文摘
气道上皮细胞的纤毛击败驱动器的粘液和粒子的航空公司。黏膜纤毛的运输和可能气道上皮发展由毒蕈碱的乙酰胆碱受体,但涉及的亚型的确切角色是未知的。
这个问题被解决通过确定cilia-driven粒子运输、纤毛拍频,成分和气管上皮细胞的超微结构形态学M1-M5毒蕈碱的受体gene-deficient老鼠。
淘汰赛的M3毒蕈碱的受体阻止增加粒子运输速度和纤毛拍频,以应对毒蝇碱。此外,ATP响应应用毒蝇碱后钝化。预处理前与阿托品应用毒蝇碱恢复的响应ATP。额外的M2受体敲除在这些小鼠部分恢复了毒蝇碱效果,最有可能通过M1受体,正常化ATP响应。缺少M1、M4、M5受体的老鼠们注入了对毒蝇碱表现出正常的反应。调查变异老鼠菌株都没有任何障碍的上皮细胞结构或组成。
总之,M3受体刺激而M2受体抑制cilia-driven粒子运输。M1受体增加cilia-driven粒子运输如果M3和M2受体是失踪。没有一个受体为上皮发展是必要的。
黏膜纤毛的清除是一个航空公司的主要防御机制对吸入微生物和有害微粒。协调推动粘液纤毛细胞和颗粒的殴打他们的纤毛。乙酰胆碱(ACh)众所周知,增加睫毛的拍频(CBF)1,2普遍认为,增加黏膜纤毛的运输。空调采暖的主要发射机副交感神经纤维在航空公司,但也可以释放的支气管上皮细胞和细胞免疫系统3,4。它施加ciliostimulatory效果通过毒蕈碱的受体(夫人)1,5。
5亚型先生(M1-M5R)发现了分子克隆6。激活每个亚型可能导致不同的生理影响特定分布格局的基础上这些受体和信号级联有关6- - - - - -8。
在小鼠、猪和人类肺,至少有三个亚型先生M1R, M2R M3R,表达9- - - - - -12。药理研究表明,M1R和M3R亚型参与CBF的规定1,5。然而,结论来自实验使用药理抑制剂是有限的,而这些代理的小程度的亚型选择性先生8。
在目前的研究中,老鼠菌株的基因中断M1R, M2R, M3R, M4R M5R基因8为了评估每个人的角色,在调节表面粒子气管上皮和CBF运输。当前作者还研究了缺先生ATP信号的影响,因为ATP是一个重要的上皮中介调节CBF和内生释放时气道上皮细胞13,14。自从夫人也被隐含在调节扩散,有可能,气道上皮细胞的分化4,15,上皮细胞类型成分和细胞超微结构也决定,为了阐明是否缺乏特定亚型先生与特定的组织学变化,可能会传播到受损的黏膜纤毛的运输。
材料和方法
动物
M1R的生成- / -,M2R- / -,M3R- / -,M4R- / -,M5R- / -和M2/3R- / -老鼠被描述16- - - - - -21。
的M1R- / -和M3R- / -和相应的野生型小鼠(WT)小鼠被用于研究相对细胞频率有以下遗传背景:129年svev (50%)×CF1 (50%)。的M2R- / -老鼠和相应的WT (M2R老鼠+ / +老鼠)有一个稍微不同的遗传背景20.:129 j - 1 (50%)×CF1 (50%)。的功能研究和测定刷和神经内分泌细胞的数量,使用基因敲除小鼠,backcrossed≥10代到C57BL / 6 ntac背景。C57BL / 6小鼠ntac被用作WT控制。动物缺乏M2R和M3R亚型(M2/3R- / -)和控制老鼠(M2/3R+ / +)和一个等价的遗传背景(129 j - 1 (25%)×129 svev (25%)×CF1(50%))生成如前所述21。成年老鼠的两性≥8周大被用于所有实验。所有老鼠之前指定的无菌条件下实验。所有的实验都是按照德国动物保护法律。
实时rt - pcr
WT的导管的上皮细胞,M1R- / -,M3R- / -和M2/3R- / -老鼠在每组(n = 5)磨损使用棉签仔细翻滚的上皮细胞层,和总RNA被孤立使用RNeasy方法根据制造商的协议(试剂盒、希尔登,德国)。使用1 U DNase-I污染DNA降解(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国)每μg总RNA,和反转录是50分钟42°C使用200 U上标2每μg RNA逆转录酶(表达载体)。
