抽象的
纤毛支气管上皮(CBE.)1是一种新的基因,其在纤毛细胞中表达。由于纤毛在胚胎发生期间很重要,本作者的特征在于鼠同性恋CBE1.(CBE1.)并比较鼠和人肺发育期间的时间表达。
CBE1.使用测序,标准PCR和Western印迹克隆并表征cDNA。为mRNA分析和蛋白质定位收获小鼠和人胚胎/胎儿肺(HEL)体内和体外采用RT-PCR和免疫组化方法。
CBE1氨基酸序列与CBE1相同的> 75%,其替代剪接和组织分布高度保守。肺动力表达CBE1.在胚胎日(e)16,1天晚上增加mRNAFoxj1,这与Ciliogisesis中的作用一致。在赫尔斯,CBE1.在概念后8-9周内检测到mRNA,并在外植体培养中增加。CBE1蛋白表达在概念后10周弱,但在概念后12.3周后强劲,与纤毛形成平行。此外,CBE1.在没有的情况下在E11(在赫尔斯后4-5周)表达mRNAFoxj1这意味着它在早期发育中起着独特的作用。
按时间顺序排列的监管CBE1 / CBE1肺分化过程中的表达表明参与纤毛发生,在早期肺发育中有额外的作用。
纤毛是指像微管(MT)的细胞器的指状阑尾。它们根据其MT组件分类为9 + 2(Motile)和9 + 0(主要)纤毛。气道是含有辣椒菌的原型组织。下气管的气管和支气管上皮中的纤毛细胞在推进粘液分泌物朝向咽部的分泌物中起枢转作用1,2.尽管上皮纤西发生的分子机制尚未得到完全研究,但转录因子箱因子(狐狸)J1.(肝细胞核因子-3/叉头同源物4)与纤毛发生密切相关。有针对性地破坏Foxj1小鼠的基因导致缺乏气道纤毛内脏逆位3.,4,这表明Foxj1不仅是气道上皮的分化,而且对于内脏的正常定位是重要的。但是,强迫表达了Foxj1未分化的气道上皮细胞不诱导纤毛细胞的形成5,暗示Foxj1单独的纤毛的发育是不够的,纤毛的发生需要其他不同的转录因子,这些转录因子还有待鉴定。
最近,表征了一种新的基因,纤毛支气管上皮(CBE.)1,最初在从哮喘患者和正常支气管活检中提取的cDNA文库中鉴定为具有差异代表的基因6.尽管其预测的氨基酸序列与已知蛋白质没有相似性,但CBE1的表达与支气管和鼻组织中的纤毛上皮细胞强烈相关。重要的是,细胞内但不在睫状体结构内观察免疫染色,表明CBE1不构成纤毛的组分。表达研究表明,CBE1局部化为细胞的核核细胞区域,暗示CBE1可能是核细胞质梭蛋白,尽管尚未描述CBE1的明确功能。虽然强烈诱导了CBE1.mRNA期间体外原发性支气管上皮细胞的粘液纤毛分化已被证实,但其在肺发育过程中的表达尚未被研究。目前的作者已经描述了小鼠的同源性CBE1.(CBE1.),分析了时间的年代表达CBE1.肺分辨率期间mRNA体内并与之相比CBE1.人胚胎/胎儿肺(HEL)外植体的mRNA和蛋白表达体外.
材料和方法
克隆和表征CBE1.互补脱氧核糖核酸
使用特异性的引物扩增成年小鼠肺的cDNACBE1.并克隆和测序的产品。编码开放阅读框(ORF)1和ORF2的CDNA被克隆到PCDNA3.1(Invitrogen,Carlsbad,Ca,USA)中并转染到HEK293细胞中。如前所述进行细胞提取物,SDS-PAGE和Western印迹的分离6.在线补充数据中提供了详细协议。
鼠标肺的分离
在胚胎日(e)11-19,产后第1天和8天和成人小鼠(AM)中收获小鼠肺。将解剖肺部立即在Trizol试剂(Invitrogen)中均化,用于RNA分离(见下文)。
分离人胎肺和体外分化
人类胎儿肺组织取自经知情书面同意和伦理批准的妊娠早期终止妊娠的女性。分离的组织按前面所述进行分期和处理7或培养体外使用无血清培养基(Cambrex, Verviers, Belgium)在Matrigel气液界面(ALI)下培养≤18天。
免疫组织化学
将人胎肺部加工成二醇甲基丙烯酸甲酯树脂,并将2μm切片切割并使用二氨基苯甲酸或3-氨基-9-乙基氨基咔唑作为色素,如前所述,用二氨基苯甲酰酯或3氨基-9-乙基咔唑进行免疫组化分析,如前所述8.抗CBE1亲和纯化兔多克隆抗体6用于2μg·ml−1.
