文摘
鼻内皮质类固醇(CS)是潜在有用的干预儿童阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA),并可能减少上呼吸道lymphadenoid组织大小。现在的作者提出,CS会减少细胞增殖和促炎细胞因子的生产在扁桃体/腺混合单元文化系统。
扁桃体和腺样体分离收获从polysomnographically患儿术中诊断阻塞性睡眠呼吸暂停综合症是控制培养基培养(CO)或者与脂多糖刺激后,伴刀豆球蛋白(敌人),孵化和地塞米松(敏捷;10−5-10年−7米),(流感;10−5-10年−14米)和布地奈德(芽;10−4-10年−14米)。增殖和细胞凋亡进行了评估,并浮在表面的化验了细胞因子肿瘤坏死因子(TNF) -α,白介素(IL) 6和引发。
敌人增加扁桃体和腺状的扩散与股份有限公司相比(1976±133与404±69计数·敏−1;n = 54)。敏捷、流感和芽细胞增殖率下降,表现出剂量依赖性的影响,流感的力量>芽>敏捷每组(n = 25)。相反,CS细胞凋亡增加每组(n = 20)。此外,TNF-α引发和上层清液中il - 6浓度增加了敌人,并显著降低CS (n = 48每组)。
整个组织细胞培养的腺样体和扁桃体提供一个有用的方法在体外糖皮质激素的治疗效果的评估管理lymphadenoid肥大是儿童阻塞性睡眠呼吸暂停。
阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是一种常见的儿童,和的特点是增加上呼吸道阻力,打鼾和部分或完整的断断续续的睡眠期间上呼吸道阻塞,导致情景oxyhaemoglobin稀释,血碳酸过多症和重复的微觉醒1。Adenotonsillar肥大是迄今为止儿童阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的病理生理学的主要因素2,3,虽然结构和神经肌肉异常导致儿童阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的发生,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的严重程度相关,虽然松散,腺样和扁桃体的大小4- - - - - -6。因此,手术根除,扁桃腺切除术和腺样体切除术(只能),这些组织通常是第一行的治疗7。
现在已经变得明显,鼻和口咽粘膜炎症出现在儿童阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,并可能导致增加adenotonsillar扩散在儿童阻塞性睡眠呼吸暂停综合症8。最近报道的糖皮质激素受体的表达增加上呼吸道淋巴组织将在全球范围内预测有利的结果当使用鼻内皮质类固醇(CS)在儿科阻塞性睡眠呼吸暂停综合症9,事实上,鼻内CS取得了可喜的疗效降低上呼吸道淋巴组织的大小10- - - - - -14。然而,机制的有利影响局部CS诱导退化的肥厚性腺样体和扁桃体仍不清楚。
一个新颖的方法最近被允许开发的在体外细胞培养的扁桃体和腺样体来源于儿童接受T&A15。目前作者提出,CS会导致剂量依赖性减少细胞增殖和细胞凋亡增加整个扁桃体和腺样细胞培养获得儿童阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,这些影响将被关联到一个减少促炎细胞因子的生产。
方法
主题
路易斯维尔大学的当前研究是通过人类研究委员会(美国肯塔基州路易斯维尔市的),和知情同意从每个参与者的合法的看护者。连续的儿童接受了阻塞性睡眠呼吸暂停综合症扁桃腺切除术手术前和加入了当前的研究。使用标准方法进行整夜多导睡眠监测,已发表在其他细节16。阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的诊断被定义的存在阻塞性呼吸暂停/ hypopnoea指数≥5事件·h−1总睡眠时间的存在习惯性打鼾的健康没有任何障碍的儿童需要药物治疗,包括吸入或口服CS,白三烯修饰符,抗生素或anti-histaminics,或与任何已知的基因或颅面综合征。
细胞培养