实时定量PCR进行在一个I-Cycler (Bio-Rad,慕尼黑,德国)使用QuantiTec SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒)。底漆设置为不同的亚型先生和管家基因β2-microglobulin(β2-MG)补充表3给出了在线(见补充材料)。PCR条件包括初始变性10分钟在95°C紧随其后40周期的20年代在95°C, 20年代62°C和20年代在72°C。所有分析都是一式三份。量化,计算平均周期阈值(CT)和相应的目标基因的CT值减去从意味着β2-MG-CT根据以下:
ΔCT = CT目标基因- - - - - - CTβ2-MG(1)
目标mRNA的表达的差异两个鼠标菌株之间的计算如下:
ΔΔCT =ΔCT目标基因,应变——ΔCT目标基因,病毒b(2)
PCR电泳分析的产品Tris-acetate-EDTA 2%琼脂糖凝胶。
评价上皮成分和形态,M2R免疫组织化学
电子显微镜和决心的细胞数量,M1R- / -,M2R- / -,M3R- / -和各自的WT老鼠每组(n = 5)被过量的异氟烷和灌注固定使用的解决方案包含2.5%的聚乙烯吡咯烷酮(σ,Schnelldorf,德国)和0.5%盐酸普鲁卡因胺(σ)22移除血液,紧随其后的是包含100毫升1.5% glutardialdehyde和2%多聚甲醛固定剂在0.1磷酸盐缓冲剂(PB), pH值7.4。气管被免职,解剖喉、胸1 h和存储一部分固定剂。然后组织染色在块使用OsO4和铀酰乙酸脱水,增加酒精浓度和嵌入在环氧树脂(σ)。Semithin部分(1µm)整个气管的横截面是减少使用Ultracut E超微切片机(德国徕卡,Bensheim)安装在玻璃幻灯片,沾Rudeberg污点和盖玻片Eukitt(丙烯酰胺、书、德国)。
量化的相对数量的上皮细胞,部分被认为使用亮视场显微镜(奥林巴斯BX60;奥林巴斯,德国汉堡)配备一个60×油浸物镜。上皮细胞分为三个区域,根据其基本组织:软骨,气管肌肉和韧带。对于每一个地区,200个细胞检查(细胞数如果细胞核可见)和纤毛的部分,nonciliated和基底细胞被确定。
从相同的标本,超薄部分与柠檬酸铅剪切和复染色。他们评估上皮细胞形态变化使用透射电子显微镜(EM 906;狮子座,Worrstadt,德国)。
以确定缺乏毒蕈碱的受体影响刷细胞或神经内分泌细胞的数量,M1R- / -,M2R- / -,M3R- / -和WT老鼠每组(n = 5)灌注固定所述,使用4%的多聚甲醛0.1 PB作为固定剂。气管被移除,解剖喉和胸,水洗,cryoprotected与18%蔗糖,面向允许切割的横截面,在液态氮冷冻。10μm厚冻结的部分被剪掉了,孵化使用兔多克隆抗体蛋白基因产物(PGP) 9.5 (1:10,000;Biotrend,德国科隆)标签对villin神经内分泌细胞或兔多克隆抗体23污渍刷细胞。Cy3-conjugated驴anti-rabbit免疫球蛋白(Ig)抗体(Dianova,汉堡,德国)是用于检测。幻灯片是清洗和使用carbonate-buffered甘油盖玻片,pH值8.6,和评估使用BX60显微镜数字化模式Cy3一组适当的过滤器。从五个横截面/动物/气管地区的数量PGP-immunoreactive villin-immunoreactive细胞数和正常化的平均直径颈椎和胸椎WT动物的一部分。