RNA提取和RT-PCR
使用Trizol试剂根据制造商的指示分离RNA样品,并用RNase-Free的DNase I(Ambion,Huntiondon,UK)处理以去除任何污染的基因组DNA。如前所述合成cDNA6.半定量PCR和巢式PCR采用在线补充资料中描述的特异性引物进行cDNA扩增。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中分离,用溴化乙啶或Vistra Green显示(Amersham Biosciences, Amersham, UK)。采用IcyclerIQ系统(Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK)进行rt -定量PCR (RT-qPCR)。9.使用ΔΔCT(阈值循环)方法计算相对表达水平。在线补充数据中提供了特定的引物,探针和实验条件。结果表达了相同甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh) 要么beta-actin(ACTB)mRNA水平,被用作内政基因。
统计分析
采用Mann-Whitney检验进行统计分析。p值<0.05为显著性。
结果
描述的CBE1.及其组织分布
比较表达式剖面CBE1.目前的作者克隆了鼠啮齿动物对应物的mRNACBE1.(CBE1.).基本的本地对齐搜索工具(BLAST)搜索使用CBE1.作为查询容易识别出高度同源的小鼠mRNA(登录号AK003742在GenBank数据库中,尚未完全注释。基于序列Ak003742设计了特异性引物,以及推定的全长cDNACBE1.通过PCR扩增,然后进行测序分析。图1A⇓的cDNA的一致序列CBE1.在其中发现由126个氨基酸组成的小ORF。该ORF的第一甲硫氨酸密码子在上游的内框架停止密码子42bp,并且由Kozak的共识序列(A / Gxxatgg)侧翼。10,表明它是真正的翻译启动网站。给予这一点,在3-未转换区域中具有推定的多腺苷酸化信号(AataAA)(图1A⇓),这是一个全长cDNA。在分析的十二个独立克隆中,分析的序列中的两个显示在其中一个拼接位点处的5bp插入,导致框架偏移。反过来,这产生了由具有不同羧基末端的162个氨基酸组成的另一ORF(ORF2)。有趣的是,在小鼠和人类之间完全保守这些剪接变体的方式是有趣的6.BLAST搜索分析还发现了另一种剪接变体(登录号)XM355478.) 的CBE1.窝藏了一个较长的氨基终端,就像CBE1..设计了特定的引物,通过RT-PCR检测该变体,澄清较长的形式在肺中不表达,但在睾丸中表达。由于5-bp的插入,较长的形式也有两个具有不同羧基末端的剪接变体(图1b)⇓).
描述的CBE1.互补脱氧核糖核酸。a)肺表达全长的核苷酸和推导的氨基酸序列CBE1.互补脱氧核糖核酸。在cDNA内的一个拼接位点中存在5bp插入,导致替代的开放读数框架(ORF),具有较长且不同的羧基末端(ORF2; GTAAG)。显示了显示为其核定位对CBE1负责的两种精氨酸残基。Genbank登录号:DQ873295.(ORF1),DQ873296.(ORF2)。b)内含子/外显子组织的示意图,浆液变种的氨基酸链长度的比较CBE1.肺和睾丸组织中mRNA的表达及分析。打开的盒子代表未翻译区域,但由于使用了替代启动子,长形式和短形式的5 ' -未翻译序列彼此不同。利用变异特异性引物进行半定量RT-PCR。每个PCR循环为35个CBE1.mRNA变体。c)CBE1和CBE1的氨基酸序列的比较。*:相同的残留物。
CBE1的ORF1的预测氨基酸序列与CBE1的ORF1相同的75.4%,而ORF2发现78.4%的同一性(图1C⇑).虽然两个ORF与已知蛋白质没有明显的相似性,但是可以作为CBE1中的核定位信号之一的两个精氨酸残基相似6是节省的。
本文作者还进行了半定量RT-PCR来评估组织分布CBE1.成人组织中的mRNA。这表明长形式是特异性的,并且短形式在肺和睾丸中大量表达(图1B⇑),在大脑和胸腺中表达相对较低,而在其他分析组织(心脏、肝脏、脾脏或肾脏;图2一个⇓),后一种发现与CBE1.MRNA也表达了心脏和肾脏7,虽然CBE1.使用RT-QPCR(数据未显示)可以在胚胎心脏中检测mRNA。这些数据表明表达了CBE1.mRNA具有高度的组织特异性,其模式部分与CBE1..