手术切除扁桃体和腺样体放置在冰冷的PBS +抗生素和处理开始后30分钟内无菌条件下手术切除。短暂,扁桃体是用PBS彻底清洗,手动切割成培养皿,轻轻地接地用注射器柱塞通过70 -µm筛网获得混合细胞悬液通过机械分离。使用裂解红细胞被缓冲。细胞生存能力的标本是由台盼蓝排斥。标本的可行性< 70%被丢弃。细胞培养建立了标准RPMI 1640中补充heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫)+抗生素,包括链霉素、fungisone、庆大霉素、青霉素预防细菌和真菌污染。混合细胞悬浮液转移到96 -轮bottom-well盘子1×10的浓度6细胞·好−1。细胞培养中5%的股份有限公司2孵化器在37°C 48 h。细胞培养使用24-well板来确定促炎细胞因子水平。文化是保持所述(控制介质(CO))或刺激μg·25毫升−1脂多糖(LPS) + 10μg·毫升−1伴刀豆球蛋白(conA)来测试增殖刺激条件下(敌人)。有限合伙人的大肠杆菌055:B5和conACanavalia ensiformis从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。
CS被添加到镀介质后24 h达到最终浓度从10−5到10−7M地塞米松(DEX)和10−5到10−14美元(流感)或布地奈德(芽),所有这些都从Sigma-Aldrich有限公司购买(圣路易斯)。
扩散分析
细胞被孵化最后18 - 20 h和0.0185兆贝可(0.5μCi)3H-thymidine在完全培养基(Amersham生物科学,小都,英国)。细胞与细胞然后收获到玻璃纤维过滤器收割机,和放射性测量液体闪烁计数器。所有的实验条件总是在一式三份,3H-thymidine吸收结果表示为三个井的平均每分钟计数。
溴脱氧尿苷细胞增殖和细胞凋亡膜联蛋白V与流式细胞术分析
检测T - b细胞特定的扩散,目前作者采用溴脱氧尿苷(BrdU)脉冲扩散使用流式细胞术分析。所有程序都是使用APC BrdU流测量工具(BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)所推荐的制造商。总之,年底的细胞培养48 h 24-well盘子,细胞与1毫米BrdU pulse-labelled 4 h。与PBS的细胞被洗,BrdU标记细胞被沾染了三原色组成的抗体结合鼠标反CD45 / PerCP Cy7, CD3 / PE和CD19 / APC-Cy7抗体(BD生物科学)50µL染色缓冲15分钟在冰上。绑定后,与细胞表面抗体,细胞被固定和permeabilised cytofix / cytoperm缓冲区。在这个过程中,细胞被停职DNase(300μg·毫升−1)1 h 37°C。添加anti-BrdU APC抗体是在烫/清洗缓冲和孵化20分钟在室温下。同形像控件相关的每个抗体被用来建立背景荧光。消极的控制被用作示例,未经处理的BrdU和不与特定的荧光抗体染色。数据获得在FACSAria流式细胞分析仪使用FACSDiva 5.5软件(BD生物科学)。浇注后淋巴细胞基于CD45 +细胞,T - b细胞数量和计算的CD3 + / CD19 -和CD3 / CD19 +细胞数量,分别。此外,T -扩散和b细胞被确定通过计算CD3 + / BrdU +、CD19 + / BrdU +细胞群。类似的方法是使用膜联蛋白V鼠标反量化T -抗体或b细胞特定的细胞凋亡。结果显示为两个颜色dot-plots和FlowJo分析软件(树明星,圣卡洛斯、钙、美国)。所有的数据都表示为阳性细胞占总细胞数的百分比。
细胞凋亡检测
细胞凋亡是量化使用细胞死亡检测酶联免疫试剂盒(罗氏诊断,印第安纳波利斯,美国)。这个免疫分析法检测组蛋白区域(H1, H2A、H2B H3和H4) mono -在细胞凋亡和oligonucleosomes释放。从每个治疗组细胞凋亡测定一式两份,并表示CS-treated细胞溶解产物的吸光度比值与吸光度计算控制,后者任意设定在1.0。的检出限ELISA是102凋亡细胞。
细胞因子检测
浓度的肿瘤坏死因子(TNF) -α白介素8 (IL)和IL - 6测量使用商用ELISA试剂盒的上层清液有限公司或敌人的条件。确定细胞因子生产、细胞孵化24-well的平底盘子完全RPMI中补充10%的边后卫有或没有添加μg·25毫升−1有限合伙人+ 10μg·毫升−1conA。上层清液收集后48 h,并存储在-80°C到化验。TNF-α水平测量根据制造商的指示,使用高灵敏度ELISA检测能够检测浓度低至0.09 pg·毫升−1(欧洲BioSource SA、显示、比利时)。引发是评估使用商业酶联免疫试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)的探测范围在0和2000 pg·毫升之间−1。确定il - 6浓度il - 6 EASIA化验(BioSource欧洲S.A.)使用。上层清液中细胞因子的浓度正常化镀细胞的数量,并表示为pg·106细胞。对于所有化验,每个实验校准曲线进行复制。