免疫组织化学M2R,老鼠从WT和M2R气管- / -动物解剖、休克冻结融化异戊烷和削减10µm厚度。部分在Zamboni的固定剂固定为30分钟24然后反复洗0.1 PB。部分覆盖了1 h和PBS含有10%正常驴血清,0.1%的牛血清白蛋白和0.5%的渐变,其次是孵化与兔子anti-M2R抗体(1:50 0;Chemicon芸香料灌木、澳大利亚)。所涵盖的部分被洗在PBS和1 h和Cy3-conjugated驴anti-rabbit Ig抗体(1:1000;美国杰克逊,巴尔的摩,马里兰州)。对于multiple-labelling免疫荧光实验,一夜之间,部分被孵化的M2R与单克隆抗体结合荧光素isothiocyanate-labelled鼠标anti-α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)抗体(1:400;克隆1 a4;σ,城堡山,澳大利亚)和一些实验用老鼠anti-CD31抗体(1:50 0;克隆MEC 13.3;BD Pharmingen、北方莱德、澳大利亚),清洗和覆盖着Cy3-conjugated驴anti-rabbit IgG抗体,如果适用,Cy5-conjugated驴anti-rat免疫球蛋白(1:25; Jackson). After incubation with the secondary reagents, the slides were washed in PBS and coverslipped in carbonate-buffered glycerol at pH 8.6. The slides were evaluated by sequential scanning using a confocal laser scanning microscope (TCS SP5; Leica).
测量粒子的传输速度
老鼠被吸入异氟烷的(巴克斯特,Unterschleissheim,德国)。胸腔打开,颌下腺和infrahyoid肌肉被移除。气管切尾喉和颅分叉。气管被删除并转移到δT培养皿(美国Bioptechs,巴特勒,PA)的玻璃底部覆盖着一层薄薄的Sylgard聚合物(道康宁、威斯巴登、德国),充满了2毫升冷羟乙基哌嗪乙磺酸(玫瑰)振铃器解决方案。周围的结缔组织被移除,气管与肌肉trachealis面临向上和面向固定有两个昆虫针。使用Vannas-Tubingen m . trachealis被割开春剪刀(置,海德堡,德国)。准备与HEPES-Ringer轻轻冲洗溶液除去粘液随后交换1.5毫升新鲜温暖的缓冲区淹没气管。培养皿被转移到δT阶段持有人30 - 40分钟后动物的死亡和保持不变在30°C。直到视觉成像系统成像进行了(直到光子学、Grafelfing、德国)基于BX50 WI fixed-stage显微镜(奥林巴斯)配备一个成虫CCD相机1280×960像素(直到光子)。
在测量之前,∼500000聚苯乙烯珠直径4.5µm (Dynabeads;德国汉堡Dynal生物技术GmbH)被添加到缓冲溶液。气管上皮表面成像在brightfield模式使用一个UMPLFL20×0.50 W /水浸客观(奥林巴斯)。毒蝇碱(10−4M;σ)、ATP (10−4M;σ)和阿托品(10−6M;σ)被添加到菜和被温柔的移液分散。聚苯乙烯珠很容易被他们的褐色的颜色。为成像面积两个软骨之间的选择,为了防止图像亮度之间存在较大的差异。对于每一个时间点,200张图片(640×480像素,2×2面元,12位)的曝光时间拍摄20 ms的帧率11.76图像·s−1。
确定跟踪和单个粒子的速度,以下执行图像处理:图像中不移动的物体被减去平均200个人的形象系列的形象从每个系列的图片像素的基础上。如果减法的价值有负面,绝对值。通过这个过程,以前的形象深Dynabeads变得明亮。本系列的一个副本被更改为一个二进制图像阈值的过程,以便Dynabeads将光明和黑暗背景被设定。最初的电影从12位减少到8位灰度和系列都是用来跟踪Dynabeads通过一个自动跟踪过程使用TILLvisTRAC软件(直到光子)。只跟踪测量的长度≥10帧包含在进一步的计算。
CBF测量
测量CBF的气管是准备用于测量所述粒子传输速度(PTS)和使用显微镜设置相同。面积的气管表面成像UMPLFL40×0.8 W /水浸客观(奥林巴斯)和成像进行高速EHDcmos1.3摄影机(EHD成像GmbH, Damme,德国)。