a)组织分布CBE1.半定量RT-PCR分析mRNA。从成年小鼠的不同器官中分离总RNA,然后进行cDNA合成和PCR,利用引物检测长或短的形式(常见的开放阅读框(ORF)1和ORF2)CBE1..PCR循环为35次CBE1.cDNA和25G3PDH.互补脱氧核糖核酸。使用变体的RT-PCR(ORF1,ORF2) - 特异性引物导致类似的分布模式(数据未显示)。b)抗CBE1抗体对重组CBE1和CBE1蛋白的反应性。编码全长ORF1或ORF2的表达质粒CBE1.或CBE1.通过脂吸法将cdna或载体(pcDNA3.1)瞬时导入HEK293细胞。48 h后,用15% SDS-PAGE分离细胞提取物,然后用抗cbe1抗血清进行免疫印迹。ORF1和ORF2的条带用箭头表示。
小鼠胚胎发生过程中CBE1 mRNA表达的调节
这两个合成肽序列中的氨基酸序列在CBE1和CBE1之间并不是完全保守的,这两个序列之前用于生成抗CBE1抗体6,14个氨基酸中的11个在一个肽中相同,另一个肽中的14个相同的10个相同。结果,在通过蛋白质印迹分析时,在HEK293细胞中表达的CBE1的重组ORF1和ORF2对抗CBE1抗体的反应性大得多(图2B⇑).因此,本作者选择使用RT-QPCR分析来调查时间性表达CBE1.mRNA和其他胚胎发生纤毛发生相关基因。
图3一⇓显示了Foxj1与纤毛发生密切相关的mRNA在E15被激活,与E14的基础水平相比,其诱导率为15.4±3.7倍。Foxj1mRNA按时间顺序增加,AM均高达342±71倍。的表达CBE1.E16组mRNA水平较基础水平升高15.4±7.4倍Foxj1, AM增加447±99倍(图3b)⇓).相比之下,表达剖面Foxa1.和Foxa2.MRNA,尖头转录因子紧密参与支气管上皮的分化11,12,变化不大Foxa1.;无花果。 3c⇓)或仅增加三至五倍(Foxa2.;无花果。 3d⇓)从E11到成人。这与之前的报道一致,该报道称这些转录因子是从E10.5表达的13.Tektin-1(Tetk1),一种编码蛋白质的基因编码,其在睫状体和鞭毛微管壁中形成丝状聚合物14,显示从E15到E16的mRNA表达增加4.5±1.1倍,这远小于CBE1.或Foxj1信使rna(图3 e⇓).虽然表达简介和类似的动力学CBE1.和Foxj1MRNA在肺部发育后期伪阶段(图3F⇓)符合CBE1在CBE1中的作用,显着更大的表达CBE1.与E12-E14相比,在E11中观察到mRNA;但是,没有观察到这一点Foxj1(图。3A⇓b),提示Cbe1在早期肺发育中具有独特的功能。
A)的时间效果Foxj1,b)CBE1., C)Foxa1.,d)Foxa2.和e)Tekt1.MRNA在小鼠肺部发育的所有阶段。f)小鼠肺发育的所有阶段的示意图。在妊娠(胚胎日; e)后的指示日,从妊娠(P)和成人小鼠(AM)的指定日期,从妊娠(胚胎日; e)的指示日,在妊娠后的日子中解剖到胚胎组织。分离出总RNA,合成cDNA用于SYBR绿定量PCR分析。相对于水平给出表达水平甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh) mRNA,它被用作一个管家基因。每组5 - 8个肺的数据。
的表达CBE1.在冥界
表达CBE1.半定量RT-PCR分析HEL的mRNA,其含量低但可检测CBE1.怀孕10周后的mRNA水平。相比之下,FOXJ1mRNA在受孕后7-10周持续观察Tekt1.在受孕后10周,mRNA未表达(图4a)⇓).为了检测低拷贝数CBE1.和Tekt1.mRNA,本文作者进行巢式PCR显示CBE1.mRNA在受孕后8-9周就已经存在,然而Tekt1.即使用这种高灵敏度的方法也无法检测到mRNA(图4b)⇓).这些结果表明,从概念后7周开始,表达CBE1.前面Tekt1.,但随后FOXJ1mRNA在人肺发育中的作用。