统计分析
所有数据都表示为±se,除非另有规定。对于正态分布数据,方差分析,其次是事后测试,使用,其中包括Bonferroni调整。细胞因子的数据不是正态分布,因此对数转换,而使用非参数测试(Mann-Whitney)。确定是否显著差异在效力发生三个CS,多元方差分析与矫正事后测试使用。所有的假定值报告在< 0.05双尾和统计学意义。
结果
研究人群
共有86名儿童的94个合适人选障碍和临床诊断阻塞性睡眠呼吸暂停综合症发生T&A同意参与这项研究完成。人口特征和主要障碍在一夜之间发现组如表1所示⇓。值得注意的是,由于组织的可用性的限制,只有数量有限的实验条件是可能每招募病人,这样题材广泛,包括在每个实验的数量,和适当的指示。
细胞增殖实验
基底细胞增殖率混合文化来源于或扁桃体腺样体是与LPS刺激后显著升高和conA(基底条件:404.2±69.0与打1976.3±133.1 cpm兴奋剂;n = 54;p < 0.00001;图1⇓)。因为模式和大小或反应类似的扁桃体和腺样体之间,只有结合研究结果报道。
评估CS细胞增殖的影响,初步实验使用敏捷公司和机枪兵的条件。图1⇑显示了增量剂的剂量反应敏捷,显著减少(∼50%)扩散已经明显在10−7M与控制条件相比,要么没有(图1⇑)或敌人后(图1 b⇑)。减少扩散也发生与芽(n = 18;图2⇓)或流感(n = 18;图3⇓),除了实现所需的浓度减少∼50%增殖明显降低流感(10−14M)和芽(10−12米)相比,敏捷芽和流感(p < 0.0001与敏捷;无花果1⇑- - - - - -⇓3⇓)。此外,流感是更有效的比芽细胞增殖减少平均一个对数数量级(无花果2⇓和3⇓)。事实上,多元方差分析显示影响存在剂量依赖的相关性,在效力显著差异如下:流感>芽>敏捷(p < 0.0001;每组)n = 25。
评估是否T - b细胞和淋巴细胞细胞亚型,可能会影响到CS,数量有限的实验(n = 4)进行细胞培养与BrdU脉冲,之后采用流式细胞术使用T -或b细胞标记。这些实验证实,CD3 +细胞(图4⇓)和CD19 +细胞(图5⇓)合并BrdU,从而表明细胞增殖的存在。此外,流感减少BrdU公司T -(图。4⇓)和b细胞(图5所示⇓),从而说明anti-proliferative流感对淋巴细胞增殖的影响。
细胞凋亡检测
细胞凋亡是评估控制如果细胞培养条件。增加细胞凋亡发生在所有的存在证据CS在最大剂量和剂量与减少∼50%增殖有关。根据CS,细胞凋亡的平均大小控制条件的3.8 - -6.70倍,最大剂量(10−5为敏捷和10 M−8流感和芽米;n = 20 /组;图6⇓),约2.5 -3.9倍的剂量与扩散(10∼50%下降−7M敏捷,10−12流感和10−13米芽;n = 20 /组;图6⇓)。
使用膜联蛋白V抗体和流动仪的方法,目前的作者发现流感病毒诱导细胞凋亡增加T -(图。4 c⇑c和d)和b细胞(图5⇑从混合细胞培养系统和d)的扁桃体来自儿科阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的病人。这些发现都在三个不同的主题。
讨论
目前的研究表明,刺激扁桃体分离混合细胞培养系统中诱导增加增殖反应和促炎细胞因子的释放。更重要的是,任何治疗CS不仅显著降低扩散控制和刺激条件下剂量依赖性的方式,但也揭示了各自的效能显著的不同的敏捷,流感和萌芽状态。在增殖率显著降低CS治疗也伴随着增加凋亡细胞死亡,以及减少促炎细胞因子的生产和发布TNF-α,引发和il - 6。综上所述,当前作者会推测的有利影响鼻内和局部CS减少儿童睡眠呼吸障碍的严重程度可能是由于CS-induced扁桃体和腺样体的退化,而这小说在体外方法可能提供新的见解治疗方法旨在解决常见的儿科疾病与adenotonsillar肥大有关。