总共1000张图片(640×480像素)105年拍摄的帧速率图像·s−1。计算CBF,小区域的平均灰度值纤毛细胞确定时间序列中的每个图像。在每个成像系列,10纤毛细胞进行评估。CBF是由解决主导频率通过快速傅里叶变换使用AutoSignal 1.7(美国马Seasolve,弗雷明汉)。相同大小的控制,在nonciliated细胞检查。没有出现在这些主导频率控制实验。
统计分析
比较两个实验条件及其控制,所有组克鲁斯卡尔-沃利斯的实验进行对比测试。如果由此产生的假定值< 0.05,淘汰赛组与WT组使用Mann-Whitney测试。比较被评为显著p < 0.05。
如果跨度为一组进行,所有的跨度为被弗里德曼测试相比。如果由此产生的假定值< 0.05,对比跨度为使用Wilcoxon执行测试。比较被评为显著p < 0.05。
结果
在气管上皮细胞的表达亚型先生
确定先生用气管上皮细胞表达亚型,擦伤气管上皮WT小鼠M1-M5R mRNA的表达进行了分析。M1R M3R信使rna是容易识别(平均ΔCT M1R 7.73,意味着ΔCT M3R 6.49,相比之下,β2-MG mRNA)但是对于M2R不是信使rna编码。虽然PCR产品M4R和M5R检测,可靠的量化的表达水平太低(意味着M5RΔCT M4R 13.82, 12.95,非特异性PCR产品在ΔCT M2R rt - PCR循环达到阈值12.61)。
免疫组织化学证实缺乏M2R鼠标气管上皮细胞蛋白质水平(图1 a - c⇓)。M2R免疫反应性气管气道上皮细胞中没有检测到,而在气管平滑肌抗体容易发现M2R双标签所示d-fα-SMA抗体(图。1⇓)。免疫反应性M2R被发现在神经纤维周围动脉但没有发现上皮细胞中的神经纤维或底层的固有层(图。1⇓)。M2R的免疫反应性这些结构是特殊的,因为它没有从M2R部分- / -老鼠。染色pericyte-like细胞在固有层包围CD31-immunoreactive微血管内皮细胞特异性的根据是其在从M2R部分- / -动物(图S1补充材料)。
毒蕈碱的受体M2R表达式气管的野生动物。一)M2R和b) CD31免疫组织化学和c)合并。两者没有M2R免疫反应性是存在于上皮细胞(e),标签与形态类似的周(箭头),包围CD31-immunoreactive内皮细胞,非特异性M2R根据它的存在- / -老鼠(参阅图S1补充材料)。d) M2R和e)α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)免疫组织化学和f)合并。d−f)双标记免疫组织化学显示M2R的存在免疫反应性的膜α-SMA-positive气道平滑肌细胞(m)和神经纤维支气管动脉(虚线箭头)。α-SMA-positive血管平滑肌(箭头)和气道上皮细胞(e)没有M2R免疫反应性。酒吧= 50µm规模。
与WT老鼠相比,M1R- / -老鼠表现出减少M3R mRNA表达(ΔΔCT = 1.01, p = 0.016)。在M3R- / -发现老鼠,减少数量的M1R mRNA(ΔΔCT = 2.37, p = 0.008)。在M2/3R- / -老鼠,没有统计上显著的mRNA的表达变化M1R被发现(ΔΔCT = 1.47, p = 0.095)。表达M5R和M4R mRNA在所有检查脱模线保持在低位。
分在WT MR-deficient老鼠
毒蝇碱(10 WT老鼠−4米)诱导的增加意味着±扫描电镜分从43.5±2.7µm·s−1前应用毒蝇碱92.0±7.0µm·s−18分钟后药品管理局(p = 0.002;图2一个⇓)。随后的刺激与ATP (10−4米)导致分101.3±6.7µm·s−13分钟后应用程序(图。2⇓1)和补充电影。这进一步增加并不显著(p = 0.071)。在M3R- / -老鼠,基底分降低PTS和毒蝇碱没有影响(p = 0.81;图2一个⇓)。ATP M3R分增加- / -小鼠(p = 0.002),但分明显低于WT老鼠(49.0±8.0与101.3±6.7µm·s−1在WT;图2一个⇓并在M1R补充电影2)。- / -老鼠,毒蝇碱导致的增加从42.0±4.1,106.6±5.7分µm·s−1(p = 0.02;8分钟后)这不是统计不同于观察WT动物。额外的应用ATP导致分107.1±6.0µm·s−1(不是统计学意义与毒蝇碱:p = 0.75),没有明显不同于ATP-stimulated分在WT动物。