的表达CBE1.人胚胎/胎儿肺(HEL)的mRNA。a)半定量RT-PCR检测mRNA。在怀孕后7、8、9或10周(wpc)从HELs中提取支气管组织。每条泳道代表一个不同的捐赠者。PCR循环为35个FOXJ1,CBE1.和Tekt1.和25G3PDH.互补脱氧核糖核酸。从气液界面分化的支气管上皮细胞(第14天)或培养的支气管成纤维细胞的cDNA分别作为阳性(+ve)或阴性(-ve)对照。b)巢式PCR(15个周期)CBE1.和Tekt1.mrna使用稀释的反应产物(1:10)的标准RT-PCR分析在(a)和各自的嵌套引物。
还使用抗CBE1多克隆抗体检查CBE1蛋白的表达。由于在中期伪阶段后,在概念后11-16周内发生纤毛上皮的分化15,16,本作者使用在后期后10和12.3周获得的胎儿肺组织。CBE1蛋白的免疫反应性在概念后的10周内胎儿胎儿气道组织在没有观察到纤毛的胎儿气道组织(图5A⇓然而,在怀孕后12.3周,纤毛清晰可见时,CBE1蛋白在肺气道上皮中表达强烈(图5c)⇓和D),并一致于CBE1表达和纤毛发生的相关性。不仅在柱状上皮细胞中观察到阳性信号,还观察到胎儿肺的基底上皮细胞(图5C⇓d),与成人支气管相反(图5e)⇓和f)。
免疫组织化学分析的CBE1蛋白的表达。使用二氨基苯甲酸的棕色免疫染色显示CBE1的存在,其在概念后10周(A和B)在10周内未检测到的CBE1,但在概念后12.3周的上皮中的强度是强烈的(C和D),其中睫状体结构可见(箭头).不仅在柱状细胞中检测到CBE1免疫染色,还检测到基础细胞。相比之下,染色被限制在成人人支气管(E和F)中局限于柱状上皮细胞。a,c和e)缩放条=60μm;B,D和F)刻度条=20μm。
的表达CBE1.在胚胎/胎儿肺组织外植体培养中
由于概念后11-12周后难以获得人胎肺,当前作者培养了胚胎/胎儿肺组织体外为了模仿体内开发和评估归纳CBE1.通过RT-QPCR mRNA。在培养之前,表达CBE1.在概念后7-9周获得的胚胎肺的mRNA几乎可以检测到(CT值为〜36-40;数据未显示),与半定量RT-PCR分析一致(图4A⇑b)。然而,当培养后9周的人类胎儿肺部培养体外,CBE1.mRNA按时间顺序增加,在第12天mRNA水平增加了10倍(相当于怀孕后10.7周)体内;p = 0.03),第18天增加超过200倍(相当于后期后11.6周体内;P = 0.01)与第0天比较(图6a⇓).的表达FOXJ1与第0天(图6b)相比,第12天(p = 0.01)和第18天(p = 0.01)也同样增加了约10倍⇓).表达水平的增加更大CBE1.比FOXJ1mRNA,可能是因为FOXJ1在概念后9周开始在文化开始前已经显着表达(图4A⇑).但是,本作者无法检测到表达Tekt1.mRNA在这期间体外甚至在文化中18天后的分化(数据未显示),确认表达Tekt1.两者时都没有mRNACBE1.和FOXJ1mrna显著表达,如体内分析(图4A⇑b)。通过免疫组织化学研究CBE1在培养的人胎肺中的蛋白质表达,在第0天(概念后9周)和第6天(图6C和D)中没有显示染色,但在第18天在显影性上皮染色(相当于后期后11.6周体内),当可见睫状体结构时(图6E⇓).图7⇓展示了总结时间模式的示意图CBE1 / CBE1.在发育中的小鼠和人类肺中的表达。虽然目前的作者仅限于获得假腺发育阶段的人肺样本,但两者之间有良好的一致性CBE1 / CBE1.两种物种中的表达配置文件。