在当前作者讨论当前发现的潜在影响,需要两个技术和方法论的评论。首先,儿科人口包括这里并不是专门为过敏性鼻炎的存在和客观检查,即使受试者没有接受任何局部或系统性药物时的手术切除腺样体和扁桃体。先前的研究已经报道的高患病率与阻塞性睡眠呼吸暂停综合症儿童过敏敏化作用的17- - - - - -19,即使在阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的病理生理学过敏性鼻炎的作用仍不清楚20.,尽管鼻内CS的类似的反应温和的儿科阻塞性睡眠呼吸暂停综合症,无论过敏史14。尽管这样的辩论,此处使用的混合文化系统应该允许探索建立微分反应干预过敏成分的存在与否,以及在肥胖儿童的背景下,他们传统上一直在T&A更惨的阻塞性睡眠呼吸暂停综合症21。其次,有限合伙人的选择和conA作为扩散的综合刺激此处化验报告是基于驻留在扁桃体组织的淋巴细胞的数量22- - - - - -25。事实上,这两种物质有显著影响的主要人群的免疫细胞类型在扁桃体组织。
在儿科使用局部类固醇治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合症已经重新感兴趣的主题,尤其是当考虑到手术根除肥厚性腺样体和扁桃体的阻塞性睡眠呼吸暂停综合症是陪同不仅为潜在风险增加术后并发症和情绪困扰的病人和家庭,但也增加健康与手术相关的成本。因此,研究提供关键的评估鼻CS在儿科阻塞性睡眠呼吸暂停综合症进行管理,并在全球范围内产生了非常令人鼓舞的结果10- - - - - -14。这些研究表明改善睡眠呼吸模式在阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的严重程度。有趣的是,由Alexopoulos工作et al。12也同时Kheirandish-Gozal和14停止治疗后病人群局部CS长达9个月,发现持续效应,在症状或没有反弹增加re-growth腺样体和扁桃体。然而,治疗仍未定义的最佳剂量和持续时间,以及是否特定组的患者,如年轻与老年或体重正常与肥胖会积极回应仍未知。另外,目前尚不清楚是否添加其它抗炎剂,如白三烯受体拮抗剂26,27,可能产生相加或协同效应。的在体外adenotonsillar混合文化系统中使用目前的研究提供了详细研究这些问题的机会,因此应该允许描述和识别特定群体的阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的病人,为谁与CS鼻内治疗,例如,将预期引起的最佳结果。
生物力量的三个CS雇佣在当前的研究中,不同,流感具有最高的效力在目前的混合细胞增殖试验系统。这些发现是有些期待,考虑到这些化合物报道bioaffinity和活动的差异28,29日。事实上,流感是300倍比芽亲脂性的,有一个相对高3倍比芽糖皮质激素受体的亲和力,和半衰期的流感活跃类固醇受体复杂> 10 h,而∼5 h芽30.。同样,流感被发现增加了力量与芽在抑制人类t细胞迁移和增殖,抑制CD4 + t细胞细胞因子释放,刺激炎症细胞凋亡30.。考虑到增加大量的t细胞,尤其是CD4 + t细胞,与阻塞性睡眠呼吸暂停综合症儿童扁桃体组织31日,这些细胞群的重要作用可能在当地监管的免疫反应和扩散32- - - - - -34,CS作为治疗工具的使用似乎是一个合乎逻辑的方法,试图降低t细胞增殖和促进细胞凋亡,同时减少促炎细胞因子的生产35- - - - - -37。在目前的研究中,提出了初步证据,t和b淋巴球增多在扁桃体文化中,这种扩散可以废除CS,并进一步引起淋巴细胞凋亡增加。
总之,扁桃体和腺样体获得儿童阻塞性睡眠呼吸暂停接受扁桃腺切除术和腺样体切除术显示增殖率和促炎细胞因子增加生产与脂多糖刺激时,伴刀豆球蛋白a .此外,治疗皮质类固醇剂量依赖性降低了增殖率,增加细胞凋亡和细胞因子释放减少。的相对效力三个糖皮质激素在当前研究中使用地塞米松fluticasone最高和最低的。这些发现支持使用扁桃体或腺状的组织细胞培养作为一个潜在的有用的方法在体外评估治疗效果的药物治疗皮质类固醇和其他候选人的lymphadenoid肥大儿童阻塞性睡眠呼吸暂停。
支持声明
d .同时支持美国国立卫生研究院(贝塞斯达,医学博士,美国)赠款hl - 065270 hl - 086662和hl - 083075年,肯塔基州的联邦研究挑战卓越信托基金(美国肯塔基州列克星敦)和儿童基金会睡眠研究基金会(美国肯塔基州路易斯维尔市的)。
感兴趣的语句
一份声明中对l . Kheirandish-Gozal可以发现www.www.qdcxjkg.com/misc/statments.dtl
- 收到了2008年8月24日。
- 接受2008年11月8日。
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