粒子传输速度(PTS)和纤毛拍频(CBF)的响应与毒蝇碱和ATP刺激气管从野生型(WT;黑色),M1R- / -(绿色),M2R- / -(红色)和M3R- / -(蓝色)老鼠。WT)分气管,M1R- / -,M2R- / -和M3R- / -老鼠毒蝇碱和ATP。b)相对分,下半场值设置为0来纠正基线差异。数据显示为±扫描电镜M1R, n = 6- / -和M2R- / -老鼠和WT和M3R n = 12- / -老鼠。c) CBF校正基线差异从WT(如上所述)颜色显示,M1R- / -,M2R- / -,M3R- / -老鼠和叠加图上的相对分(灰色)。数据显示为±扫描电镜每组40从四个动物细胞。统计分析组的差异(a和b)和CBF测量(c)在不同时期进行如下。#:实验的开始;¶:立即增加毒蝇碱;+:8分钟后添加毒蝇碱;§:3分钟后增加ATP。统计分析各组由克鲁斯卡尔-沃利斯检验Mann-Whitney测试紧随其后。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
在M2R- / -老鼠,除了毒蝇碱增加分的方式与在WT(111.9±11.1µm·s−1;p = 0.15)。与WT M1R- / -老鼠,分进一步增加了增加ATP(126.8±10.7µm·s−1;p = 0.02;图2一个⇑)。
评估是否绝对速度的差异是由于不同的基底速度,下半场的价值时间点是减去从每个曲线从所有其他的跨度为曲线(图2 b⇑)。使用这种方法,在M3R分- / -后小鼠毒蝇碱的应用ATP紧随其后仍在统计上低于其他三个检查鼠标菌株(p = 0.006)。此外,毒蝇碱的相对分后应用程序并在M2R ATP- / -老鼠与WT老鼠相比显著(p = 0.01)。
降低PTS恰逢M3R CBF减少- / -老鼠
实验的CBF决心开始时,立即添加毒蝇碱之前,添加毒蝇碱后8分钟,3分钟后增加ATP。这些跨度为对应的跨度为选择的统计比较分在以前的实验。在前15分钟,CBF减少在M1R WT以及- / -,M2R- / -和M3R- / -为每个应变观察小鼠(p < 0.001)。
引人注目的是,毒蝇碱未能诱导意味着在M3R CBF的增加- / -老鼠和CBF甚至减少(平均±扫描电镜7.70±0.46与7.40±0.75赫兹;p = 0.049)。相比之下,WT (11.90±0.63与20.83±0.80赫兹;M1R p < 0.001)- / -(9.80±0.36与19.80±0.67赫兹;p < 0.001)和M2R- / -(7.78±0.40与19.63±0.88赫兹)小鼠对毒蝇碱与CBF的增加。
ATP诱发进一步,统计上显著的增加在所有菌株CBF检查(p < 0.001)。ATP-induced增加CBF M3R大大缩小- / -比M1R(17.78±1.28赫兹)- / -(22.10±0.76赫兹),M2R- / -(23.9±0.77赫兹)和WT老鼠(29.9±0.77赫兹)。综上所述,这些数据表明缺乏CBF的增加可以解释缺乏M3R增加分- / -老鼠毒蝇碱应用程序后,可以部分解释ATP的分在额外的应用程序。
比较CBF的变化与分CBF相对增加的变化计算的值减去下半场各时间点和叠加数据曲线如图2 b所示⇑(图2摄氏度⇑)。CBF的变化与变化分虽然他们不能解释所有的差异分(如。分的变化与CBF应用ATP)后,表明存在其他机制影响分。
M4R和M5R分的角色