A)的时间效果CBE1.和b)FOXJ1MRNA期间体外人胚胎/胎儿肺的分化。rt -定量PCR检测mRNA表达。培养分离的人胎肺(妊娠后7-9周),在培养开始后的天数分离总RNA。每个数据点代表从一个独立样本获得的结果。数据相对于管家基因被归一化,β肌动蛋白(ACTB)mRNA水平。通过免疫组织化学分析C-E)蛋白表达。培养(第6天或第18天; D和E,分别)或非培养(第0天; C)胚胎肺组织如图5所示⇑;以3-氨基-9-乙基咔唑为染色剂,免疫染色呈阳性红色。比例尺= 100 μm。
![图7 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/33/5/1095/F7.medium.gif)
肺部发展阶段的示意图和时间模式CBE1.(代码迩,烧嘴句子,▒和▪CBE1.(▥)小鼠和人肺中的mRNA表达,人肺中的CBE1蛋白(▩)表达。E:胚胎日;P:Partum Day;W:概念后周;Y:一年。
讨论
在健康的气道中,纤毛的细胞代表总柱状上皮细胞群的> 80%,并且与粘液分泌脚卵细胞散布。然而,在慢性气道等哮喘,囊性纤维化和慢性支气管炎等慢性气道疾病中,高脚卷细胞的数量显着增加17,18;这导致粘液的加速生产和/或分泌,这反过来导致对空气流动的抵抗力,并且废除正常的粘液功能。这些变化的后果包括增加的痰液生产,气道狭窄和疾病恶化,或在致命哮喘发作的情况下窒息19.因此,在支气管上皮的高效和适当的修复,导致纤毛细胞的富集,对气道疾病具有很大的益处。然而,含有纤毛生成的细胞和分子机制尚未得到完全研究。
未分化的气道上皮细胞承诺对纤毛细胞承诺所需的因素尚不完全已知。如已经指出,研究使用Foxj1没有长出运动纤毛的空老鼠清楚地表明了这一点Foxj1对纤氯起着至关重要的作用3.,4.但是,重要的是要注意Foxj1- / -小鼠,纤毛前体存在于气道上皮细胞内,但不能在顶端膜停靠并形成纤毛4.使用腺病毒(或慢病毒)表达载体和Ali培养的小鼠气管上皮细胞的功能分析的增益表明Foxj1单独不足以诱导纤氯化程序5.的确,体内和体外研究表明,Foxj1在纤氯的后期的功能,以调节基础体对接和在先前致力于纤毛细胞表型的细胞中的轴突形成20.,21.
为了在肺部发展期间研究CBE1 / CBE1的表达,本提交人使用了体内用小鼠肺和一个方法体外方法采用人胚胎肺组织移植。外植体培养为研究早期人肺的发育提供了一个有用的模型。在实验期间(长达18天),作者观察到分枝形态发生的维持。在CBE1蛋白表达方面,诱导表达后18天体外(概念后9周加2.6周体外)类似于观察到的体内12周时,这表明细胞编程在培养期间是正常的。尽管组织的生长最终会受到血液供应需求的限制,但这个模型为研究控制假腺发育阶段的分子事件提供了潜力。
以前的研究观察到转录CBE1.,FOXJ1和tekt.1其间mrna是同步的体外使用Ali培养物进行差异化。所有这些纤毛相关基因在Ali开始后14天接通,当在第7天,14和21日提取RNA时6.然而,在小鼠的肺中体内并使用人体胎儿体外,在气道上皮中的纤毛细胞的分化期间观察到不同的表达顺序Foxj1/FOXJ1早于CBE1./CBE1.MRNA,而表达Tekt1.怀孕后≤11-12周未检测到。人类成人组织和胚胎组织之间的另一个区别是CBE1蛋白的分布。在成人支气管上皮中,CBE1蛋白免疫染色仅限于柱状上皮细胞,而在胚胎肺组织中,从受孕12周开始,CBE1蛋白可在基底上皮细胞和柱状上皮细胞中检测到。这些基底细胞是否代表假分层上皮内的早期纤毛细胞祖细胞还有待确定。它们在成人支气管上皮内的缺失可能反映了与生长更快的胚胎气道相比,细胞更替较慢。另外,这些发现可能表明体外使用成人细胞的分化系统并不一定反映胎儿肺部分化,即使它产生具有击打纤毛和粘液分泌脚卵细胞的完全分化的柱状上皮细胞22.
