合会(DFG的Oc 23 / 8-1佤族738 / 8-1)的资助。
利益声明
对这项研究感兴趣的声明可以在网站上找到www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.shtml
致谢
作者非常感谢S.福瑞斯,H. HUHN,S Kosin和S. Wienstroth(解剖学系,哥廷根大学,哥廷根,德国),和五Gaschen,B.海尼和B克里格的技术援助(伯尔尼大学解剖学研究所,瑞士伯尔尼)。
- 收到了2008年2月15日。
- 公认2008年10月23日。
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