无论是M4R- / -也不是M5R- / -老鼠从WT老鼠分显著不同,其应对毒蝇碱和ATP(图。3⇓)。
M4R- / -(红色)和M5R- / -(蓝色)小鼠没有不同于野生型小鼠(黑)的粒子传输速度(PTS)应对毒蝇碱和ATP。数据显示为±扫描电镜为每只动物组,n = 6。统计分析组的差异在不同时期进行如下。#:实验的开始;¶:立即增加毒蝇碱;+:8分钟后添加毒蝇碱;§:3分钟后增加ATP。统计分析是利用克鲁斯卡尔−沃利斯测试,显示没有在任何检查的跨度为统计上的显著差异。
上皮细胞的相对频率类型和形态不解释的差异分突变小鼠先生
由于纤毛细胞的相对频率的差异可以解释观察到的差异分,纤毛细胞的相对频率,在WT nonciliated细胞和基底细胞,M1R- / -,M2R- / -和M3R- / -老鼠量化喉和气管的胸部分(图S2补充材料)。前所述的老鼠,纤毛细胞的相对频率较低的上皮覆盖软骨与上覆韧带或m . trachealis领域25。因此,这些区域分别进行评估。如鼠,当前作者指出纤毛细胞的显著降低频率覆盖软骨(表S1的辅料)。先生在两部分,然而,缺乏导致不同的细胞类型组成(见图4⇓宫颈上皮的韧带的气管和表S1辅料的所有数据)。刷细胞和神经内分泌细胞的数量也由immunolabelling量化villin(图S3a-d补充材料)和PGP 9.5,分别(图S3e-h补充材料)。没有刷细胞数量差异被发现在任何领域研究(表S2的辅料)。颈神经内分泌细胞显著更多的而不是胸M1R气管的一部分- / -老鼠与WT老鼠相比(表S3的辅料)。调查是否超微结构的形态学变化占观察到的差异分,气管上皮细胞是由电子显微镜检查。先生没有发现显著差异在WT和突变小鼠的一般结构上皮细胞,纤毛上皮细胞或亚细胞形态学的纤毛特别是(图5所示⇓)。形态学的研究结果表明,无论是数量还是纤毛细胞的亚细胞结构改变导致观察到的差异分。
![图4 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/33/5/1113/F4.medium.gif)
纤毛的相对频率(▒)nonciliated(□)和基底(░)细胞在野生型(WT)没有改变,M1R- / -,M2R- / -和M3R- / -小鼠颈韧带的气管。数据显示为±扫描电镜为每个组,n = 5的动物。统计分析是由克鲁斯卡尔-沃利斯检验,无显著差别。完整的数据请参考表S1的补充材料。
![图5 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/33/5/1113/F5.medium.gif)
气管上皮细胞超微结构的形态学的a和b)野生型,c和d) M1R- / -M2R, e和f)- / -和g和h) M3R- / -老鼠。a、c、e和g)纤毛细胞的概述。b, d, f和h)纤毛。a、c、e, g)规模酒吧= 1µm;b, d, f和h) = 0.05µm规模酒吧。
阿托品预处理救援响应降低M3R ATP- / -老鼠
自从M2R- / -老鼠表现出一个增强的PTS对ATP的回应,这是假设激活ATP之前M2R刺激可能在M3R占了ATP响应- / -老鼠。如果这是这样,封锁所有夫人的阿托品应该救助M3R ATP的效果- / -老鼠。与阿托品预处理(10−6米)完全封锁了应对毒蝇碱WT老鼠(图。6⇓)。在M3R- / -老鼠,与阿托品预处理恢复了ATP响应,表明激活M2R负责对ATP缺乏M3R钝化反应。
阿托品防止钝化粒子传输速度(PTS)反应后ATP M3R毒蝇碱的应用- / -老鼠。分的反应M3R- / -小鼠与野生型小鼠相比(蓝色)(黑色)。数据显示为±扫描电镜为每只动物组,n = 6。统计分析组的差异在不同时期进行如下。#:实验的开始;¶:立即增加阿托品;+:立即增加毒蝇碱;§:8分钟后添加毒蝇碱;ƒ:3分钟后增加ATP。统计分析是由克鲁斯卡尔-沃利斯检验Mann-Whitney测试紧随其后。
额外M2R缺乏救援分在M3R增加ATP后- / -老鼠