表1⇓根据组织学标准比较小鼠和人肺的发育阶段23- - - - - -26.年表表达Foxj1和CBE1.在发育中的小鼠肺中mRNA的表达与在人胎儿气道中观察到的一致Foxj1(E15)比CBE1.(e16)在伪伪发展阶段(图3)⇑和7⇑).得到的结果Foxj1表达方式也与之前的报告一致Foxj1通过Northern blot检测胚胎肺E14.5 mRNA原位杂交分析27.然而,应该指出的是,本作者观察到了双相表达CBE1.mRNA表达显著升高CBE1.在E11,在肺芽形成过程中,表达Foxj1不存在(图3ab&7)。这表明了CBE1.可以在肺部发育的早期和后期阶段起作用。小鼠的E11对应于人胚胎后4-5周(表1⇓),是表达的时间FOXJ1信使rna缺席28.不幸的是,本作者无法确认CBE1.由于伦理原因,无法获得合适的胚胎组织在人肺中的mRNA表达。因此,人类胚胎在这个早期阶段是否也会短暂表达CBE1.mRNA仍有待确定(图7⇑).
它意外寻找重要表达Tekt1.从E11开始的mRNATekt1.在概念后10周内在人体胎儿肺部检测到mRNA,当时CBE1.和FOXJ1观察到MRNA。然而,这种表达年表的表达模式可能与以前的研究报告一致,北方印迹,即Tekt1.从E12开始检测到mRNA29.这些数据表明,控制TEKT1的转录的监管机制/Tekt1.胚胎发生期间的MRNA在人和小鼠之间是不同的,尽管这些矫桃在结构上高度保守(在氨基酸序列中相同82%)30..
Foxa1.和Foxa2.在结构上同源的转录因子,现在已知在支气管上皮的分化中起着至关重要的作用。有条件的中断Foxa1.和Foxa2.降低了肺上皮中几种标记基因的表达,包括表面活性剂蛋白,克拉拉细胞分泌蛋白和Foxj112,表明这些转录因子积极调节表达Foxj1直接或间接地。免疫组化精确评估了Foxa1和Foxa2在小鼠胚胎中的蛋白表达,表明这两种转录因子在E10.5时均可在肺芽细胞核中检测到,之后也可在肺上皮中检测到13.这与目前的研究结果是一致的Foxa1.和Foxa2.在E11的小鼠胚胎肺中不断检测MRNA(图3C⇑和d)。之前曾据报道,强迫表达FOXJ1在人支气管上皮细胞系16hbe 14o( - )诱导内源性的cDNATekt1.但不是mRNA表达CBE1.,这表明FOXJ1单独的是不足以转录CBE1.6.存在CBE1.E11的mRNA可能提示CBE1.是由Foxa1或Foxa2等在Foxj1上游起作用的转录因子诱导的。肺发育后期的时序表达模式也可能表明Cbe1与Foxj1合作控制粘液纤毛的分化。最近,松岗等等。31描述了一个精子特定基因,Smrp1,这与鼠同源CBE1..他们报道了人类中的三种mRNA变体,但只有其中一个转录物被翻译成蛋白质。松山等等。31还提出了SMRP1可以涉及形成由管蛋白构建的鞭毛或纤毛。
现在需要进一步的功能研究来定义CBE1 / CBE1在肺上皮分化和纤西发生中的作用。
支持声明
作者获得了哮喘,过敏和炎症研究的支持(AAIR),希望慈善机构和罗杰布鲁克慈善信托。
感兴趣的语句
没有宣布。
致谢
作者要感谢r.m.鲍威尔用于设计和评估QPCR的引物和探针。
脚注
本文可以使用补充材料www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2008年10月17日。
- 接受2008年12月18日。
- ©ers Journals Ltd