验证M3R M2R的抑制作用- / -老鼠,老鼠缺乏M2R和M3R亚型(M2/3R- / -)及其相应的WT老鼠(M2/3R+ / +)评估的不同分。符合假设M2R负责M3R慢点- / -老鼠,M2/3R ATP-induced分- / -老鼠是区别在WT老鼠(图7所示⇓)。毒蝇碱的反应是部分恢复(62.3±5.3与104.3±7.5µm·s−1在WT;图7⇓),这表明失活的M2R不仅恢复ATP的响应还揭露刺激影响其他夫人M1R(很可能)。
M2/3R- / -老鼠(绿色)响应毒蝇碱和显示正常的ATP反应对粒子传输速度(PTS)与相应的野生型小鼠(M2/3R相比+ / +;黑色)。数据显示为±扫描电镜为每只动物组,n = 6。统计分析组的差异在不同时期进行如下。#:实验的开始;¶:立即增加毒蝇碱;+:8分钟后添加毒蝇碱;§:3分钟后增加ATP。统计分析是由克鲁斯卡尔-沃利斯检验Mann-Whitney测试紧随其后。* *:p < 0.01。
讨论
六种不同的基因敲除菌株被用来阐明亚型先生的角色在气管上皮运输的粒子。亚型M1R, M2R M3R,但不是M4R M5R,充分参与粒子的规定运输。
当前作者决定这些受体的功能使用敏锐地删除和水下小鼠气管和关注分以下原因。气管包含不同的组件,如神经纤维和/或细胞的免疫系统,这可能会影响纤毛细胞的功能在活的有机体内但会在长期文化或丢失或不存在孤立的细胞模型。此外,由于上皮形态和成分的变化以及其他因素影响cilia-driven粒子运输不能排除,确定CBF独自跑忽略其他因素可能影响的风险没有削弱CBF cilia-driven运输。
目前的结果表明,这三个亚型先生参与的规定分(M1R-M3R)施加他们的行为通过不同的机制。M3R不足导致的全损muscarine-induced PTS的增加。这是由于总缺乏CBF的增加,所显示典型的药理研究养殖绵羊的气管和食管上皮蛙1,5。M3R敲除分和CBF的影响并不局限于毒蝇碱也导致钝化反应与毒蝇碱ATP后如果有刺激。这种效果是由于M2R激活,将讨论。
淘汰赛M2R导致小毒蝇碱和增加ATP,表明M2R,激活时,可以表现出抑制作用。自增长温和与WT老鼠相比,M2R不似乎是一个主要的监管机构在正常情况下,这也解释了为什么这个受体不是以前被视为重要的规定cilia-driven运输。然而,目前的数据表明,该M2R可以明显的抑制作用,如果M3R不是功能。在M3R- / -老鼠,毒蝇碱逆转的影响从刺激到抑制,导致钝化反应ATP如果毒蝇碱后应用。这毒蝇碱的抑制作用是阻止通过与阿托品pre-incubation,表明它确实是由一个先生,这种抑制性受体M2R表示,额外的淘汰赛M3R M2R的- / -老鼠也会逆转M3R毒蝇碱的抑制效果- / -在M2/3R兴奋性- / -和恢复充分反应ATP。释放乙酰胆碱和激活M2R在切除气管也可以解释在M3R基底率降低- / -老鼠,尽管这不是一个M3R一致的特性- / -老鼠(图。6⇑)。
因为无论是M2R mRNA还是M2R蛋白质被发现在上皮细胞,观察到M2R-mediated效应最有可能不是造成的上皮M2R但必须由其他细胞窝藏M2R。一般来说,细胞分布的识别是夫人夫人受到抗体的质量差26。即使在当前的研究中使用的抗体,它可靠地检测到M2R在平滑肌细胞和神经纤维和一些没有标签在M2R这些结构- / -老鼠,交叉反应性与一个不相关的蛋白质的周经验。尽管在一些细胞,这种抗体可以检测M2R当前作者不能确保所有细胞类型的抗体检测M2Rs表达了这种蛋白质的气管。肺成纤维细胞表达功能M2R至少在细胞培养条件下27,28。由于成纤维细胞被发现接近在气道上皮细胞,有可能他们会影响纤毛细胞。然而,精确的细胞类型(s)通过M2R施加对上皮细胞的抑制作用仍有待确定。
M1R mRNA表达在气道上皮细胞根据实时rt - pcr。然而,在M1R- / -老鼠,关于分毒蝇碱的反应性与WT老鼠CBF并没有不同。这表明M3R的存在是充分完整的反应性毒蝇碱,M1R是没有能力保护部分反应在M3R毒蝇碱- / -老鼠。因为减少M1R mRNA也是M3R中发现- / -老鼠,有可能降低M1R受体表达导致这种效果。如果抑制M2R删除除了M3R M2/3R- / -老鼠,增加分后应用毒蝇碱可被检测到。
夫人一直以来参与调节气道上皮细胞的增殖和分化4,当前作者预期形态的变化和/或相对细胞上皮细胞的数量。然而,他们发现无论是纤毛的数量差异,nonciliated、基底和刷细胞也在这些细胞的形态学WT和各种突变小鼠先生。只有一个在M1R发现神经内分泌细胞的数量增加- / -老鼠,仅限于颈部气管的一部分。
尽管M1R观察到的功能差异- / -,M2R- / -和M3R- / -先生的老鼠,没有深刻的一般作用缺乏形态学和细胞成分的气管上皮被检测到。这说明,这些受体是没有必要的适当的上皮细胞的发展。
虽然有老鼠记住,来自实验结果并不一定适用于人类,目前数据显示,功能性M1R节约部分粒子运输速度对乙酰胆碱和ATP激活M2R可以减少反应。自M2R M3R调解在小鼠支气管收缩21,有选择性的针对M2R和M3R也可能足以抵销胆碱能在人类支气管收缩。阻塞M3R M2R和爱惜M1R不会妥协抗胆碱能支气管扩张剂效率,可以减少负面影响cilia-driven粒子运输。目前的结果还表明,毒蕈碱的受体在气道上皮细胞的形成是可有可无的。
支持声明
抗议克莱因收到奖学金从德意志Pneumologische公司协会(Werne,德国)。p·康尼锡接到医学部门的年轻科学家格兰特的Justus-Liebig-Universitat吉森(德国吉森)和大学的医学院的资助吕贝克(没有。a31 - 2007;德国吕贝克)。这项研究是支持的德意志Forschungsgemeinschaft卓越集群心肺系统(德国波恩)。
感兴趣的语句
一份声明中可以找到感兴趣的w . Kummer领军www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl
确认
关系如下。克莱恩表示抗议,p .哈特曼p . Faulhammer K.S.嘴唇和w . Kummer领军:Anatomie Zellbiologie和吉森大学和研究所肺中心Justus-Liebig-Universitat吉森,吉森,德国。随机变数Haberberger:毛皮Anatomie和Zellbiologie研究所和大学吉森肺中心,Justus-Liebig-Universitat吉森,解剖学和组织学,弗林德斯大学、澳大利亚阿德莱德,SA。b . Krain:毛皮Anatomie和Zellbiologie研究所和大学吉森肺中心,和Abteilung皮毛Anaesthesie,手术Intensivmedizin, Schmerztherapie Justus-Liebig-Universitat吉森。j·韦斯:有机化学实验室,国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的贝塞斯达,医学博士,美国。p·康尼锡:毛皮Anatomie研究所、中心的皮毛和Zellbiologie Medizinische合写,吕贝克大学吕贝克,和毛皮Anatomie研究所和Zellbiologie吉森大学肺中心Justus-Liebig-Universitat吉森,吉森,德国。
作者感谢d Drenckhahn (Julius-Maximilians-Universitat维尔茨堡,维尔茨堡,德国)的礼物villin抗体和美国Wiegand (Justus-Liebig-Universitat吉森、吉森、德国)动物育种专家。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2008年1月31日。
- 接受2008年12月1日。
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